CC BY
40
оценка токсикологических свойств доцетаксела в составе фолатмодифицированных полимерных частиц в эксперименте in vivo
A.A. крашенинникова1, 2, в.в. Заварзина1, д.С. Панова1, н.в. Гукасова1, С.л. кузнецов1, и.А. тубашева1, в.Ю. Балабаньян3, Ю.и. Полтавец1
1ФГБУ«Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Россия, 123182 Москва,
пл. Академика Курчатова, 1; 2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; Россия, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8; 3ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1
Введение. Использование субмикронных векторизованных систем доставки, которые способствуют повышению избирательности действия и уменьшению побочного токсического влияния химиотерапии, — один из перспективных подходов к созданию противоопухолевых химиопрепаратов. Разработана система доставки доцетаксела (ДОЦ) в составе полилактидгликолид-ных частиц (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), модифицированных додециламидом фолиевой кислоты (ДФК) (частицы PLGA-
Цель исследования — сравнительное токсикологическое исследование ДОЦ в форме частиц и в стандартной форме в остром и субхроническом экспериментах на мышах при внутривенном введении.
Материалы и методы. Исследование проведено на мышах-самках линии C57BL/6. При изучении острой токсичности препараты вводили в диапазоне доз 20, 60, 90, 120, 160 мг/кг. На протяжении 30 дней оценивали летальность, определяли массу тела, проводили патоморфологические исследования. Для изучения токсичности в условиях субхронического эксперимента препараты вводили ежедневно в течение 3 дней в разовых дозах 11 и 22 мг/кг и далее в течение 30 дней проводили необходимые исследования.
Результаты. При 1-кратном введении PLGA-ДОЦ-ДФК в дозах 20, 60, 90 мг/кг гибели животных не наблюдалось; в дозах 120 и 160 мг/кг выявлена гибель животных на 1-4-е сутки. В случае применения субстанции ДОЦ гибель животных наступала в течение суток после введения доз 60, 90, 120, 160 мг/кг. Картина интоксикации была сходной для сравниваемых препаратов и проявлялась в гиподинамии, нарушении координации движений, парезе задних конечностей, но степень их проявления была более выраженной в группах с введением ДОЦ, чем в случае введения PLGA-ДОЦ-ДФК. Было установлено, что средняя летальная доза (ЛД50) для PLGA-ДОЦ-ДФК составляет 140 мг/кг, а для субстанции ДОЦ — 112 мг/кг. При субхроническом введении выявленные токсические свойства препаратов зависят от величины примененной дозы. Введение PLGA-ДОЦ-ДФК в разовой дозе 22 мг/кг вызывало летальные эффекты (2/10), обратимую задержку прироста массы и лейкопению у выживших животных, увеличение относительной массы селезенки. Применение PLGA-ДОЦ-ДФК в разовой дозе 11 мг/кг гибели не вызывало, хорошо переносилось и характеризовалось сходной токсичностью с субстанцией ДОЦ. Заключение. На основании экспериментальных данных определены уровни токсических доз PLGA-ДОЦ-ДФК при остром и субхроническом введении. Полученные результаты позволили рекомендовать препарат для дальнейшего изучения.
Ключевые слова: доцетаксел, фолатмодифицированные полимерные частицы, токсичность, мыши
Для цитирования: Крашенинникова А.А., Заварзина В.В., Панова Д.С. и др. Оценка токсикологических свойств доцетаксела в составе фолатмодифицированных полимерных частиц в эксперименте in vivo. Российский биотерапевтический журнал
ASSESSMENT oF THE TOXITOLoGICAL PRoPERTIES of DoCETAXEL LoADED
folate-modified polymer particles in vivo
A .A. Krasheninnikova1,2, V V Zavarzina1, D.S. Panova1, N. V Gukasova1, S. L. Kuznetsov', I. A. Tubasheva1,
VYu. Balabanyan3, Yu. I. Poltavets1
National Research Center "Kurchatov Institute"; 1 Akademika Kurchatova ploshchad', Moscow 123182, Russia; 2Institute of General Pathology and Pathophysiology; 8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russia; 3M.V. Lomonosov Moscow State University; 1 Leninskie Gory, Moscow 119991, Russia
Контакты: Анна Андреевна Крашенинникова a.a.krasheninnikova@yandex.ru
ДОЦ-ДФК).
2020;19(2):55-64.
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-19-2-55-64
(ее)
Introduction. One of the perspective approaches to the development of anticancer chemotherapy drugs is the use of submicron vectorized delivery systems that increase the selectivity of action and reduce the toxic side effects of chemotherapy. A delivery system of docetaxel (DOC) loaded poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) particles modified with folic acid dodecylamide (FAD) was developed (PLGA-DOC-FAD). The aim of the research was a comparative toxicological study of DOC-loaded particles and standard docetaxel solution form in acute and subchronic experiments in mice after intravenous administration.
Materials and methods. The research was conducted in female C57BL/6 mice. During the study of acute toxicity, drugs were administered in the following dose range: 20, 60, 90, 120, 160 mg/kg. Over 30 days, mortality and body weight were evaluated, pathomorphological studies were performed. The study of toxicity in conditions of subchronic administration of medicine was conducted using three times daily administration in single doses of 11 and 22 mg/kg. Subchronic toxicity of the drugs was studied with three times daily administration in single doses of 11 and 22 mg/kg. The necessary studies were performed within 30 days.
Results. With a single injection of PLGA-DOC-FAD in doses of20, 60, 90 mg/kg, the death of animals wasn't observed; at doses of 120 and 160 mg/kg, the death of animals was detected in 1—4 days. In the case of administration of the DOC substance, the death of animals occurred within a day after the administration of doses of60, 90,120,160 mg/kg. The pattern of intoxication was similar in case of compared drugs and manifested in hypodynamia, impaired movement coordination, hind limbs paresis, though the manifestation degree thereof was more expressed in the groups with the introduction of DOC than in the case of the introduction of PLGA-DOC-FAD. It was detected that the LD00 for PLGA-DOC-FAD is 140 mg/kg, and for the DOC substance — 112 mg/kg. In case of subchronic administration, the detected toxic properties of drug depend on the size of the dose applied. The administration of a single dose of 22 mg/kg of PLGA-DOC-FAD caused lethal effects (2/10), reversible delay in weight gain and leucopenia in surviving animals, and an increase in the relative mass of the spleen. The use of PLGA-DOC-FAD in a single dose of 11 mg/kg didn't cause death, was well tolerated and characterized by similar toxicity with the docetaxel substance.
Conclusion. Based on experimental data, the toxic dose levels of PLGA-DOC-FAD were determined under acute and subchronic administration. The results obtained allowed us to recommend PLGA-DOC-FAD for further examination.
Key words: docetaxel, folate-modified polymer particles, toxicity, mice
For citation: Krasheninnikova A.A., Zavarzina V.V., Panova D.S. et al. Assessment of the toxicological properties of docetaxel loaded folate-modified polymer particles in vivo. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2020;19(2):55—64. (In Russ.).
Введение
Применение субмикронных систем доставки противоопухолевых препаратов — один из перспективных подходов к повышению эффективности химиотерапии злокачественных новообразований [1, 2]. Вариантом данного направления является создание векторизованных систем доставки лекарств, обладающих селективностью в отношении опухолевой ткани. При разработке таких систем в качестве векторных молекул часто применяют малые биомолекулы, в том числе фолиевую кислоту, рецепторы к которой высоко-экспрессированы на опухолевых клетках [3—5].
Доцетаксел (ДОЦ) — противоопухолевый препарат из группы таксанов, широко используемый в различных схемах лечения и комбинациях с другими препаратами при терапии рака молочной железы, желудка, легких, предстательной железы и т. д. [6]. Механизм его действия основан на инактивировании микротубулярного аппарата и нарушении фазы митоза в опухолевых клетках. Крайне актуальна проблема побочной токсичности ДОЦ. Препарат вызывает анемию, нейтропению, осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта, нейропатию, алергиче-ские реакции, что приводит к ограничению его терапевтического потенциала [7]. Таким образом, существует высокая потребность в улучшении токсикологического профиля препарата. В литературе есть сведения, касающиеся получения и изучения
свойств ДОЦ в составе различных систем доставки, применение которых способствует снижению токсичности препарата [8, 9]. В ряде работ об использовании таргетных систем доставки ДОЦ в виде полимерных частиц, конъюгированных с фолиевой кислотой, показано повышение избирательности противоопухолевого действия, что свидетельствует о перспективности данного подхода [10, 11]. Ранее авторами был предложен технологичный способ получения ДОЦ в составе полимерных частиц на основе сополимера молочной и гликолиевой кислот (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), модифицированных додециламидом фолиевой кислоты (ДФК) (частицы PLGA-ДОЦ-ДФК), и показаны высокая селективность и противоопухолевая активность в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток [12].
Цель настоящего исследования — сравнительное токсикологическое исследование ДОЦ в форме частиц PLGA-ДОЦ-ДФК, а также в стандартной форме в остром и субхроническом экспериментах на мышах при внутривенном введении.
Материалы и методы
Получение и характеристика фолатмодифициро-ванных полимерных частиц с доц. Получение частиц осуществляли методом прямых эмульсий [12, 13]. Для этого смешивали водную фазу (раствор поливинилового спирта) и неводную фазу, представляющую
Оригинальные статьи 57
собой раствор 3 компонентов в дихлорметане: поли- физиологической, психологической и пищевой адап-мерный компонент — сополимер молочной и глико- тации в течение 7 дней. Мыши содержались в стан-левой кислот PLGA 50/50 (PURASORB® PDLG 5004, дартных условиях, кормление и поение осуществлялось PURAC Biochemicals, Нидерланды), векторный ком- ad libitum, с соблюдением полноценного пищевого понент — ДФК и фармакологически активный ком- рациона. понент — ДОЦ. В качестве последнего использовали исследования in vivo. Для исследования острой фармацевтическую субстанцию ДОЦ тригидрат (Cilu- токсичности было сформировано 16 опытных групп pharmaceuticals, Китай, ФС 001293—001215). Объемное мышей по 6 особей в каждой группе. Исследование соотношение водной и неводной фаз составило 7 : 1. включало сравнительное изучение острой токсично-Далее с помощью ультразвукового гомогенизатора сти PLGA-ДОЦ-ДФК, PLGA-ДОЦ и субстанции получали эмульсию типа «масло в воде», из которой ДОЦ при 1-кратном внутривенном введении препа-удаляли дихлорметан путем испарения в атмосферу ратов. При выборе доз опирались на данные литера-с получением суспензии частиц. К суспензии добав- туры о летальных дозах (ЛД) для ДОЦ и препаратов ляли раствор хлорида натрия, замораживали и лиофи- на его основе [7, 15, 16]. Дозы для введения состави-лизировали в течение суток. Средний размер частиц ли: 20, 60, 90, 120 и 160 мг/кг. Препараты вводили PLGA-ДОЦ-ДФК, определенный методом динами- в боковую хвостовую вену мыши в объеме 0,4 мл. ческого светорассеяния (Zetasizer Nano ZS ZEN 3600, Токсическое действие препаратов оценивали по числу Malvern, Великобритания), составил 247,5 ± 2,8 нм. умерших животных, срокам их гибели, а также на ос-Содержание ДОЦ в частицах, определенное методом новании мониторирования общего состояния и по-высокоэффективной жидкостной хроматографии, ведения животных, клинической картины инток-составило 2,63 ± 0,08 %, эффективность включения сикации, динамики массы тела животных, данных ДОЦ в частицы — 90,2 ± 0,7 %. Частицы без вектор- патоморфологических изменений в тканях и внутрен-ного компонента PLGA-ДОЦ получали по аналогич- них органах, выявляемых при аутопсии павших и вы-ной методике, исключая стадию добавления ДФК. живших животных, эвтанизированных в конце экспе-Для проведения исследований лиофилизаты частиц римента (макроскопическая оценка). Наблюдение растворяли в воде для инъекций в концентрации за животными осуществлялось в течение 30 сут с мо-10 мг/мл по ДОЦ и далее разбавляли водой до нужной мента введения препаратов. Определены расчетные дозы, предназначенной для введения животным. токсические дозы ЛД10, ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД100 каж-Для приготовления суспензий частиц для после- дого препарата при 1-кратном внутривенном введении дующего введения животным использовали стерильную с применением метода Литчфилда—Уилкоксона [17]. воду для инъекций. В качестве препарата сравнения Изучение субхронической токсичности препара-применяли субстанцию ДОЦ, которую растворяли тов проводили при 3-кратном ежедневном внутри-в Твин 80 в концентрации 40 мг/мл, далее растворя- венном введении PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ ли в водно-этанольной смеси (13 % раствор этанола) в разовых максимально переносимых дозах (МПД) до концентрации 10 мг/мл и разбавляли физиологи- 22 и 11 мг/кг (1/2 МПД). За МПД была принята доза, ческим раствором до нужной дозы, предназначенной близкая к расчетной ЛД10 при 1-кратном введении для введения животным (схема растворения в соот- субстанции ДОЦ. В опытных группах животных ис-ветствии с инструкцией PRODUCT MONOGRAPH, пользовали по 8 мышей, в контрольной — 10. Препара-TAXOTERE® [7]). Для проведения исследований ты вводили в боковую хвостовую вену мыши в объеме на животных все суспензии и растворы вводимых 0,4 мл. Контрольным животным вводили внутривен-препаратов готовили ex tempore. но физиологический раствор. Токсическое действие Животные. Исследование проводилось в соответ- препаратов оценивали по летальности, оценке обще-ствии с правилами обращения с животными, приня- го состояния животных, клинической картины ин-тыми Европейской конвенцией по защите позвоночных токсикации в период введения и после его окончания, животных, используемых в научных целях, и стан- изменениям массы тела животных, гематологическим дартными протоколами доклинических исследований исследованиям (определение количества лейкоцитов [14]. Протокол эксперимента был одобрен биоэтиче- в крови). Результаты рассматривали в динамике в теской комиссией НИЦ «Курчатовский институт». чение 30 дней с 1-го дня курсового введения. На 30-е В эксперименте использовались мыши-самки линии сутки после окончания курса введений половину самок C57BL/6. Животные были получены из НПП «Пи- из каждой группы эвтанизировали. После эвтаназии томник лабораторных животных» ФИБХ РАН и име- у подопытных животных осуществляли забор печени, ли SPF-статус, подтвержденный сертификатом по- почек, сердца, легких, селезенки. Органы взвешива-ставщика. Средняя масса тела мышей к моменту ли для расчета их массовых коэффициентов. начала эксперимента составляла 20,2 ± 0,5 г. Перед Статистическую обработку количественных дан-началом эксперимента животные проходили период ных проводили с помощью компьютерных программ
2'2020 том 19 | vol. 19 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
58 Оригинальные статьи
Microsoft Office Excel и Origin. Расчет ЛД проводили с использованием метода пробит-анализа. ЛД50 представлена как среднее ± стандартное отклонение. Результаты измерения массы тела животных представлены как среднее ± стандартное отклонение; результаты изменений массы органов и уровня лейкоцитов в крови представлены как среднее ± стандартная ошибка. Полученные количественные данные обрабатывали статистически с применением t-критерия Стьюдента и критерия х2 Пирсона. Различия считали достоверными приp <0,05.
Результаты и обсуждение
При изучении острой токсичности на мышах при внутривенном введении ДОЦ в составе фолат-модифицированных полимерных частиц PLGA-ДОЦ-ДФК в дозах 20, 60, 90 мг/кг гибели животных выявлено не было. При введении препарата в дозах 120 и 160 мг/ кг наблюдалась гибель животных на 1-4-е сутки (табл. 1). После введения препарата в высоких дозах у мышей отмечалось общее угнетение, снижение двигательной активности, нарушалась координация движений, развивался парез задних конечностей. Животные погибали на фоне выраженной гиподинамии. У выживших животных общее состояние и поведение нормализовались и соответствовали состоянию животных в контрольной группе. Как видно из табл. 1, наблюдались отличия в выживаемости мышей при введении сравниваемых препаратов в зависимости от дозы и по срокам гибели. В случае введения PLGA-ДОЦ-ДФК гибель животных наблюдалась начиная с дозы 120 мг/кг, а в случае ДОЦ — с дозы 60 мг/кг. Кроме того, летальные эффекты были более отсрочены в случае введения PLGA-ДОЦ-ДФК, чем в случае ДОЦ, после введения которого гибель животных наступала в течение 24 ч. Картина интоксикации была сходна для сравниваемых препаратов, но развитие токсических эффектов происходило быстрее, и степень их проявления на фоне максимальных доз была более выражена в группах с введением ДОЦ, чем в случае введения PLGA-ДОЦ-ДФК. Различий в картине интоксикации после введения ДОЦ в составе фолатмодифицированных полимерных частиц и не-модифицированных частиц (PLGA-ДОЦ) не наблюдалось. При аутопсии умерщвленных в конце эксперимента животных, получавших максимальные дозы вводимых препаратов, отмечены признаки гастроин-тестинальной токсичности (повреждения слизистой), увеличение печени и селезенки, локальная алопеция, раздражение в месте инъекции, остальные органы — без особенностей. В целом описанная клиническая картина интоксикации и вскрытия согласуется с данными литературы о токсических эффектах ДОЦ [7, 16].
Динамика изменения массы тела мышей после внутривенного введения препаратов представлена
в табл. 2. Показано, что препараты в дозах 20—60 мг/кг незначительно влияли на массу тела животных. После введения препаратов в дозах 120 и 160 мг/кг наблюдалось умеренное снижение прироста массы тела на 3-8-е сутки после введения, что связано с гастроин-тестинальной токсичностью. Так, в группах с введением PLGA-ДОЦ-ДФК и PLGA-ДОЦ в дозе 160 мг/кг на 8-е сутки после введения снижение массы тела составило 16,5 и 21,4 % по сравнению с контрольной группой. Во всех группах животных наблюдалась тенденция к восстановлению массы тела к 30-м суткам наблюдения, кроме группы с введением PLGA-ДОЦ в дозе 160 мг/кг, в которой выявлена отрицательная динамика прироста массы тела.
таблица 1. Сравнительная токсичность PLGA-ДОЦ-ДФК, PLGA-ДОЦ и субстанции ДОЦ при 1-кратном внутривенном введении мышам C57BL/6
Table 1. Comparative toxicity of PLGA-DOC-FAD, PLGA-DOC and DOC substance with a single IVadministration to C57BL/6 mice
Препарат доза, мг/кг Эффект (всего/ пало), шт. Срок гибели, сутки
Drug Dose, mg/kg Time of death, day
Effect (total/ dead), pcs
20 6/0 -
60 6/0 -
PLGA-ДОЦ-ДФК PLGA-DOC-FAD 90 6/0 -
120 6/5 1, 1, 2, 3, 4
160 6/3 1, 1, 2
20 6/0 -
60 6/1 2
PLGA-ДОЦ PLGA-DOC 90 6/0 -
120 6/2 1, 1
160 6/3 1, 1, 4
20 6/0 -
60 6/2 2, 2
Субстанция ДОЦ Substance DOC 90 6/1 1
120 6/6 1, 1, 1, 1, 1, 1
160 6/4 1, 1, 1, 2
Контроль Control 0 0/6 -
Примечание. Здесь и в табл. 2—6: PLGA-ДОЦ-ДФК— полилактидгликолидные частицы, модифицированные додециламидом фолиевой кислоты; PLGA-ДОЦ — поли-лактидгликолидные частицы, не модифицированные додециламидом фолиевой кислоты; ДОЦ — доцетаксел. Note. Here and in table 2—6: PLGA-DOC-FAD — poly(lactide-co-gly-colide) particles modified with folic acid dodecylamide; PLGA-DOC — poly(lactide-co-glycolide) particles not modified with folic acid dodecylamide; DOC — docetaxel.
таблица 2. Динамика изменения массы тела мышей-самок C57BL/6после 1-кратного внутривенного введения PLGA-ДОЦ-ДФК, PLGA-ДОЦ и субстанции ДОЦ
Table 2. The dynamics of changes in body weight offemale C57BL/6 mice after 1-fold IV administration of PLGA-DOC-FAD, PLGA-DOC and the substance of DOC
доза, мг/кг Dose, mg/kg Animals'bodyweight a dayafterthedruginjection,g
Фон (0) 3-и сутки 8-е сутки 13-е сутки 20-е сутки 30-е сутки
PLGA-доц-дФк
20 19,4 ± 0,4 19,0 ± 0,6 19,1 ± 0,7 20,4 ± 1,0 21,7 ± 1,3 22,2 ± 1,7
60 19,8 ± 0,6 19,4 ± 1,0 18,9 ± 1,4 20,5 ± 1,7 21,7 ± 1,4 22,4 ± 1,6
90 19,6 ± 1,1 18,4 ± 1,1 17,5±1,0 18,0 ± 1,8 19,3 ± 2,0 19,6 ± 2,0
120 20,1 ± 0,7 18,6* 19,8* 19,6* 20* 19,7*
160 20,2 ± 0,8 18,0 ± 0,75 17,5 ± 0,6 18,2 ± 1,4 19,7 ± 1,3 19,7 ± 0,9
plga-доц
20 19,6 ± 0,5 19,2 ± 0,6 19,8 ± 1,0 20,0 ± 1,0 21,0 ± 1,0 21,5 ± 0,8
60 20,6 ± 1,3 19,4 ± 1,2 18,8 ± 1,8 19,2 ± 2,0 20,7 ± 1,9 20,9 ± 1,4
90 19,7 ± 0,5 19,4 ± 1,2 20,1 ± 1,4 21,2 ± 0,6 21,8 ± 1,3 22,0 ± 1,5
120 20,9 ± 1 19,7 ± 1,9 18,6 ± 1,5 18,9 ± 1,6 20,5 ± 1,0 20,6 ± 0,7
160 20,4 ± 0,6 17,1 ± 0,3 16,2 ± 0,3 16,2 ± 0,6 16,6 ± 1,4 16,5 ± 0,3
Субстанция доц
20 20,5 ± 0,3 20,0 ± 0,5 21,3 ± 0,8 21,6 ± 0,6 22,0 ± 0,8 22,5 ± 0,6
60 20,0 ± 0,4 19,7 ± 0,4 21,2 ± 0,6 20,9 ± 0,5 21,2 ± 0,7 21,0 ± 0,5
90 19,6 ± 0,9 19,4 ± 1,0 19,9 ± 1,5 20,5 ± 1,0 20,2 ± 1,2 20,1 ± 1,2
120 20,8 ± 0,7 ** ** ** ** **
160 21,0 ± 1,0 20,1 ± 2,0 21,6 ± 1,5 22,1 ± 2,0 22,7 ± 2,7 22,4 ± 2,8
контрольная группа
21,15 ± 0,5 21,45 ± 0,5 21,9 ± 0,5 22,4 ± 0,5 22,4 ± 0,5 22,6 ± 0,5
*Недостаточное количество животных для статистической обработки; **все животные в данной группе погибли. *Insufficient number of animals for statistical processing; **all animals in the group died.
Получены расчетные токсические дозы препаратов при 1-кратном внутривенном введении самкам мышей С57ВЦ/6 (табл. 3). Значение ЛД50 для субстанции ДОЦ, введенной в растворителе, состав которого соответствует инструкции препарата Таксотер®, было близко данным литературы для указанного препарата [7, 15]. Расчетные токсические дозы фолат-модифицированных полимерных частиц при внутривенном введении оказались выше токсических доз субстанции ДОЦ. Так, значения ЛД50, ЛД16 и ЛД10 для PLGA-ДОЦ-ДФК были выше по сравнению
со значениями для ДОЦ на 24,7; 81,8 и 164,6 % (в случае ЛД16 и ЛД10 различия статистически значимы, р = 0,05). Следует отметить, что широта токсического действия (интервал между ЛД10 и ЛД50) достаточно невелика в случае обоих препаратов, однако для PLGA-ДОЦ-ДФК произошло увеличение терапевтической широты. Расчетные токсические дозы для частиц с ДОЦ без фолатного векторного компонента PLGA-ДОЦ оказались близки величинам токсических доз PLGA-ДОЦ-ДФК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижение токсичности
достигается за счет включения ДОЦ в состав полимерных частиц, как фолатмодифицированных, так и немодифицированных. Включение ДОЦ в частицы обусловливает уменьшение токсических эффектов за счет замедления его высвобождения из полимерной матрицы и исключения из состава достаточно токсичного вспомогательного компонента инъекционной лекарственной формы ДОЦ полисорбата 80, входящего в препарат Таксотер® [12]. Влияние наносомальных систем доставки на снижение общей острой токсичности описано для ряда противоопухолевых препаратов группы таксанов, включенных в состав частиц, как векторизованных, так и невекторизованных [18, 19].
В условиях субхронического эксперимента ДОЦ в составе частиц PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанцию ДОЦ водили мышам внутривенно ежедневно 3-кратно в 2 дозах, рассчитанных исходя из МПД ДОЦ, определенной при исследовании острой токсичности на мышах при внутривенном введении: разовые дозы — 22 и 11 мг/кг. При введении ДОЦ в составе частиц PLGA-ДОЦ-ДФК в дозе 11 мг/кг гибели животных не наблюдалось. Они хорошо переносили введения, отмечалась нормальная прибавка массы тела. На всем протяжении эксперимента отклонений в поведенческих реакциях животных не отмечалось. Применение PLGA-ДОЦ-ДФК в разовой дозе, равной 22 мг/кг, к окончанию курса введений вызвало гибель 2 животных из 10. При этом выжившие самки перенесли курсовое введение по оценке общего состояния удовлетворительно. В группе с введением 22 мг/кг PLGA-ДОЦ-ДФК на 7-е сутки эксперимента наблюдалось снижение на 10,8 % массы тела по сравнению
с контрольными образцами с дальнейшим восстановлением массы тела к 15-30-м суткам наблюдения (табл. 4). При гематологическом исследовании у мышей, получавших PLGA-ДОЦ-ДФК в разовой дозе
таблица 3. Параметры токсичности при 1-кратном внутривенном введении мышам препаратов сравнения PLGA-ДОЦ-ДФК, PLGA-ДОЦ и субстанции ДОЦ, мг/кг
Table 3. The toxicity parameters with a 1-fold IVadministration of PLGA-DOC-FAD, PLGA-DOC and the substance of DOC of comparison preparations for mice, mg/kg
расчетные токсические дозы PLGA- доц-дфк plga-доц Субстанция доц
plga-doc- plga-doc
Estimated toxic doses fad ■■
ЛДю (МПД) LDW (MTD) 58,2 ± 5,5* 57,0 ± 5,7* 22,0 ± 6,0
ЛД16 LDi6 76,0 ± 12,3* 75,6 ± 12,6* 41,8 ± 13,3
ЛД5о LD50 140,0 ± 3,7 142,2 ± 3,8 112,0 ± 4,0
ЛД84 LD84 204,0 ± 7,3 208,7 ± 7,6 182,8 ± 8,0
ЛДш LD100 265,4 ± 4,3 272,6 ± 4,4 250,5 ± 4,7
Примечание. ЛД — летальная доза; МПД — максимально переносимая доза; *различия относительно группы с введением субстанции ДОЦ статистически значимы; р = 0,05.
Note. LD — lethal dose; MTD — maximum tolerated dose; *differences with DOC substance group are statistically significant;р = 0,05.
таблица 4. Динамика изменения массы тела мышей после 3-кратного внутривенного введения PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ Table 4. The dynamics of changes in body weight of mice after 3-fold IV administration of PLGA-DOC-FAD and the substance of DOC
доза, мг/кг масса тела животных, Animals' body weight, g г
Dose, mg/kg Фон (0) 3-и сутки 7-е сутки 15-е сутки 30-е сутки
PLGA-доц-дФк
11 21,4 ± 1,0 21,1 ± 0,8 21,9 ± 1,2 22,4 ± 1,1 21,9 ± 1,4
22 20,3 ± 1,5 19,3 ± 1,1 19,0 ± 0,5 21,0 ± 1,0 20,8 ± 0,4
Субстанция доц
11 20,7 ± 0,9 20,1 ± 1,0 21,5 ± 1,1 21,0 ± 1,0 22,0 ± 0,9
22 21,1 ± 1,0 20,9 ± 1,0 21,6 ± 0,8 21,7 ± 0,9 22,0 ± 0,9
контрольная группа
21,1 ± 1,0 21,2 ± 0,8 21,3 ± 0,9 21,4 ± 0,6 22,3 ± 0,7
таблица 6. Массовые коэффициенты внутренних органов мышей на 30-е сутки после 3-кратного внутривенного введения PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ
Table 6. Mass coefficients of internal organs of mice on the 30h day after 3-fold IV administration of PLGA-DOC-FAD and the substance of DOC
таблица 5. Динамика изменения общего количества лейкоцитов после 3-кратного внутривенного введения PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ Table 5. The dynamics of changes in the total number of leukocytes after 3-fold IV administration of PLGA-DOC-FAD and the substance of DOC
количество лейкоцитов, тыс/мм3
доза, мг/кг Leukocytes count, thousands/mm3
Dose, mg/kg Фон (0) 5-е сутки 20-е сутки 30-е сутки
plga-доц-дфк
11 8,175 ± 0,6 7,719 ± 2,5 10,34 ± 0,8 6,687 ± 0,9
22 7,958 ± 0,4 3,594 ± 0,9 7,438 ± 1,5 6,593 ± 0,7
Субстанция доц
11 7,849 ± 0,7 6,25 ± 0,9 5,75 ± 0,5 7,469 ± 1,5
22 8,032 ± 0,6 7,375 ± 1,2 9,906 ± 1,6 8,75 ± 1,5
контрольная группа
8,238 ± 0,5 8,172 ± 0,5 8,375 ± 0,7 9,25 ± 0,8
орган organ
массовые коэффициенты внутренних органов, %
PLGA-доц-дФк
11мг/кг
22 мг/кг
Субстанция доц
11 мг/кг
22 мг/кг
контрольная группа
Печень Liver 6,62 ± 0,37 6,42 ± 0,69 5,41 ± 0,60 5,47 ± 0,37 6,11 ± 1,21
Почки Kidneys 1,37 ± 0,04 1,46 ± 0,12 1,47 ± 0,25 1,26 ± 0,07 1,34 ± 0,14
Селезенка Spleen 0,56 ± 0,09 0,68 ± 0,02 0,37 ± 0,08 0,36 ± 0,06 0,35 ± 0,08
Легкие Lungs 0,77 ± 0,05 0,72 ± 0,09 0,74 ± 0,12 0,67 ± 0,06 0,64 ± 0,10
Сердце Heart 0,58 ± 0,02 0,61 ± 0,06 0,57 ± 0,10 0,52 ± 0,05 0,54 ± 0,06
22 мг/кг, на 5-е сутки эксперимента было выявлено снижение общего количества лейкоцитов в периферической крови на 56 % относительно контрольной группы с тенденцией к восстановлению к 20-30-м суткам наблюдения (табл. 5). При применении субстанции ДОЦ (11 мг/кг) также наблюдалось снижение уровня лейкоцитов, составившее на 20-й день эксперимента 31 % относительно контрольной группы с восстановлением показателя к 30-м суткам наблюдений. Таким образом, выявленная лейкопения носила хотя
и выраженный, но обратимый характер при применении обоих сравниваемых препаратов.
Анализ массовых коэффициентов внутренних органов мышей в группах с введением PLGA-ДОЦ-ДФК показал, что массовые коэффициенты печени, почек, легких и сердца на 30-е сутки эксперимента не отличались от показателей группы контроля. Выявлено увеличение массовых коэффициентов селезенки в группах животных, получавших PLGA-ДОЦ-ДФК, более выраженное в группе с введением дозы
22 мг/кг относительно группы контроля и группы с введением субстанции ДОЦ. Следует отметить, что выявленное в исследовании увеличение относительной массы селезенки после введения полимерных частиц коррелирует с данными других авторов и может быть связано с процессами поглощения на-норазмерных частиц клетками системы моноцитар-ных фагоцитов, присутствующей в селезенке [20—22].
Представленные результаты показали, что в условиях субхронического применения ДОЦ в составе частиц PLGA-ДОЦ-ДФК при 3-кратном введении в разовой дозе 22 мг препарат проявляет токсические свойства, так как вызывает летальность (2/10), обратимую задержку прироста массы и лейкопению у выживших животных, увеличение относительной массы селезенки. Применение препарата в разовой дозе 11 мг/кг хорошо переносилось животными: гибели животных не вызывало, клинические проявления токсичности и изменения в поведенческих реакциях отсутствовали. Таким образом, степень токсического воздействия PLGA-ДОЦ-ДФК зависела от величины вводимой дозы. Следует отметить, что переносимость PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ в режиме 3-кратного ежедневного введения в дозе 11 мг/кг была сходной, а в случае введения дозы 22 мг/кг выявлено усиление токсичности по сравнению с субстанцией. Изменение токсических свойств ДОЦ в составе частиц связано, по-видимому, с изменением биораспределения и кумулятивным действием. Таким образом, ДОЦ в составе частиц PLGA-ДОЦ-ДФК продемонстрировал приемлемый профиль токсичности. Полученные результаты позволяют предположить, что в терапевтическом диапазоне доз с оптимально подобранным режимом введения препарат не проявит токсических свойств.
Заключение
На основании данных исследования острой токсичности на мышах при 1-кратном внутривенном
введении ДОЦ в составе PLGA-ДОЦ-ДФК и субстанции ДОЦ выявлены существенные отличия между токсическими свойствами изучаемых форм ДОЦ. Установлено, что гибель мышей при применении субстанции ДОЦ наступала на 1-2-е сутки после введения доз в диапазоне 60, 90, 120, 160 мг/кг. В случае введения PLGA-ДОЦ-ДФК летальные эффекты наступали от более высоких доз (120 и 160 мг/кг) и более отсроченно — на 1-4-е сутки после введения препарата. Картина интоксикации была сходна для сравниваемых препаратов и проявлялась в гиподинамии, нарушении координации движений, парезе задних конечностей, но развитие токсических эффектов происходило быстрее, и степень их проявления была более выражена в группах с введением ДОЦ, чем в случае применения PLGA-ДОЦ-ДФК. Полученные расчетные токсические дозы для препаратов при 1 -кратном внутривенном введении мышам-самкам для PLGA-ДОЦ-ДФК были выше по сравнению со значениями для ДОЦ. Для PLGA-ДОЦ-ДФК: ЛД50 -140,0 мг/кг, ЛД10 — 58,2 мг/кг; для субстанции ДОЦ: ЛД50 — 112,0 мг/кг, ЛД10 — 22,0 мг/кг (для ЛД10 различия статистически значимы, р = 0,05).
Изучена токсичность ДОЦ в составе частиц PLGA-ДОЦ-ДФК при 3-кратном ежедневном внутривенном введении мышам-самкам. На основании полученных данных установлено, что степень токсического воздействия PLGA-ДОЦ-ДФК зависела от величины дозы. Введение препарата в разовой дозе 22 мг вызывало летальные эффекты (2/10), обратимую задержку прироста массы и лейкопению у выживших животных, увеличение относительной массы селезенки. Применение PLGA-ДОЦ-ДФК в разовой дозе 11 мг/кг гибели не вызывало, хорошо переносилось животными и характеризовалось сходной токсичностью с субстанцией ДОЦ. Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют рекомендовать разработанный препарат ДОЦ в составе фолатмодифицированных полимерных частиц для дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Prabhu R.H., Patravale V.B., Joshi M.D. Polymeric nanoparticles for targeted treatment in oncology: current insights. Int J Nanomedicine 2015;10:1001-18. DOI: 10.2147/IJN.S56932.
2. Doppalapudi S., Jain A., Domb A.J., Khan W. Biodegradable polymers for targeted delivery of anti-cancer drugs. Expert Opin Drug Deliv 2016;13(6):891-909. DOI: 10.1517/17425247.2016.1156671.
3. Bahrami B., Mohammadnia-Afrouzi M., Bakhshaei P. et al. Folate-conjugated nanoparticles as a potent therapeutic
approach in targeted cancer therapy. Tumour Biol 2015;36(8):5727-42. DOI: 10.1007/s13277-015-3706-6. 4. Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Прозоровский В.Н. и др. Синтез адресного конъюгата для фосфоли-пидной системы транспорта лекарств. Биомедицинская химия 2014;60(6): 713-6. DOI: 10.18097/pbmc20146006713. [Sanzhakov M.A., Ignatov D.V., Prozorovskiy V.N. et al. Development of Targeted Drug Delivery System: Synthesis of Conjugates of Address Fragment
(RA-COOH) With Ligand (R-NH2). Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical chemistry 2014;60(6):713-6. (In Russ.)].
5. Suvorov N.V., Mironov A.F., Grin M.A. Folic acid and its derivatives for targeted photodynamic therapy of cancer. Rus Chem Bulletin 2017;66(11):1982-2008. DOI: 10.1007/s11172-017-1973-7.
6. Montero A., Fossella F., Hortobagyi G., Valero V. Docetaxel for treatment of solid tumours: a systematic review of clinical data. Lancet Oncol 2005;6(4):229-39. DOI: 10.1016/S1470-2045(05)70094-2.
7. PRODUCT MONOGRAPH TAXO-TERE® (docetaxel for injection). Sano-fi-Aventis Canada Inc. Laval (Québec), 2017. Available by: URL: https://www. products.sanofi.ca/en/taxotere.pdf.
8. Su C.Y., Liu J.J., Ho Y.S. et al. Development and characterization
of docetaxel-loaded lecithin-stabilized micellar drug delivery system (LsbMDDs) for improving the therapeutic efficacy and reducing systemic toxicity. Eur J Pharm Biopharm 2018;123:9-19. DOI: 10.1016/j.ejpb.2017.11.006.
9. Nikolskaya E.D., Zhunina O.A., Yabbarov N.G. et al. The docetaxel polymeric form and its antitumor activity. Russian J Bioorganic Chem 2017;43:278-85.
DOI: 10.1134/S1068162017030116.
10. Hu L., Pang S., Hu Q. et al. Enhanced antitumor efficacy of folate targeted nanoparticles co-loaded with docetaxel and curcumin. Biomed Pharmacother 2015;75:26-32.
DOI: 10.1016/j.biopha.2015.08.036.
11. Esmaeili F., Ghahremani M.H., Ostad S.N. et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared
by PLGA-PEG-folate conjugate. J Drug Target 2008;16(5):415-23. DOI: 10.1080/10611860802088630.
12. Poltavets Y.I., Zhirnik A.S., Zavarzi-na V.V. et al. In vitro anticancer activity of folate-modifed docetaxel-loaded PLGA nanoparticles against drug-sensitive and multidrug-resistant cancer cells. Cancer Nanotechnology 2019;10(2). DOI: 10.1186/s12645-019-0048-x.
13. Полтавец Ю.И., Воронцов Е.А., Заварзина В.В. и др. Полимерный комплекс для молекулярно-прицель-ной терапии и способ его получения. Патент РФ № 2 675 810 C1 от 19.12.2017. [Poltavets Yu.I., Vorontsov E.A., Zavarzina V.V. et al. Polymeric complex for molecular targeted therapy and method for its obtaining. RU 2 675 810 C1, 19.12.2017. (In Russ.)].
14. Council of Europe. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS 1986;123.
15. Gaoe H., Pang Z., Pan S. et al. Anti-glioma effect and safety of docetaxel-loaded nanoemulsion. Arch Pharm Res 2012;35(2):333-41.
DOI: 10.1007/s12272-012-0214-8.
16. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte-Voegelein F., Lavelle F. Experimental Antitumor Activity
of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a Taxol Analogue. Cancer Res 1991;51(18):4845-52.
17. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Государственное издательство медицинской литературы (Медгиз), 1963. С. 81-106. [Belen'kij M.L. Elements of quantitative assessment of pharmacological effect. Leningrad: State Publishing House
of Medical Literature (Medgiz) 1963. P. 81-106. (In Russ.)].
18. Sun Y., Zhao Y., Teng S. et al. Folic acid receptor-targeted human serum albumin nanoparticle formulation
of cabazitaxel for tumor therapy. Int J Nanomedicine 2018;14:135-48. DOI: 10.2147/IJN.S181296.
19. Lv W., Cheng L., Li B. Development and evaluation of a novel TPGS-medi-ated paclitaxel-loaded PLGA-mPEG nanoparticle for the treatment
of ovarian cancer. Chem Pharm Bull
2015;63(2):68-74.
DOI: 10.1248/cpb.c14-00423.
20. Demoy M., Andreux J.P., Weingarten C. et al. Spleen capture of nanoparticles: influence of animal species and surface characteristics. Pharm Res 1999;16(1):37-41.
DOI: 10.1023/A:1018858409737.
21. Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А. и др. Сравнительное экспериментальное токсикологическое исследование доксорубицина
и его наносомальных лекарственных форм. Российский биотерапевтический журнал 2008;7(3):24-33. [Treshсhalin I.D., Pereverzeva E.R., Bodyagin D.A. et al. Comparative experimental toxicological study of doxorubicin and nanoparticle formulations. Rossiyskiy bioterapev-ticheskiy zhurnal = Russian Jornal of Biotherapy 2008;7(3):24-33. (In Russ.)].
22. Peracchia M.T., Fattal E., Desmaele D. et al. Stealth PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles
for intravenous administration and splenic targeting. J Control Release 1999;60(1):121-8.
DOI: 10.1016/S0168-3659(99)00063-2.
вклад авторов
A.А. Крашенинникова: дизайн и проведение исследований in vivo — изучение острой и субхронической токсичности, статистическая обработка данных, анализ результатов;
B.В. Заварзина: получение и характеристика фолатмодифицированных полимерных частиц с доцетакселом;
Д.С. Панова: проведение исследований in vivo — изучение острой и субхронической токсичности, статистическая обработка данных; Н.В. Гукасова: разработка дизайна и проведение исследований in vivo — изучение острой и субхронической токсичности, анализ результатов;
C.Л. Кузнецов, И.А. Тубашева, Ю.И. Полтавец: получение и характеристика фолатмодифицированных полимерных частиц с доцетак-селом;
В.Ю. Балабаньян: разработка дизайна исследования, анализ результатов. Authors' contributions
A.A. Krasheninnikova: study design and in vivo studies of acute and subchronic toxicity, statistical data processing, results analysis; V.V. Zavarzina: preparing and characterizing docetaxel-loaded folate-modified polymer particles;
D.S. Panova: in vivo studies of acute and subchronic toxicity, statistical data processing;
N.V. Gukasova: study design and in vivo studies of acute and subchronic toxicity, results analysis;
S.L. Kuznetsov, I.A. Tubasheva, Yu.I. Poltavets: preparing and characterizing docetaxel-loaded folate-modified polymer particles; V.Yu. Balabanyan: study design, results analysis.
oRCID авторов / oRCID of authors
A.А. Крашенинникова / A.A. Krasheninnikova: https://orcid.org/0000-0002-7985-9314
B.В. Заварзина / V.V. Zavarzina: https://orcid.org/0000-0002-9550-4206 Д.С. Панова / D.S. Panova: https://orcid.org/0000-0001-7421-6961 Н.В. Гукасова / N.V. Gukasova: https://orcid.org/0000-0001-7163-4527
C.Л. Кузнецов / S.L. Kuznetsov: https://orcid.org/0000-0002-6290-5142 И.А. Тубашева / I.A. Tubasheva: https://orcid.org/0000-0002-9461-4219
В.Ю. Балабаньян / V.Yu. Balabanyan: https://orcid.org/0000-0002-5744-7060 Ю.И. Полтавец / Yu.I. Poltavets: https://orcid.org/0000-0002-2803-0426
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено в рамках Программы деятельности НИЦ «Курчатовский институт» и Соглашения № 14.607.21.0198 (RFMEFI60717X0198) с Министерством науки и высшего образования Российской Федерации. Financing. The study was supported by the Scientific Program of the NRC "Kurchatov institute" and Agreement No 14.607.21.0198 (RFMEFI60717X0198) of Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation.
Соблюдение правил биоэтики. Протокол исследования от 25.05.2018 НГ №1/109 пр. одобрен комитетом по биомедицинской этике Национального исследовательского центра «Курчатовский институт». Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей.
Compliance with the rules of bioethics. The study protocol 25.05.2018 НГ No 1/109 was approved by the bio-medical ethics committee of National Research Center "Kurchatov institute". The study was performed in accordance with the ethical standards for the treatment of animals adopted by the European Convention for the protection of vertebrates used for research and other scientific purposes.
Статья поступила: 24.10.2019. Принята к публикации: 03.03.2020. article submitted: 24.10.2019. accepted for publication: 03.03.2020.
