CC BY
8УДК 574.64: 597.2/.5(262.5)
О.В. Рощина, И.И. Руднева
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ФУНГИЦИДА КУПРОКСАТА С ПОМОЩЬЮ БИОМАРКЕРОВ РЫБ
Институт биологии южных морей НАН Украины
Изучали действие фунгицида купроксата на активность сывороточных аминотрансфераз черноморского ерша. Показано, что при концентрациях меди 1, 10, 100 ПДК для воды содержание меди в мышцах опытных рыб не отличается от контроля. Активность ферментов варьировала неоднозначно и зависела от времени воздействия и концентрации фунгицида. В целом ответные реакции ферментов рыб носили фазный характер, что может быть использовано для характеристики состояния рыб и среды их обитания.
Ключевые слова: фунгицид купроксат, токсичность, морские рыбы, аминотрансферазы, биомаркеры.
Введение. Медь широко распространена в окружающей среде, в том числе в морских и пресных водоемах. Высокое содержание этого элемента, часто превышающее нормативные значения, неоднократно отмечено в водах Азовского и Черного морей [6, 15, 19]. Медь попадает в морскую среду с промышленными, коммунальными и сельскохозяйственными сточными водами, содержащими вещества антропогенного происхождения, в состав которых входит этот элемент. В частности, к таким ксенобиотикам относится фунгицид купроксат, действующим началом которого является трехосновный сульфат меди Си-304 • 3Си (ОН)2 • У2Н2О. Препарат применяется на территории Украины и России с целью предотвращения прорастания спор грибов.
Химические и физические характеристики пестицида соответствуют требованиям ФАО, он считается малотоксичным для теплокровных животных и человека, однако может существенно модифицировать их обменные процессы [1]. Ранее нами было показано, что купроксат оказывает негативное действие на метаболизм морских рыб и ракообразных. Так, у личинок черноморской атерины под действием различных концентраций пестицида обнаружено увеличение активности антиоксидантных ферментов с одновременным возрастанием уровня продуктов перекисного окисления липидов и сокращением концентрации низкомолекулярных антиокси-дантов [12]. Купроксат модифицировал электро-форетический состав белков артемии — типичного обитателя соленых озер приморских территорий [5]. У молоди рыб и ракообразных, содержащихся в среде с пестицидом, отмечали достоверное снижение теплопродукции [13].
Несмотря на то, что купроксат при исследованных концентрациях не оказывал влияния на
выживаемость тестируемых гидробионтов, тем не менее, было продемонстрировано изменение показателей жизнедеятельности организмов, особенно их молекулярных параметров, являющихся наиболее чувствительными к действию негативных факторов. Известно, что многие биохимические индикаторы имеют диагностическое значение как для организма, так и для среды его обитания. В этом отношении наиболее информативными являются ферменты анти-оксидантной системы, активность монооксиге-наз, а также аминотрансфераз, которые используются для анализа физиологического статуса организма и условий его существования при неблагоприятных воздействиях [17].
Целью настоящей работы явилось исследование накопления меди и активности сывороточных аминотрансфераз морского ерша, содержащегося в среде с различной концентрацией купроксата.
Материалы и методы исследований. Объектом исследования служили 3—4-летние особи морского ерша (Scorpaena porcus L.), отловленные в весенне-летний период 2004 г. в прибрежной акватории Севастополя.
Рыб помещали в аэрируемые аквариумы с профильтрованной морской водой из расчета 1 особь на 5 л воды и акклимировали к условиям эксперимента в течение суток. Исходя из того, что утвержденная в Украине ПДК меди для морской воды составляет 0,001 мг/л, в среду добавляли следующие концентрации купроксата в пересчете на медь: 1 ПДК, 10 ПДК и 100 ПДК. Контролем служили особи, содержащиеся в воде без добавления токсиканта. Образцы крови и мышц отбирали через 1, 2 и 3-е суток после начала эксперимента.
Кровь у рыб брали из хвостовой артерии при помощи пастеровской пипетки. В сыворотке
крови, полученной путем отстаивания на холоду, определяли активность аминотрансфераз унифицированным колориметрическим методом Reitman и Frankel [7].
Суммарные образцы мышц, полученные от 5—9 особей, замораживали и хранили при <20 °С. Образцы измельчали и подвергали минерализации [4, 10]. Содержание меди в мышцах измеряли с помощью инверсионного вольтамперомет-рического [11] и атомноабсорбционного [4] методов в 3-5 повторностях для каждого суммарного образца. Данный анализ проводили на базе Севастопольского центра стандартизации, метрологии и сертификации.
Результаты обрабатывали статистически, сравнение проводили с использованием t-кри-терия Стьюдента [8].
Результаты и обсуждение. Как можно видеть, содержание меди в мышечной ткани ерша, находящегося в среде с концентрациями купроксата 1, 10 и 100 ПДК, достоверно не различалось, но варьировало в определенных пределах, проявляя
тенденцию к снижению на 2 и 3-и сутки по отношению к контролю (табл. 1).
Иную картину наблюдали при анализе активности сывороточных аминотрансфераз (табл. 2). Через сутки установлено достоверное снижение активности АлАТ в сыворотке рыб, содержащихся в среде с 1 и 10 ПДК (р < 0,05). На 2-е сутки исследуемые параметры не имели достоверных различий с контролем при всех тестируемых концентрациях. Однако на 3-и сутки отмечено достоверное (р < 0,05) возрастание активности фермента в сыворотке крови рыб, подверженных действию 10 ПДК.
Сходная динамика выявлена для активности АсАТ (табл. 3). При концентрации меди 1 ПДК активность фермента через сутки достоверно снижалась (р < 0,05), тогда как при 10 ПДК возрастала, а при 100 ПДК оставалась неизменной в течение всего периода эксперимента. На 2-е сутки не обнаружено достоверных различий по отношению к контролю во всех вариантах исследований. На 3-и сутки при 1 ПДК активность
Таблица 1
Содержание меди в мышечной ткани морского ерша, мг/кг, M±m
' ' ■—■—__Экспозиция, сутки Концентрация Cu ' ' ■——_____ 1 2 3
Контроль 1,016+0,083 0,95+0,27 1,02+0,107
1 ПДК 0,703+0,28 0,739+0,25 0,75+0,27
10 ПДК 0,92+0,056 0,693+0,083 0,703+0,011
100 ПДК 0,976+0,057 0,479+0,31 0,619+0,008*
Примечание. Здесь и в табл. 2—3: * — достоверные отличия по отношению к контролю (р < 0,05)
Таблица 2
Активность АлАТ в сыворотке крови морского ерша, содержащегося в среде с купроксатом, мкмоль мл/ч, M±m
' '—-^__Экспозиция, сутки Концентрация Cu ' ' ——_____ 1 2 3
Контроль 2,07+0,22 2,48+0,21 2,03+0,16
1 ПДК 0,72+0,15** 1,91+0,31 1,85+0,25
10 ПДК 1,33+0,14* 1,73+0,26 4,05+0,69*
100 ПДК 2,57+0,39 2,55+0,16 1,95+0,17
Таблица 3
Активность АлАТ в сыворотке крови морского ерша, содержащегося в среде с купроксатом, мкмоль мл/ч, M±m
" ■—■—___Экспозиция, сутки Концентрация Cu ' ■—■— 1 2 3
Контроль 1,64+0,11 1,55+0,21 1,72+0,29
1 ПДК 0,95+0,05* 1,87+0,57 2,82+0,22*
10 ПДК 2,55+0,27* 2,57+0,48 2,49+0,43
100 ПДК 1,65+0,3 1,48+0,2 1,46+0,09
фермента была достоверно выше (р < 0,05) по сравнению с контролем.
Коэффициент де Ритиса практически не изменялся у контрольных рыб (рис.). При концентрации 1 ПДК он возрастал в течение всего периода эксперимента. При 10 ПДК оставался повышенным в течение 2-х суток, но затем снижался, а при 100 ПДК почти не отличался от контроля.
Результаты исследований показали, что при непродолжительном воздействии исследованных концентраций купроксата мышечная ткань морского ерша не является основным местом депонирования меди. Известно, что ионы меди проникают через жаберный эпителий посредством зависимого и независимого насыщающих механизмов с низким сродством к переносчикам, а также пассивно поглощаются кишечным эпителием [2, 14]. Наиболее интенсивно медь накапливается в тканях жаберного аппарата и в печени [18, 20, 21, 23]. Отмеченное снижение уровня меди в мышцах морского ерша в эксперименте на 2 и 3-и сутки может быть обусловлено инициированием механизмов выведения металла. В этом случае увеличение концентрации меди в среде и проникновение ее через жаберный аппарат рыб может служить сигналом для активации синтеза металлотионеинов — низкомолекулярных ци-стеин-обогощенных белков, которые способны связывать медь и выводить её из организма. Сначала запускается их биосинтез во внутренних органах, затем при исчерпывании резервов, но продолжающемся поступлении меди в организм, это процесс стимулируется в мышечной ткани [9].
Динамика изменения активности амино-трансфераз при действии малых концентраций купроксата соответствовала классической картине «синдрома Селье». На начальном этапе действия токсиканта происходило снижение активности ферментов, связанное с первичны-
2,5
S
i 2
я
i
Рч
«
3 1
I
i 0,5
1
т
Контроль
и
bm
10ЦДК 100 ПДК
1сут 2сут Зсут
Рис. Коэффициент де Ритиса у морского ерша, содержащегося в среде с купроксатом, усл. ед.
ми нарушениями молекулярных структур и проницаемости мембран (фаза 1, стадия первичных нарушений, или стадия инициации ответа). При продолжении токсического действия, когда проявляются признаки поражения, которые сохраняются на протяжении некоторого порогового срока, в результате чего активизируются процессы, направленные на компенсацию возникших нарушений (фаза 2, стадия реагирования или нарастания ответа).
Компенсаторная реакция, представляющая собой ответ системы на дестабилизирующее воздействие, запаздывает во времени по отношению к нарастанию деструктивных последствий этого воздействия. Однако она возрастает интенсивнее и имеет предельный уровень, определяемый свойствами и состоянием системы. При этом происходит выведение и обеззараживание токсиканта, элиминация и компенсация молекулярных повреждений, последующие перестройки внутриклеточных и физиологических процессов, направленные на ослабление неблагоприятного эффекта. В результате этого функции системы переходят на новый уровень метаболизма. После выхода объема деструктивных изменений за пределы компенсаторного потенциала в системе опять преобладает дальнейшее возрастание видимых проявлений токсикоза (фаза 3, стадия напряженности) [16].
Следует отметить, что сходные результаты были продемонстрированы при исследовании влияния различных концентраций меди на лягушку [22]. Было показано, что активность АсАТ в сыворотке крови варьировала незначительно, тогда как активность АлАТ возрастала с увеличением концентрации меди в среде. Одновременно были отмечены нарушения функции печени, характеризующие углеводный и белковый обмен. В наших исследованиях колебания значений коэффициента де Ритиса при различных концентрациях меди в среде также могут свидетельствовать о функциональных изменениях в печени рыб, направленных на детоксикацию этого ксенобиотика.
Заключение. Результаты исследований позволили установить наличие четкой ответной реакции молекулярных параметров рыб на увеличение уровня меди в среде. При этом особо следует отметить, что даже при достаточно низких концентрациях в воде, которые не вызывают значительного накопления элемента в тканях гидро-бионтов, активность аминотрансфераз является чувствительным индикатором и может быть использована для оценки состояния рыб и среды их обитания в мониторинговых программах.
Список литературы
1. Безруков О.П., Руднева И.И., Мельникова Е.Б. BidnoeidHi реакци антиоксидантно'( системы Kpoei щурiв на дт фунгциду купроксата // Медич-нахшя, 2003. - № 2. - С. 70-73.
2. Голованова И.Л. Влияние тяжелых металлов на физиолого-биохимический статус рыб и водных беспозвоночных // Биология внутренних вод, 2008. - № 1. - С. 99-108.
3. ГОСТ 26926-94. Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб для определения содержания токсичных элементов.
4. ГОСТ 26931-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения меди.
5. Залевская И.Н., Матвеева З.С., Руднева И.И. Ощенка токсического действия фунгищида купроксата на Artemia Salina // Агрoекoлoгiчний журнал, 2004. - № 3. - С. 75-78.
6. Зубаченко Л.В. Содержание меди в воде и в некоторых видах рыб Черного и Азовского морей // Агрoекoлoгiчний журнал, 2004. - № 3 - С. 78-80.
7. Иванов И.И., Коровкин Б.Ф., Манкелов И.М. Введение в клиническую энзимологию. - Л.: Медицина, 1972. - 277 с.
8. Лакин Р.Ф. Биометрия. - М: Высшая школа, 1990. - 352 с.
9. Моисеенко Т.И., Кудрявцева Л.П., Гашкина Н.А. Рассеянные элементы в поверхностных водах суши. Технофильность, биоаккумуляция, экоток-сикология. - М.: Наука, 2006. - 261 с.
10. МВВ 081-12/05-98. Методика выполнения измерений содержания кадмия, свинца, меди в водных растворах инверсионными электрохимическими методами.
11. МВВ 081/12-4631-00. Методика выполнения измерений содержания кадмия, свинца, меди в природных и очищенных сточных водах методом инверсионной вольтамперометрии.
12. Руднева И.И., Залевская И.Н., Кузьминова Н.С. и др. Оценка токсического действия фунгицида купроксата на личинок черноморской атерины // Агрoекoлoгiчний журнал, 2004. - № 3. - С. 83-86.
13. Руднева И.И., Шайда В.Г., Кузьминова Н.С. Действие фунгицида купроксата на теплопродукцию личинок гидробионтов // Агрoекoлoгiчний журнал, 2004. - № 3. - С. 81-82.
14. Столяр О.Б., Мудра А.€., Зшьковська Н.Г. и др. Селективтсть металотюне'жв коропа у звязуванш шешв металiв та антиоксидантний захист оргатзму за ди сумш Midi, цинку, марган-цю i свинцю // Jl^onoeidi НацюнальноЧ академи наук Украни, 2004. — № 5. — С. 184-189.
15. Фащук Д.Я., Сапожников В.В. Антропогенная нагрузка на геосистему море-водосбор и её последствия для рыбного хозяйства (методы диагноза и прогноза на примере Чёрного моря). — М.: ВНИРО, 1999. — 124 с.
16. Филенко О.Ф. Динамика эффекта загрязняющих веществ экотоксикологии // Токсикологический вестник, 2001. — № 2. — С. 2-6.
17. Adams S.M. Assessing cause and effect of multiple stressors on marine systems // Marine pollution Bulletin, 2005. — V. 51. — № 8. — P. 649-657.
18. Carriquiriborde P., Ronco A. Distinctive accumulation patterns of Cd (II), Cu (II), and Cr (VI) in tissue of the South American teleost, pejerrey (Odon-testhes bonariensis) // Aquatic Toxicology, 2008. — V. 86. — № 2. — P. 313-322.
19. Mee D. The Black Sea in Crisis: a need for concentrated international action // AMBIO, 1992. — V. 4. — P. 278-286.
20. Berntssen М., Lundebye А., Hamre K. Tissue lipid peroxidative responses in Atlantic salmon (Salmo salar L.) parr fed high levels of dietary copper and cadmium // Fish physiology and biochemistry, 2000. — V. 23. — P. 35-48.
21. Romeo M., Bennani N., Gnassia-Barrelli M. et al. Cadmium and copper display different responses towards oxidative stress in the kidney of the sea bass Dicentrarchus labrax // Aquatic toxicology, 2000. — V. 48. — P.183—184.
22. Papadimitriu E., Loumbourdis N. Glycogen, proteins and aminotransferase (GOT, GPT) changes in the frog Rana ribibunda exposed to high concentrations of copper // Bull. Envirom. Contam. Toxical, 2005. — V. 74. — P. 120-125.
23. Schjolden J., Sorensen J., Nilsson G. et al. The toxicity of copper to crucian carp (Carassius caras-sius) in soft water // Science of The Total Environment, 2007. — V. 384. — № 1—3. — P. 239-251.
Материал поступил в редакцию 27.02.09.
O.V. Roshchina, I.I. Rudneva EVALUATION OF FUNGICIDE CUPROCSAT TOXICITY WITH THE USE OF FISH MARKERS
Institute of Biology of Southern Seas, Sevastopol
The effect of fungicide Cuprocsat on the activity of serum aminotransferases in the Black Sea scorpion fish Scorpena porcus was studied. No difference was revealed in the Cu accumulation in muscles of exposed and control group fishes incubated in the sea water at Cu concentration of 1, 10 and 100 MACs. On the whole fish enzymes responses demonstrated a phase character which could be used to assess the status of fishes and their habitat.
