CC BY
52УДК 615.9
оценка токсичности химической продукции с использованием альтернативных методов
О.А. Гуськова1, Н.В. Завьялов2, Е.Л. Скворцова2, И.С. Шейнина2
'ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава Российской Федерации 123995, г Москва
2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», 129626, г Москва.
Исследование альтернативными методами продолжает оставаться одним из ключевых вопросов при оценке химической безопасности продукции. Представлен анализ исследований с использованием различных альтернативных моделей. Ключевые слова: альтернативные методы исследования, интегральная токсичность, индекс токсичности.
В последние годы разработка и внедрение альтернативных методов стало одним из ведущих направлений в токсикологических и естественнонаучных исследованиях в мире.
Интерес к исследованию косметического сырья и готовой продукции альтернативными методами является одним из ключевых вопросов. Ещё в 2003 году была одобрена 7-я поправка к косметической Директиве 76/768/ EEC (Cosmetics Directive 76/768/EEC), которая предусматривала постепенный переход к полному запрету опытов на животных конечной косметической продукции, в течение 2009 - 2013 годов.
С 11 июля 2013 года вступил в силу Регламент № 1223/2009 Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О косметической продукции». Согласно которому запрещается размещение на рынке косметической продукции, которая проходила испытания на животных с использованием метода, отличного от альтернативных методов, закрепленных на уровне Сообщества с надлежащим учетом разработки обоснований в рамках OECD (гл. 5, ст.18.).
Введение в Европейском Союзе запрета на использование животных способствовало развитию научных основ альтернативного тестирования. На сегодняшний день актуаль-
ными остаются вопросы воздействия парфюмерно-косметических средств на кожу, роговицу глаза, оценка фототоксичности и сенсибилизирующего действия. Другое важное направление это применение альтернативных методов при оценке канцерогенной и мутагенной активности химических веществ, оценке безопасности и риска при различных путях воздействия химических веществ. Третьим важным направлением можно выделить нанотоксикологию и применение альтернативных методов при изучении наноматериа-лов.
Альтернативные методы на международном уровне развиваются благодаря объединенным усилиям таких центров как CAAT, CARDAM, CeeTox, Европейского Центра по Валидации Альтернативных Методов (ECVAM), ассоциации производителей (COLIPA, ECOPA, ESTIV, CELLTOX и др.), а также отдельных производителей (SEAC), учреждений академической науки, обществ по защите животных. В таблице 1 представлены источники дополнительной информации по исследованиям in vitro.
Многие альтернативные методы валидиро-ваны и включены в перечень ОЭСР (OECD). В настоящее время перечень включает метод оценки фототоксичности (OECD 432),
Гуськова Оксана Альбертовна (Guskova Oksaпa Albertovna), ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава РФ, hitrovanka@rambler.ru
Завьялов Николай Всеволодович (Zavyalov Ш^^у Vsevolodovich), кандидат медицинских наук, зав. отделом профилактической токсикологии ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», nik-zav@mail.ru
Скворцова Екатерина Львовна (Skvorcova Ekaterina Lvovna), кандидат медицинских наук, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» hitrovanka@rambler.ru
Шейнина Инна Семёновна (Sheynina Inna Semenovna), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» hitrovanka@rambler.ru
Таблица 1
источники дополнительной информации по исследованиям in vitro
Веб-страница Докумен т
http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam «Надлежащая практика культуры клеток»
http://mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html Руководство MIAME «Минимальная информация об эксперименте с применением микрочипа»
http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam База методов ECVAM «Европейский центр по официальному утверждению альтернативных методов»
http://iccvam.niehs.nih.gov/ База ICCVAM «Межведомственный координационный комитет по официальному утверждению альтернативных методов»
раздражения кожи OECD 432, 430, 431, 439, 435, раздражения слизистой оболочки глаз (OECD 437 и OECD 438). В качестве модельных систем активно используют последние достижения в области клеточных технологий (создание трехмерных клеточных структур, аналогов тканей и эпителиев человека). Уже разработаны аналог эпителия кожи, роговицы глаза, десны и др. Активно используются отдельные ткани животных (роговицы глаза быка и курицы, кожа крысы). Для оценки рисков токсичности также активно развиваются компьютерные методы.
Регистрируемый показатель функционального состояния тест-объекта (тест-функция) должен характеризовать фундаментальные процессы его жизнедеятельности. Сложность проблемы заключается не в выборе того или иного биологического эффекта, а в том, чтобы установить значимость изменения регистрируемого параметра для тест-объекта. Этот принцип известен в токсикологии как принцип «критерия вредности» [1,2]. Кроме того, желательно, чтобы изучаемый процесс был общим для организмов, стоящих на разных ступенях эволюции.
Исследования возможности использования альтернативных тест-систем активно развиваются и в России, и многие уже внедрены в работу токсикологических подразделений центров гигиены и эпидемиологии, научно-исследовательских институтов и применяются для оценки их потенциальной опасности объектов, таких как:
Парфюмерно-косметическая продукция.
Товары бытовой химии.
Полимерные материалы, резины.
Химические вещества.
Изделия медицинского назначения, изделия личной гигиены.
Товары детского ассортимента (игрушки, игры, подгузники).
Изделия, контактирующие с пищевыми продуктами (посуда, упаковка).
Вода водоисточников, сточные воды, почва, отходы.
Воздух рабочей зоны, атмосферный воздух населенных мест и закрытых помещений.
В настоящее время в Центре гигиены и эпидемиологии в городе Москве с целью исследования интегральной токсичности и раздражающего действия на слизистые оболочки используются следующие альтернативные тест-объекты:
• фотобактерии «Эколюм» - лиофилизиро-ванная культура люминесцентных бактерий Е. соН
• клеточная модель - гаметы млекопитающих (кратковременная суспензионная культура сперматозоидов быка - КСБ)
• органная модель - сосудистое русло эмбриона (сосуды хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона).
Уровень токсичности на альтернативной модели фотобактерий «Эколюм» определяется автоматически на приборе «Биотокс-10М» по степени интенсивности биолюминесценции тест-объекта и выражается индексом токсичности (Т). Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат) с быстрым и количественным характером отклика це-
Таблица 2
Структура и динамика токсикологических исследований
Год Всего образцов Не соответствуют требованиям Всего исследований Бактерии «Эколюм» Сперма КРС Сосуды ХАО куриного эмбриона Лабораторные животные
2008 14801 1,3% 16078 7% 8% 85%
2009 6729 2,7% 7968 16% 15% 69%
2010 6265 3,3% 8369 9% 20% 71%
2011 5737 1,5% 1024 3% 10% 87%
2012 1987 2% 3503 15% 36% 2% 47%
лостной системы на интегральное воздействие токсиканта [3].
Уровень токсичности на альтернативной модели КСБ вычисляется автоматически на приборе Анализатор токсичности АТ-05 по изменению двигательной активности сперматозоидов тест-объекта и выражается индексом токсичности (11). Данный метод технологичен, экономичен, автоматизирован, воспроизводим и позволяет быстро получить результат. Экспериментально установлено, что между результатами оценки общей токсичности на целостном организме млекопитающих и цитотоксичностью для спермы быка имеет место высокая степень корреляции [4]. Это позволяет определить критерии экстраполяции результатов экспериментов на КСБ на целостный организм млекопитающих. Сперматозоиды обладают высокой чувствительностью к воздействию испытуемых химических веществ и смесей сложного состава, а подвижность характеризует фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки [5].
Раздражающее действие на слизистую оболочку глаза исследуется с помощью метода высокочастотной допплерографии [6] на сосудах хориоаллантоисной оболочки (ХАО) 10-дневного куриного эмбриона домашних кур породы белый леггорн. Исследование проводится в соответствии с МР 1.2.0025-11 на приборе «Минимакс-Допплер-К», оснащенным датчиком с частотой 25 МГц. С помощью программы М1шшах Бор1ег у.1.7. автоматически вычисляются количественные параметры скорости кровотока. Изменение линейной скорости кровотока (Уз) является
6 1%
1. Средства для ухода за кожей
2. Декоративная косметика
3. Изделия парфюмерные
4. Изделия косметические гигиенические моющие
5. Средства для ухода за волосами
6. Средства гигиены полости рта
Рис. 1. Структура токсикологических исследований парфюмерно-косметической продукции с применением альтернативных методов исследования.
Рис. 2. Динамика токсиколого-гигиенических исследований за период 2008-2012 гг.
показателем выраженности местно раздражающего действия исследуемого вещества на сосуды ХАО [7]. Этот метод является альтернативой одного из самых болезненных тестов на лабораторных животных - теста Драйза [8].
В 2012 году доля альтернативных методов составила 53% от всех проведённых токсикологических исследований. В сравнении с 2011 годом отмечается увеличение количества альтернативных исследований на 40%. Среди альтернативных методов 68% это исследования интегральной токсичности с использованием спермы крупного рогатого скота; 30% -исследования интегральной токсичности с применением фотобактерий «Эколюм» и 2% - исследования раздражающего действия методом ультразвуковой допплерографии на сосудах хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона ex vivo.
Структура и динамика по годам токсикологических исследований представлена в табл.2.
В 2012 году в структуре продукции исследуемой альтернативными методами 52% пришлось на парфюмерно-косметическую продукцию, 22% - составили средства личной гигиены, медицинские изделия и товары народного потребления, 16% - товары бытовой химии и 10% - товары для детей.
Структура токсикологических исследований парфюмерно-косметической продукции с применением альтернативных методов исследования представлена на рисунке 1.
Отрицательные результаты составляли 3-4% (за 2010-2013 гг.), из них большая часть пришлась на изделия медицинского назначения (в частности латексные перчатки), товары бытовой химии и товары для детей (краски для рисования, пластилин).
Несмотря на то, что общее количество ток-сиколого-гигиенических исследований значительно снизилось в 2012 по сравнению с 2011 годом, объемы альтернативных исследований увеличиваются год от года. Снижение объемов исследований связано с тем, что большая часть парфюмерно-косметической продукции была исключена из перечня продукции, подлежащей обязательной Госрегистрации в соответствии с вступлением в июле 2012 года в действие ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической продукции».
Динамика токсиколого-гигиенических исследований, проведенных за 5 лет (20082012 гг.) представлена на рисунке 2.
Заключение. Таким образом, очевидно, что в настоящее время альтернативные методы исследования в токсикологии быстро разви-
ваются, увеличивается количество исследований с привлечением альтернативных моделей, внедряются новые альтернативные методы.
В последние годы альтернативные методы всё активнее используются при проведении санитарно-эпидемиологических экспертиз для оценки соответствия продукции предусмотренным законодательством требованиям для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения и защиты прав потребителей.
Перспективные направления работы в этой области деятельности:
• Дальнейшее развитие российских альтернативных методов с целью их последующей
валидации на международном уровне.
• Накопление данных по исследованиям in vitro.
• Освоение, продвижение в России альтернативных методов определения показателей токсичности парфюмерно-косметической продукции, получивших валидацию в EC.
• Внедрение альтернативных методов исследования острой токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек на моделях Daphnia magna Straus и Chlorella vulgaris Beijer.
• Обоснование выбора экспресс-методов при исследовании токсических свойств на-но-материалов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ// М. Медицина, 1970.-344с.
2. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений// М.: Медицина, 1975. - 254с.
3. Данилов В.С., Егоров Н.С. Бактериальная биолюминесценция. М.:, Изд-во МГУ 1985.
4. ЕськовА.П., КаюмовР.И., Ротенберг Ю.С. Биотестирование с помощью суспензии сперматозоидов // Гиг.труда и проф.заб. - 1989. - №8. - С. 55-57
5. Мороз Л.Г. Влияние малых концентраций некоторых химических веществ на время переживания сперматозоидов in vitro и их энергетический обмен// Автореферат к.б.н. Л., 1979 - с.23.
6. Способ оценки раздражающего
действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии// патент на изобретение №2383888, 2010г. 7. Belyankina E.J., Rodina IA., Shevchenko T. V, Tikhonov VP. «Application of ultrasonic dopplerografic metod on the model of chicken embryo vessels in ovo for standartization of natural substances»// The 12th International
Congress «Phytopharm 2008», P. 20. 8. Лукьянов A.C., Павлова Т.Н., Халепо А.Н. Тест НЕТ-САМ как альтернатива окулярному тесту Draize// 1й съезд токсикологов России 17-20.11.98 Тезисы докладов. М., 1998, с.292.
REFERENCES:
1. Sanotskiy I.V Methods of determination of toxicity and danger of chemicals. Moscow: Meditsina; 1970: 344. (in Russian)
2. Sanotskiy I.V, Ulanova I.P. Criteria of harm in hygiene and toxicology at an assessment of danger of chemical compounds. Moscow: Meditsina; 1975: 254. (in Russian)
3. Danilov VS., Egorov N.S. Bacterial bioluminescence. Moscow: Izd-vo MGU; 1985. (in Russian)
4. EskovA.P., Kayumov R.I., Rotenberg Yu.S. Biotesting by means of suspension of spermatozoa. Gig.truda i prof.zab.1989; 8: 55-57.(in Russian)
5. MorozL.G. Influence of small concentration of some chemicals for the period of experience of spermatozoa of in vitro and their power exchang . Can.biol. sci. diss. L.:1979 (in Russian)
6. Way of an assessment of an irritant action
and activity of natural, synthetic substances and ready preparations on chicken embryos a method of an ultrasonic dopplerografiya: patent na izobretenie №2383888; 2010. (in Russian)
7. Belyankina E.J., Rodina IA., Shevchenko T. V, Tikhonov VP. Application of ultrasonic dopplerografic metod on the model of chicken embryo vessels in ovo for standartization of natural substances: The 12th International
Congress «Phytopharm 2008», P. 20. 8. Lukyanov A.S., Pavlova T.N., KhalepoA.N. HET-CAM test as alternative to the okulyarny Draize test . 1y sezd toksikologov Rossii . Tezisy dokladov. Moscow: 1998, 292. (in Russian)
O. A. Guskova1, N.V. Zavyalov2, E L. Skvorcova2, I.S. Sheynina2 Safety evaluation of chemical products using alternative methods
'State Budgetary Educational Institution (SBEI) of Additional Professional Training «Russian Medical Academy of Post-Graduate Education» 123995, Moscow, Russian Federation 2FBHE «Sanitary and Epidemiological Center in Moscow»,129626 Moscow, Russian Federation
Alternative methods for use in investigations is still one of the key issues in assessment of products chemical safety. The use of different alternative methods is analyzed. Key words: alternative methods of investigations, initegral toxicity, toxicity sign.
Материал поступил в редакцию 20.11.2013 г
