CC BY
88
УДК 628.353.153
З. Ш. Рахманкулова, Т. В. Кирилина, А. С. Сироткин
ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ К ОБРАЗОВАНИЮ БИОПЛЕНОК
Ключевые слова: нитрифицирующие микроорганизмы, биопленка, флуоресцентная in situ гибридизация.
Путем многократного пересева микробного сообщества на селективные питательные среды получены накопительные культуры нитрификаторов. Методом флуоресцентной in situ гибридизации была проведена идентификация микроорганизмов в составе выделенных накопительных культур. С помощью модифицированного планшетного метода оценена способность к образованию биопленок нитрифицирующих микроорганизмов I и II фаз, а также смешанной культуры нитрификаторов I и II фаз.
Keywords: nitrifying microorganisms, biofilms, fluorescent in situ hybridization.
The cumulative cultures of nitrifying microorganisms after repeated passaging of the activated sludge microbial community on the selective mediums were obtained. Nitrifying microorganisms within received cumulative cultures by the method of fluorescence in situ hybridization were identified. Using the modified tablet method the ability to form of biofilms for nitrifying microorganisms of I and II phase, and mix culture (I and II phase) was studied.
Введение
Процесс нитрификации в практике очистки сточных вод играет важную роль, так как является конечной стадией окислительных биологических процессов. Кроме того, нитрификация лимитирует процесс очистки сточных вод, поскольку протекает медленно вследствие физиологических особенностей нитрифицирующих микроорганизмов, прежде всего, невысоких ростовых показателей и их требовательности к условиям среды [1]. Вследствие этого, существование нитрифицирующих микроорганизмов в биопленках дает им ряд преимуществ, так как возможность накопления достаточного количества биомассы, повышенную активность биомассы вследствие наилучших условий доступа субстрата и кислорода, защиту от стрессовых факторов окружающей среды.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования в данной работе выступали активный ил городских очистных сооружений (МУП «Водоканал», г. Казань) и нитрифицирующий микробиоценоз в его составе.
Накопительную культуру нитрифицирующих микроорганизмов получали методом Коха. В качестве селективных сред, для выявления нитрифицирующих бактерий использовались среды Виноградского.
Для получения накопительной культуры нитрификаторов жидкую питательную среду Виноград-ского для выделения аммонийокисляющих культур I фазы нитрификации объемом 250 мл инокулировали активным илом в количестве 25 мл и инкубировали в течение трех недель при 25°С и постоянном перемешивании со скоростью 120 об/мин. Первичные культуры повторно пересевали на жидкие питательные среды и культивировали в аналогичных условиях на протяжении трех недель. Использование питательной среды для выделения нитрификаторов только I фазы было связано с тем, что нитрификаторы обеих групп обитают в сложных симбиотических отношениях, и продукты жизнедеятельности аммонийокисляющих микроорганизмов являются субстратом для нитрито-кисляющих бактерий II фазы нитрификации [2].
Для выделения чистых культур аммоний- и нит-ритокисляющих микроорганизмов осуществляли высевы накопительной культуры на твердые питательные среды Виноградского I и II фазы. Процесс культивирования продолжался в течение трех недель, после чего микроорганизмы пересевали на свежие питательные среды.
Для выявления морфологических особенностей выделенных бактерий проводили окраску микробных препаратов по Граму. Идентификацию микроорганизмов осуществляли методом флуоресцентной in situ гибридизации с использованием генных зондов на аммонийокисляющие бактерии бетаф)-группы протеобактерий, а также специфический зонд на нитритокисляющие бактерии Nitrobacter spp. Генные зонды произведены SMT Geräte Handel GmbH, Heidelberg.
Для контроля всей совокупности микробных клеток в образцах использовалось окрашивание раствором 4" ,6'-диамидино-2-фенилиндолдигидро-хлорида (DAPI) [3]. Микроскопирование образцов осуществлялось с помощью микроскопа Axio Imager D2 (Carl Zeiss, Germany) с применением прикладного программного обеспечения Axio Vision 3.1 (Carl Zeiss Vision GmbH, Bildanalyse Systeme) для обработки полученных изображений.
Подсчет клеток, идентифицированных методом флуоресцентной in situ гибридизации, осуществляли с помощью алгоритма компьютерного распознавания и подсчета микроорганизмов в микрофотографиях, разработанного в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» кафедры химической кибернетики Казанского национального исследовательского технологического университета.
Для оценки активности образования нитрифицирующих биопленок был применен модифицированный метод. В отличие от оригинальной методики, где выращивание биопленок происходит в луночных планшетах, биопленки выращивали в стеклянных пробирках в условиях непосредственного контакта бактериальной суспензии с образцами материала-носителя [4]. Количество микроорганизмов в посевном материале составляло 3,5 х 106 КОЕ/мл. В
качестве носителя использовались полиэтиленовые гранулы диаметром 4-6 мм.
В стеклянные пробирки, содержащие 1 мл стерильной питательной среды и носитель для иммобилизации микроорганизмов, вносили 50 мкл посевного материала. В контрольном («холостом») опыте посевной материал в пробирку не вносили. Образцы культивировали в течение 2, 4 и 7 суток, после чего промывали 0,9% раствором NaCl, окрашивали 0,1% водным раствором генцианового фиолетового в течение 10 мин. Несвязанный краситель удаляли тщательной промывкой дистиллированной водой, а связанный экстрагировали в 1 мл 96% этанола. Оптическую плотность полученного раствора регистрировали на фотоколориметре при 570 нм, используя кюветы толщиной 10 мм. Чем выше оптическая плотность экстракта, тем выше активность пленко-образования исследуемого штамма.
Результаты и их обсуждение
В составе накопительной культуры нитрифицирующих микроорганизмов было выделено 2 колонии для 1-й фазы и 3 колонии для 2 фазы нитрифицирующих микроорганизмов, отличающихся цветом, размером и формой.
На основании анализа морфологических особенностей микроорганизмов в составе выделенных микробных колоний для дальнейших исследований были выбраны бледные белые мелкие колонии округлой формы для I фазы и мелкие полупрозрачные колонии округлой формы для II фазы.
Выбранные колонии повторно пересевали на твердые питательные среды. Согласно полученным данным, на средах Виноградского, элективных для I и II фазы, колонии микроорганизмов представлены грамотрицательными бактериями палочковидной формы, спор не обнаружено, что соответствует литературным данным о морфологических особенностях аммоний- и нитритокисляющих микроорганизмов.
Результаты идентификации бактерий методом флуоресцентной in situ гибридизации свидетельствуют о наличии нитрифицирующих микроорганизмов в составе накопительных культур микроорганизмов (рис. 1,2).
Рис. 1 - Аммонийокисляющие микроорганизмы, выросшие на среде Виноградского (I фаза), зонд №о1225 (Су3, красный), краситель DAPI (синий), кратность увеличения х 1000
Согласно результатам идентификации микроорганизмов в составе накопительной культуры, выросшей на среде Виноградского (I фаза), обнаружено практически одинаковое количество аммоний- и нитритокисляющих бактерий (рис. 1). Как было сказано выше, присутствие нитритокисляющих бакте-
рий в составе накопительной культуры, выросшей на среде элективной для аммонийокисляющих микроорганизмов, вероятно связано с симбиотическими отношениями нитрификаторов двух фаз процесса [2].
В составе накопительной культуры, выросшей на среде Виноградского (II фаза) идентифицированы как аммонийокисляющие бактерии, так и нитрито-кисляющие бактерии р. Nitrobacter (рис. 2).
Рис. 2 - Нитритокисляющие бактерии р. М^оЬа^ег, выросшие на среде Виноградского (II фаза), зонд N^3 (Су3, красный), краситель DAPI (синий), кратность увеличения х 1000
Присутствие аммонийокисляющих микроорганизмов в составе накопительной культуры, выросшей на среде элективной для нитритокисляющих микроорганизмов, вероятно, определено сложностью симбиоза нитрифицирующих бактерий и, как следствие, трудностью культивирования микроорганизмов I и II фаз отдельно друг от друга. Согласно литературным данным, метод элективных сред требует продолжительного времени для выделения культуры [5]. Для получения чистых культур необходимо несколько повторных пересевов микроорганизмов на питательные среды [6], очевидно, что пяти последовательных перевесов оказалось недостаточно.
Результаты количественной идентификации свидетельствуют о том, что в среднем 60% микроорганизмов в составе накопительных культур, выросших на средах Виноградского, представлены нитрифицирующими бактериями. Такое соотношение, очевидно, связано с тем, что для II фазы нитрификации была проведена идентификация только бактерий р. Nitrobacter, которые согласно литературным данным вносят значительный вклад в очистку коммунально-бытовых стоков [7].
Рис. 3 - Соотношение количества клеток нитрифицирующих микроорганизмов по фазам в составе накопительных культур, идентифицированных генными зондами
На питательной среде Виноградского, элективной для микроорганизмов I фазы нитрификации, было определено практически одинаковое количество аммоний- и нитритокисляющих бактерий. При этом количество нитритокисляющих бактерий, выросших на среде Виноградского (II фаза) превосходит количество аммонийокисляющих бактерий, выросших на этой же среде, в среднем в 3 раза (рис. 3).
На основании результатов измерения оптической плотности экстрактов красителя были построены зависимости, отражающие характер формирования биопленок нитрификаторами I и II фаз отдельно, а также в условиях их совместного культивирования (рис. 4).
Анализ способности бактерий формировать биопленки на поверхности полиэтиленовых гранул свидетельствует об увеличении числа адгезированных клеток и микроколоний в течении 4 суток и их уменьшении по истечении 7 суток инкубирования. Это может быть связано с тем, что в течение 4 суток инкубации биопленки клетки достигают стадии зрелости, в результате деления клеток возникают компактные микроколонии, объединенные внеклеточным полимерным матриксом. По истечении 7 суток биопленка достигает критической массы, нарушается динамическое равновесие, происходит выделение и дисперсия микроорганизмов в окружающую среду [8].
Рис. 4 - Изменение оптической плотности красителя, отражающее интенсивность формирования биопленок на поверхности полиэтиленовых гранул
Согласно полученным данным наиболее выраженная способность к образованию биопленок на поверхности полиэтиленовых гранул отмечена при совместном культивировании нитрификаторов I и II фазы. Менее интенсивно формировали биопленку аммонийокисляющие микроорганизмы, что, вероятно, связано с более высокой скоростью роста нитри-токисляющих бактерий [9]. Полученные результаты подтверждают известный факт, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и плотнее, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида [10]. Удельное количество биопленки, полученной из суспензии смешанной культуры нитрификаторов I и II фаз, превышает удельное количество биопленки аммонийо-кисляющих микроорганизмов в 1,5 раза, а удельное количество биопленки нитритокисляющих бактерий превышает удельное количество биопленки аммо-нийокисляющих бактерий в 1,2 раза.
Литература
1. Е.Н. Семенова, А.С. Сироткин, Вестник Казанского государственного технологического университета, 1, 42-51 (2008)
2. М.В. Гусев, Л.А. Минеева, Микробиология: учебник для студ. биол. специальностей вузов. Академия, Москва, 2006. 464 с.
3. А.С. Сироткин, Т.В. Кирилина, Е.Н. Семенова, А.А. Халилова, Биофильтрация сточных вод: учебное пособие. Издательство КНИТУ, Казань, 2014. 172 с.
4. Е. А. Немец, Р.А. Юнес, А. К. Худошин, Н. И. Габри-элян, В. И. Севастьянов, Вестник трансплантологии и искусственных органов, 15, 4, 92-97 (2013)
5. Н.Ф. Возная, Химия воды и микробиология: учебное пособие для вузов. Высшая школа, Москва, 1979. 340 с.
6. T.A. Mendum, R.E. Soakett, P.R. Hirsch, Appl. Environ. Microbiol, 65, 9, 4155-4162 (1999)
7. А.Ю. Каллистова, Н. В. Пименов, М. Н. Козлов, Ю. А. Николаев, А. Г. Дорофеев, В. Г. Асеева, В. А. Грачев, Е. В. Менько, Ю. Ю. Берестовская, А. Н. Ножевникова, М. В. Кевбрина, Микробиология, 83, 5, 615-625 (2014)
8. В.В. Гостев, С.В. Сидоренко, Журнал инфектологии, 2, 3, 4-15 (2010)
9. Н.С. Жмур, Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками. Акварос, Москва, 2003. 512 с.
10. Ю.А. Николаев, В. К. Плакунов, Микробиология, 76, 2, 149-163 (2007)
© З. Ш. Рахманкулова, бакалавр, каф. промышленной биотехнологии КНИТУ, [email protected]; Т. В. Кирилина, канд. техн. наук, кафедра промышленной биотехнологии КНИТУ, [email protected]; А. С. Сироткин, д-р техн. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КНИТУ, [email protected].
© Z. Sh. Rakhmankulova, Bachelor-student, department of industrial biotechnology, Kazan National Research Technological University, [email protected]; T. V. Kirilina, PhD. science, associate professor, department of industrial biotechnology, Kazan National Research Technological University, [email protected]; A. S. Sirotkin, doctor of technical sciences, professor, head of department of industrial biotechnology of KNRTU, [email protected].
