Оценка свойств пробиотиков, иммобилизованных на энтеросорбентах, после низкотемпературного хранения Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

© О. М. Бабинец

УДК 57. 043:612-083:616. 34

О. М. Бабинец

ОЦЕНКА СВОЙСТВ ПРОБИОТИКОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ЭНТЕРОСОРБЕНТАХ, ПОСЛЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХРАНЕНИЯ

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины (г. Харьков)

Представленное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы ИПК и К НАН Украины 2.2.6.54 «Исследование механизмов криоповреждений и криозащиты иммобилизованных клеток с целью повышения их сохранности при криоконсервировании и лиофилизации», номер гос. регистрации 0110U000404.

Вступление. В связи с широким распространением дисбиозов, вызванных воздействием ряда факторов [4, 12] большое внимание уделяется созданию рациональных схем коррекции дисбиотиче-ских состояний и различных пробиотических препаратов [11]. Современные принципы разработки таких препаратов предполагают создание синбио-тиков, достаточно длительно сохраняющихся с использованием доступных методов. Кроме того, в соответствии с рекомендациями международных организаций (FAO/WHO) микроорганизмы, входящие в состав этих препаратов должны обладать исходной резистентностью к антибиотикам, антагонистической активностью, а сами лекарственные формы должны обеспечивать высокую устойчивость микробных клеток к действию желудочного сока и желчи [9]. В настоящее время проводят исследования по созданию препаратов IV поколения пробиотиков - живых клеток микроорганизмов на/в различных носителях [9].

В связи с вышесказанным целью исследования являлась разработка экспериментальных препаратов пробиотиков, иммобилизованных на сорбентах, и изучение их сохранности и биологических свойств после хранения при температурах -80° и -196°.

Объекты и методы исследований. Объектами исследования были пробиотические штаммы дрожжей Saccharomyces boulardii и бактерий Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum. Были использованы промышленные штаммы пробиотиков L. bulgaricus 1Z03501 и B. bifidum ЛВА-3 (Российская коллекция промышленных микроорганизмов, ГНИИ «Генетика»). S. boulardii выделили из коммерческого препарата «Энтерол»® (Biocodex, France). S. boulardii выращивали на сусло-агаре (8°Б) при 30° 2 суток. B. bifidum выращивали на агаризированной питательной среде, рекомендованной в информационном письме [6]. L. bulgaricus культивировали на среде МРС [7]. Пробиотические бактерии выращивали в условиях гипоанаэробиоза в анаэро-стате с использованием газогенераторных пакетов HiAnaero Gas Pacet (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия).

Был проведен скрининг с целью использования в качестве носителей следующих коммерческих

препаратов энтеросорбентов: уголь активированный (АО «Стома», Украина), «Сорбекс» (гранулированный активированный уголь, АО «Экосорб», Украина), «СУМС-1» (на основе окиси алюминия с покрытием из углеродной пленки, ОАО «Новосиб-химфарм», РФ), «Лиферан» (на основе лигнина и целлюлозы, ООО «Экоферн», РФ), «Атоксил» (на основе двуокиси кремния, ООО «Орисил-Фарм», РФ), «Лактофильтрум» (на основе лигнина и лакту-лозы, АО «Лексиръ», РФ), «Мультисорб» (на основе целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина, лигнина,

ООО «НПП» «Ариадна», Украина). Иммобилизацию клеток на сорбентах проводили по методике, описанной в [2]. Для оценки сохранности комплексов «носитель-клетки» была разработана методика с использованием учета макроколоний, сформированных в агаризированной среде несколькими микробными клетками, связанными с носителем [1]. В связи с этим в данной статье употребляем два термина - жизнеспособность и сохранность. Жизнеспособность - сохранение клетками способности к пролиферации. Ее учитывали стандартным методом Коха [8] по количеству сформировавшихся макроколоний. Каждая макроколония была образована вследствие деления одной клетки. Сохранность - сохранение способности комплексов к формированию макроколоний в агаризированной среде. При этом макроколонию образуют несколько клеток, иммобилизованных на носителе. Антагонистическую активность, чувствительность к антибиотикам, соляной кислоте и солям желчи комплексов «носитель - клетки» изучали по методикам, которые применяют при оценке биологических свойств свободных клеток пробиотиков [4, 5, 10, 14]. Исследование антимикробной активности культур антагонистов проводили методом штриховых посевов (ГОСТ, 2004), модифицированным методом двухслойного агара с определением показателя минимального ингибирующего количества антагониста (МИКА) и с оценкой характера роста индикаторных культур.

Образцы замораживали в криопробирках «Nunc» цилиндрической формы с рабочим объемом 1,8 мл. Программное замораживание препаратов проводили в замораживателе биообъектов («Cryoson» BV-6, Deutschland) с различными скоростями охлаждения до -40° и затем погружали в жидкий азот. Часть образцов замораживали прямым размещением криопробирок в холодильную камеру («Jouan» Vx 380, France) при температуре -80°. Хранили образцы в течение года (срок наблюдения).

Статистический анализ проводили с использованием пакета статистических программ SPSS

версии 15.0. Порог статистической погрешности был установлен на уровне 5 %. Для сравнения данных использовали t-тест (Стьюдента).

Результаты исследований и их обсуждение.

Наиболее высокие показатели иммобилизации микробных клеток - объектов исследования были получены с сорбентами «Сорбекс» и «СУМС-1». Микробные клетки инкубировали с сорбентами при температуре 0-2° в течение 60-90 минут. Соотношение клеток к массе сорбента составляло 5107 клеток на 0,01 г сорбента для S. boulardii и 1 108 клеток на 0,01 г сорбента для Lactobacillus bulgaricus и Bifidobacterium bifidum.

При изучении влияния условий замораживания на сохранность комплексов «носитель - клетки» было установлено, что на этот показатель, как и при замораживании свободных клеток, влияют скорость охлаждения и состав среды консервирования. Так, после замораживания свободных клеток, суспендированных в физиологическом растворе, со скоростью охлаждения 1 град/мин сохранялось исходное количество клеток. После замораживания со скоростями 5-20 град/мин сохранялись жизнеспособными 60-75 % клеток, со скоростью 40 град/мин -52 %, после погружения в жидкий азот - 31 %. После замораживания клеток, суспендированных в 5 % растворе сахарозы, со скоростями 1-10 град/мин сохранялось исходное количество жизнеспособных клеток, со скоростями 15 и 20 град/мин - 73-75 %, со скоростью 40 град/мин - 24 %, после погружения в жидкий азот - 8 % (рис. 1).

После замораживания клеток S. boulardii, иммобилизованных на сорбенте «Сорбекс», со скоростью 1 град/мин сохранность комплексов «носитель -клетки» в физиологическом растворе составляла 80,5 %, а в сахарозе - 48,7 %. После замораживания со скоростями 5-40 град/мин сохранность комплексов в физиологическом растворе составляла 4,75,4 %, а в 5 % растворе сахарозы 6,0 - 6,1 %. После погружения в жидкий азот сохранялось соответственно 4,7 % и 3,9 % комплексов (рис. 2).

После замораживания клеток S. boulardii, иммобилизованных на сорбенте «СУМС-1», со скоростью 1 град/мин сохранность комплексов «носитель -клетки» в физиологическом растворе составляла 22,2 %, а в 5 % растворе сахарозы - 3,9 %. После

Рис. 2. Сохранность комплексов «носитель-клетки» (клетки б. Ьои1аг&1 иммобилизованные на «Сорбексе» после замораживания с различными скоростями, КОЕ/г.

замораживания с более высокими скоростями (5-40 град/мин) сохранность комплексов в физиологическом растворе составляла 7,7-8,0 %, а в 5 % растворе сахарозы 0,8-0,9 %. После погружения в жидкий азот сохранялось соответственно 3,85 % и 0,7 % (рис. 3).

В экспериментах со свободными и иммобилизованными на энтеросорбентах клетками L. Ьи1-garicus и B. bifidum были установлены аналогичные зависимости влияния скоростей охлаждения и состава среды консервирования на жизнеспособность свободных клеток и сохранность комплексов «носитель - клетки».

□ Замораживание в физрастворе □Замораживание в 5%растворе сахарозы

Рис. 1. Сохранность свободных клеток б. Ьои1аг&1 после замораживания с различными скоростями, КОЕ/мл.

Скорость охлаждения, град/мин

Е Замораживание в физрастворе II Замораживание в 5% растворе сахарозы

Рис. 3. Сохранность комплексов «носитель-клетки» (клетки б. Ьои1аг&/ иммобилизованные на «СУМС-1» после замораживания с различными скоростями, КОЕ/г.

В течение года хранили образцы клеток и комплексов, суспендированных в 5 % растворе сахарозы. Установлено, что гибель свободных клеток и комплексов «носитель - клетки» происходит на этапах охлаждения - отогрева. В процессе хранения в течение 1 года при температурах -80° и -196° дополнительная гибель клеток и комплексов не происходила (табл. 1).

Биологические свойства комплексов «носитель - клетки» изучали после кратковременного хранения при -80° и -196° в течение 3 суток и после хранения на протяжении 1 года. Поскольку их сохранность не зависела от срока хранения, в настоящей статье представлены результаты, полученные после хранения в течение 1 года.

Было установлено, что иммобилизация 5. Ьои1аг-^\'\, L. bulgaricus и В. ЬШит на сорбентах и хранение

Таблица 1

Жизнеспособность свободных клеток и сохранность комплексов «носитель-клетки» после хранения при -80° и -196° в течение 1 года

Образцы Условия эксперимента Количество КОЕ/мл и КОЕ/г, соответственно

-80o -196o

Cвободные клетки S. boulardii ИП (б і 0,01)-107

X Зд (б і 0,02)-107* (б і 0,01)-107*

X 1 г (б і 0,01)-107# (б і 0,01)-107#

Клетки S. boulardii, иммобилизованные на Сорбексе» ИП (б і 0,02)107

X Зд (2,5 і 0,0З)-107* (2,4 і 0,0З)-107*

X 1 г (2,4 і 0,01)-107# (2,5 і 0,0З)-107#

Клетки S. boulardii, иммобилизованные на ^MC-І» ИП (б і 0,02)107

X Зд (2,5 і 0,02)-106* (2,5 і 0,02)-106*

X 1 г (2,5 і 0,0З)-106# (2,5 і 0,01)-106#

Cвободные клетки L. bulgaricus ИП (1 і 0,02)-108

X Зд (1 і 0,01)108 (1 і 0,02)-108

X 1 г (1 і 0,02)-108# (1 і 0,01)-108#

Клетки L. bulgaricus, иммобилизованные на Сорбексе» ИП (1 і 0,01)-108

X Зд (7 і 0,01)-107* (6,9 і 0,02)-107*

X 1 г (6,9 і 0,01)-107# (6,9 і 0,01)-107#

Клетки L. bulgaricus, иммобилизованные на ^MC-І» ИП (1 і 0,02)-108

X Зд (3,5 і 0,02)-107* (3,5 і 0,01)-107*

X 1 г (3,5 і 0,0З)-107# (3,5 і 0,01)-107#

Cвободные клетки B. bifidum ИП (3 і 0,02)-108

X Зд (2 і 0,02)-107* (2 і 0,01)-107*

X 1 г (2 і 0,01)-107# (2 і 0,0З)-107#

Клетки B. bifidum, иммобилизованные на Сорбексе» ИП (3 і 0,0З)-108

X Зд (1 і 0,01)-107* (1 і 0,02)-107*

X 1 г (1 і 0,02)-107# (1 і 0,0З)-107#

Клетки B. bifidum, иммобилизованные на ^MC-І» ИП (3 і 0,02)-108

X Зд (0,5 і 0,01)-107* (0,5 і 0,02)-107*

X 1 г (0,5 і 0,02)-107# (0,5 і 0,01)-107#

Примечание: ИП- исходные показатели; X Зд - Xранение в течение 3 дней; X 1г - Xранение в течение 1 года. * - р < 0,0б при сравнении ИП с X3д; # - р > 0,0б при сравнении X3д и X1n

при температурах -80o и -196o не влияли на ферментативные и антагонистические свойства, чувствительность к солям желчи (рис. 4) и к антибиотикам.

Cвободные и иммобилизованные на обоих сорбентах клетки S. boulardii ферментировали до и после хранения при указанных низких температурах глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, рафинозу и не ферментировали арабинозу, ксилозу, лактозу, трегалозу. Cвободные и иммобилизованные на энтеросорбентах бактерии B. bifidum ферментировали глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Cвободные и иммобилизованные на энтеросорбентах бактерии L. bulgaricus ферментировали целлобиозу и лактозу и не ферментировали галактозу, мальтозу, маннит, маннозу, мелибиозу, раффинозу, сахарозу, трегалозу, арабинозу, сорбит, ксилозу. Также не изменялись спектр и степень антагонистической активности свободных и иммобилизованных микроорганизмов-пробиотиков клеток микроорганизмов-пробиотиков (табл. 2).

12 3

□а 06 Нв

Рис. 4. Жизнеспособность свободных клеток S. boulardii и сохранность комплексов «носитель - клетки» после инкубирования в среде, содержащей 1 % желчных солей: а - до низкотемпературного хранения; б - после хранения при -196°; в - после хранения при -80° (1- клетки S. boulardii иммобилизованные на «Сорбексе»; 2 - клетки S. boulardii иммобилизованные на «СУМС - 1»;

3 - свободные клетки S. boulardii).

Вісник проблем біологіїі медицини - 2012 - Вип. З, том 2 (95)

Таблица 2.

Антагонистическая активность (МИКА, !д КОЕ/мл) свободных и иммобилизованных на энтеросорбентах пробиотиков Б.

boulardii, L. bulgaricus, В. bifidum после низкотемпературного хранения в течение 1 года.

Образцы Темпера- тура хранения S. aureus S. pyogenes S. agalactia е P. mirabilis P. aeruginosa L. monocytogenes Е. coli Enterococ-cus faecalis Kl. pneumoniae С. albicans С/, difficile P. vulgaris В. cereus S. epider-midis

Свободные клетки S. boulardii -80° (3,51 ± 0,02)Ю7 (1,22 ± 0,01)Ю7 (4,31 ± 0,03)Ю7 (4,15 ± 0,03)Ю7 (1,0 ± 0,0 2)-107 (1,10 ± 0,04)-107 (3,85 ± 0,03)Ю7 (5,74 ± 0,05 )-107 (2,01± 0,07)-107 (6,2 ± 0,09)-107 (1,12 ± 0,04)-107 (4,28 ± 0,05 )-107 (5,51 ± 0,0 2)-107 (3,89 ± 0,07)-107

-196° (3,30 ± 0,03)Ю7 (1,21 ± 0,03)Ю7 (4,45 ± 0,06)Ю7 (4,0 ± 0,05)-107 (1,16 ± 0,03)Ю7 (1,31± 0,05 )-107 (3,72 ± 0,04)-107 (5,9 ± 0,03)Ю7 (2,0 ± 0,04)-107 (6,2 ± 0,07)-107 (1,13 ± 0,05 )-107 (4,31 ± 0,07)-107 (5,53 ± 0,05)-107 (3,92 ± 0,01)Ю7

Клетки S. boulardii, иммобилизоанные на «Сорбексе» -80° (3,21 ± 0,03)Ю7 (1,23± 0,0 2)-107 (4,53 ± 0,07)-107 (4,21 ± 0,06)Ю7 (1,43 ± 0,01)Ю7 (1,24 ± 0,02)-107 (3,65 ± 0,05)-107 (5,83 ± 0,04)-107 (2,5 ± 0,02)-107 (6,4 ± 0,04)-107 (1,15 ± 0,09)-107 (4,25 ± 0,06)Ю7 (5,78 ± 0,04)-107 (3,69 ± 0,03)Ю7

-196° (3,31 ± 0,01)Ю7 (1,24± 0,05)-107 (4,49 ± 0,08)-107 (4,19 ± 0,04)-107 (1,27 ± 0,0 2)-107 (1,27 ± 0,04)-107 (3,74 ± 0,05)-107 (5,81 ± 0,06)Ю7 (2,23 ± 0,04)-107 (6,9 ± 0,0 2)-107 (1,09 ± 0,04)-107 (4,56 ± 0,02)-107 (5,21 ± 0,09)-107 (3,54 ± 0,02)-107

Клетки S. boulardii, иммобилизованные на «СУМС-1» -80° (3,22 ± 0,02)-107 (1,27 ± 0,07)-107 (4,37 ± 0,08)-107 (4,27 ± 0,03)Ю7 (1,31 ± 0,0 2)-107 (1,19 ± 0,03)Ю7 (3,69 ± 0,06)Ю7 (5,79 ± 0,02)-107 (2,56 ± 0,07)-107 (6,1 ± 0,05)-107 (1,17 ± 0,04)-107 (4,12 ± 0,07)-107 (5,31 ± 0,07)-107 (3,93 ± 0,05 )-107

-196° (3,29 ± 0,04)-107 (1,24± 0,09)-107 (4,25 ± 0,03)Ю7 (4,37 ± 0,05)-107 (1,32 ± 0,01)Ю7 (1,23 ± 0,05 )-107 (3,74 ± 0,04)-107 (6,0 ± 0,02)-107 (2,9 ± 0,08)-107 (6,7 ± 0,04)-107 (1,21 ± 0,02)-107 (4,9 ± 0,02)-107 (5,69 ± 0,04)-107 (3,76 ± 0,02)-107

Свободные клетки L. bulgaricus -80° (4,53 ± 0,02)-107 (2,27 ± 0,04)-107 (3,74 ± 0,06)Ю7 (2,97 ± 0,05)-107 (1,5 ± 0,03)Ю7 (1,28 ± 0,07)-107 (2,02 ± 0,04)-107 (5,89 ± 0,03)Ю7 (3,24 ± 0,01)Ю7 (2,05 ± 0,0 2)-107 (4,21 ± 0,03)Ю7 (5,24 ± 0,07)-107 (6,79 ± 0,0 2)-107 (4,02 ± 0,01)-107

-196° (4,42 ± 0,03)Ю7 (2,65 ± 0,03)Ю7 (3,82 ± 0,03)Ю7 (3,11 ± 0,03)Ю7 (1,56 ± 0,0 2)-107 (1,32 ± 0,05 )-107 (2,32 ± 0,01)Ю7 (5,76 ± 0,02)-107 (3,25 ± 0,02)-107 (2,15 ± 0,03)Ю7 (4,31 ± 0,01 )-107 (5,26 ± 0,01)Ю7 (6,81 ± 0,03)Ю7 (4,23 ± 0,05 )-107

Клетки L. bulgaricus, иммобилизованные на «Сорбексе» -80° (4,68 ± 0,01)Ю7 (2,49 ± 0,0 2)-107 (3,87 ± 0,01)Ю7 (3,02 ± 0,05)-107 (1,3 ± 0,0 2)-107 (1,26 ± 0,04)-107 (2,29 ± 0,03)Ю7 (5,54 ± 0,03)Ю7 (3,15 ± 0,01)Ю7 (2,01 ± 0,04)-107 (4,35 ± 0,04)-107 (5,83 ± 0,04)-107 (6,62 ± 0,05)-107 (4,51 ± 0,03)-107

-196° (4,72 ± 0,03)Ю7 (2,75 ± 0,03)Ю7 (3,52 ± 0,07)-107 (3,09 ± 0,08)-107 (1,65 ± 0,04)-107 (1,34 ± 0,06)Ю7 (2,12 ± 0,04)-107 (5,79 ± 0,02)-107 (3,12 ± 0,04)-107 (2,18 ± 0,04)-107 (4,23 ± 0,02)-107 (5,64 ± 0,02)-107 (6,21 ± 0,03)Ю7 (4,62 ± 0,04)-107

Клетки L. bulgaricus, иммобилизованные на «СУМС-1» -80° (4,91 ± 0,02)-107 (2,91 ± 0,0 2)-107 (3,69 ± 0,03)Ю7 (3,14 ± 0,06)Ю7 (1,75 ± 0,0 8)-107 (1,19 ± 0,02)-107 (2,35 ± 0,06)Ю7 (5,93 ± 0,04)-107 (3,1 ± 0,03)Ю7 (2,12 ± 0,03)Ю7 (4,56 ± 0,07)-107 (5,32 ± 0,05 )-107 (6,57 ± 0,04)-107 (4,21 ± 0,07)-107

-196° (4,29 ± 0,03)Ю7 (2,53 ± 0,06)Ю7 (3,51 ± 0,07)-107 (2,98 ± 0,05)-107 (1,45 ± 0,04)-107 (1,17 ± 0,01)Ю7 (2,45 ± 0,03)Ю7 (5,76 ± 0,02)-107 (3,17 ± 0,06)Ю7 (2,03± 0,01)Ю7 (4,61 ± 0,0 8)-107 (5,83 ± 0,01)Ю7 (6,96 ± 0,01)Ю7 (4,87 ± 0,05 )-107

Свободные клетки В. bifidum -80° (3,53 ± 0,03)Ю7 (3,48 ± 0,01)Ю7 (4,08 ± 0,01)Ю7 (2,21 ± 0,01)Ю7 (1,94 ± 0,0 2)-107 (1,83 ± 0,02)-107 (2,21 ± 0,01)Ю7 (4,32 ± 0,01)Ю7 (4,51 ± 0,06)Ю7 (1,34 ± 0,0 2)-107 (5,78 ± 0,04)-107 (4,29 ± 0,02)-107 (5,34 ± 0,0 2)-107 (3,28 ± 0,01)-107

-196° (3,76 ± 0,02)-107 (3,26 ± 0,06)Ю7 (4,21 ± 0,05 )-107 (2,23 ± 0,04)-107 (2,21 ± 0,03)Ю7 (1,94 ± 0,05 )-107 (2,14 ± 0,04)-107 (4,25 ± 0,05 )-107 (4,28 ± 0,03)Ю7 (1,35 ± 0,0 2)-107 (5,92 ± 0,03)Ю7 (4,31 ± 0,02)-107 (5,29 ± 0,01)Ю7 (3,41 ± 0,03)-107

Клетки В. bifidum, иммобилизованные на «Сорбексе» -80° (3,24 ± 0,01)Ю7 (3,92 ± 0,05)-107 (4,53 ± 0,04)-107 (2,54 ± 0,06)Ю7 (2,12 ± 0,04)-107 (1,98 ± 0,04)-107 (2,17 ± 0,07)-107 (4,72 ± 0,01)Ю7 (4,82 ± 0,01)Ю7 (1,27 ± 0,04)-107 (5,63 ± 0,02)-107 (4,54 ± 0,02)-107 (5,27 ± 0,01)Ю7 (3,52 ± 0,02)-107

-196° (3,82 ± 0,05 )-107 (3,51 ± 0,0 2)-107 (4,71 ± 0,05 )-107 (2,71 ± 0,05)-107 (1,97 ± 0,01)Ю7 (1,67 ± 0,02)-107 (2,37 ± 0,03)Ю7 (4,82 ± 0,04)-107 (4,53 ± 0,01)Ю7 (1,54 ± 0,03)Ю7 (5,84 ± 0,02)-107 (4,35 ± 0,06)Ю7 (5,32 ± 0,04)-107 (3,43 ± 0,01)-107

Клетки В. bifidum, иммобилизованные на «СУМС-1» -80° (3,72 ± 0,03)Ю7 (3,81 ± 0,05)-107 (4,21 ± 0,02)-107 (2,51 ± 0,02)-107 (2,13 ± 0,03)Ю7 (1,57 ± 0,05 )-107 (2,41 ± 0,02)-107 (4,18 ± 0,04)-107 (4,28 ± 0,07)-107 (1,29 ± 0,05)-107 (5,79 ± 0,01 )-107 (4,27 ± 0,09 )-107 (5,46 ± 0,03)Ю7 (3,24 ± 0,02)-107

-196° (3,92 ± 0,05 )-107 (4,01 ± 0,04)-107 (4,17 ± 0,03)Ю7 (2,93 ± 0,04)-107 (2,17 ± 0,05)-107 (1,85 ± 0,02)-107 (2,73 ± 0,04)-107 (4,72 ± 0,04)-107 (4,92 ± 0,04)-107 (1,11 ± 0,03)Ю7 (5,82 ± 0,07)-107 (4,52 ± 0,01)Ю7 (5,43 ± 0,01)Ю7 (3,45 ± 0,01)-107

КЛІНІЧНА ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА

У свободных и иммобилизованных клеток-микроорганизмов после хранения в течение 1 года сохранялась способность к образованию макроколоний в средах, содержащих 1-5 % смеси желчных солей (рис. 4). Хранение при температурах -80° и -196° не вызывало изменений чувствительности свободных клеток и комплексов к растворам соляной кислоты с рН 1. 0,1.5 и 2.0.

Процесс иммобилизации и хранения при низких температурах не изменяли спектр антибиотикочув-ствительности S. boulardii, L. bulgaricus и B. bifidum.

Полученные результаты свидетельствуют о различиях в выраженности повреждающих физико-химических факторов при замораживании свободных клеток и комплексов «носитель-клетки». Менее выражены эти факторы при замораживании суспензии свободных микробных клеток. Наиболее высокие показатели жизнеспособности клеток после охлаждения со скоростями 1-10 град/мин и снижение жизнеспособности при дальнейшем увеличении скорости охлаждения соответствуют положениям двухфакторной теории криоповреждений [13]. В случае охлаждения комплексов «носитель-клетки» часть поверхности клетки связана с поверхностью носителя и, наиболее вероятно, не участвует в транспорте воды через клеточные мембраны, связанном с процессами внеклеточного кристаллообразования. Соответственно, иммобилизованные клетки повреждаются в большей степени [3]. При этом отмечены различия в криочувствительности комплексов с разными носителями. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что наличие в сорбенте «СУМС-1» оксида алюминия способствует индукции более интенсивного кристаллообразования в клетках.

Процесс хранения в течение 1 года (срок наблюдения) при температурах -80° и -196° не приводит к дополнительной гибели клеток, иммобилизованных на поверхности носителей.

Клетки исследованных культур микроорганизмов после иммобилизации на углеродсодержащих носителях и последующего низкотемпературного хранения, сохраняют исходные биологические свойства, которыми должны обладать пробиотики.

Выводы.

1. Разработаны условия получения экспериментальных препаратов пробиотиков S. boulardii, L. bulgaricus, B. bifidum, иммобилизованных на энтеросорбентах «СУМС-1» и «Сорбекс».

2. Проведено сравнительное изучение влияния условий замораживания и хранения при температурах -80° и -196° градусов на жизнеспособность свободных клеток S. boulardii, L. bulgaricus, B. bifidum и комплексов иммобилизованных на носителях указанных микроорганизмов. Установлено, что комплексы «носитель-клетки» более чувствительны к повреждающему действию процессов охлаждения - отогрева. Экспериментально обоснован режим охлаждения, обеспечивающий максимальную сохранность комплексов «носитель-клетки» -охлаждение со скоростью 1 град/мин до -40° с последующим погружением в жидкий азот.

3. Хранение при температурах -80° и -196° в течение 1 года (срок наблюдения) не приводит к дополнительной гибели клеток, иммобилизованных на поверхности носителей.

4. Иммобилизация на энтеросорбентах и низкотемпературное хранение не изменяют исходные биологические свойства (антагонистическую активность, чувствительность к антибиотикам, соляной кислоте и солям желчи) S. boulardii, L. bulgaricus, B. bifidum.

Перспективы дальнейших исследований.

Результаты проведенных исследований дают основания для разработки коммерческих форм препаратов-пробиотиков, иммобилизованных на сорбентах. Такие разработки будут возможны после изучения пробиотических свойств данных экспериментальных препаратов при дисбиозах различного генеза.

Список литературы

1. Бабинец О. M. Экспериментальное обоснование метода оценки сохранности клеток микроорганизмов-пробиотиков, иммобилизованных на энтеросорбентах [Текст] / О. M. Бабинец, В. Ф. Mарценюк // Mатерiали VI MiжнародноЇ конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» - Xаркiв, 21-24 листопада 2011. - C. 278-280.

2. Высеканцев И. П. Cравнительное изучение адсорбции стандартных маркеров и пробиотиков Saccharomyces boulardii и Bifidobacterium bifidum на энтеросорбентах [Текст] / И. П. Высеканцев, О. M. Бабинец, В. Ф. Mарценюк // Вісник проблем біології і медицини. - 2011. - Вип. 1, C. 58-62.

3. Гордиенко Е. А. Физические основы низкотемпературного криоконсервирования клеточных суспензий [Текст] / Е. А. Гордиенко, Н. C. Пушкарь. - Киев: Наук. думка, 1994. - 143 с.

4. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению. - 2-е изд., испр. и доп. / под ред. Е. И. Ткаченко, А. Н. Cу-ворова. - Cl^.: Информ Mед, 2009. - 267 с., ил.

5. Ермоленко Е. И. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл [Текст] / Е. И. Ермоленко, В. А. Исаков, C. X. Ждан-Пушкина, В. В. Тец // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - № 5. - C. 94-98.

6. Иванов В. П. Cовершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо [Текст] / В. П. Иванов, А. Г. Бойцов, А. Д. Коваленко [и др. ]. - CTO.: Центр госсанэпиднадзора, 2002.

7. Лихачева А. Ю. ^временное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus [Текст] / А. Ю. Лихачева, В. M. Бондаренко, К. Я. Уколова // Журн. микробиол. - 1992. - № 9-10. - C. 74-78.

8. Луста К. А. Mетоды определения жизнеспособности микрорганизмов [Текст] / К. А. Луста, Б. А. Фихте / Ред. В. К. Еро-шин - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН CCCR 1990. - 186 с.

9. Лясковский Т. M. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям международных организаций (FAO/WHO) [Текст] / Т. M. Лясковский, В. C. Подгорский // Mикробиол. журн. - 2005. - Т. 67, № 6. - C. 104-112.

10. Приказ Минздрава СССР ОТ 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

11. Шендеров Б. А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома [Текст] / Б. А. Шен-деров. - М.: Дели принт, 2008. - 320 с.

12. Шендеров Б. А. Функциональное питание и пробиотики: микроэкологические аспекты [Текст] / Б. А. Шендеров. - М.: Агар, 1997. - 23 с.

13. Mazur B. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled of supraoptimal rates [Text] / B. Mazur // Cryobiology, 1977. - V. 14, № . 3. - P. 251-272.

14. Graff S. Influence of pH conditions on the viability of Saccharomyces boulardii yeast [Text] / S. Graff, J. C. Chaumeil [et al.] // Journal of General and Applied Microbiology. - 2008. - V. 54, № 4. - P. 221-227.

УДК 57. 043:612-083:616. 34

ОЦЕНКА СВОЙСТВ ПРОБИОТИКОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ЭНТЕРОСОРБЕНТАХ, ПОСЛЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХРАНЕНИЯ

Бабинец О. М.

Резюме. Экспериментально обоснованы условия иммобилизации пробиотичесих микроорганизмов

S. boulardii, L. bulgaricus і B. bifidum на углеродсодержащих энтеросорбентах. Показано, что комплексы иммобилизованных микроорганизмов более чувствительны к повреждающему действию низких температур по сравнению с суспензиями свободных клеток. Xранение на протяжении 1 года при температурах -80o и -196o не влияет на исходные биологические свойства свободных и иммобилизованных микроорганизмов.

Ключевые слова: пробиотики, иммобилизация, низкотемпературное хранение, биологические свойства.

УДК 57. 043:612-083:616. 34

ОЦІНКА ВЛАСТИВОСТЕЙ ПРОБІОТИКІВ, ІММОБІЛІЗОВАНИХ НА ЕНТЕРОСОРБЕНТАХ, ПІСЛЯ НИЗЬКОТЕМПЕРАТУРНОГО ЗБЕРІГАННЯ

Бабінець О. М.

Резюме. Експериментально обґрунтовані умови іммобілізації пробіотичних мікроорганізмів S. boulardii, L. bulgaricus і B. bifidum на вуглецевмісних ентеросорбентах. Показано, що комплекси іммобілізованих мікроорганізмів більш чутливі до пошкоджуючої дії низьких температур в порівнянні зі суспензіями вільних клітин. Збереження протягом 1 року при температурах -80o і -196o не впливає на вихідні біологічні властивості вільних та іммобілізованих мікроорганізмів.

Ключові слова: пробіотики, іммобілізація, низькотемпературне зберігання, біологічні властивості.

UDC 57. 043:612-083:616. 34

Estimation Of Properties Of Probiotics Immobilized On Enterosorbents After Low-Temperature Storage

Babinets O. M.

Summary. Were experimentally grounded conditions of immobilization of probiotic microorganisms S. boulardii, L. bulgaricus and B. bifidum on carbon enterosorbents. It is shown that complexes immobilized microorganisms are more sensitive to the damaging action of low temperatures in comparison with free cell suspensions. Save for

1 year at -80 o and -196 o does not affect the original biological properties of free and immobilized microorganisms.

Key words: probiotics, immobilization, low temperature storage, biologic properties.

Стаття надійшла З1.08.2012 р.

Рецензент - проф. Дубінін С. I.