Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом elispot у больных, получающих вакцину «Мелавак» Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО... 37

УДК 616-006.81-085.371:616-006-097

А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков,

К.А. Барышников, Л.В. Демидов, АЮ. Барышников

ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА МЕТОДОМ ELISPOT У БОЛЬНЫХ, ПОЛУЧАЮЩИХ ВАКЦИНУ «МЕЛАВАК»

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация:

Бармашов Александр Евгеньевич, аспирант лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: alba0686@gmail.com

Статья поступила: 22.07.2010, принята к печати 17.06.2010.

Резюме

В настоящем исследовании изучался иммунологический ответ у онкологических больных, которые получали вакцину «Мелавак». Оценка специфического противоопухолевого иммунитета проводилась методом ELISPOT - одним из основных способов определения количества интерферон-у-продуцирующих клеток. Лимфоциты инкубировались в присутствии фитогемагглютинина, опухолевого лизата и без стимулятора. Было установлено, что число нестимулированных клеток, продуцирующих интерферон-у составило 4,34 на 100 000 мо-нонуклеаров до иммунизации и 5,39 в процессе; в присутствии ФГА: 64,75 и 71,88 соответственно. В присутствии опухолевого лизата обнаружено 6,46 клеток, продуцирующих интерферон-у на 100 000 мононуклеаров до вакцинации. В процессе иммунизации это число не увеличилось. Полученные результаты позволяют сказать, что вакцина «Мелавак» не стимулирует специфический противоопухолевый иммунитет против меланомы. Однако, поскольку зафиксировано повышение Т-клеточного ответа на ФГА, можно утверждать, что метод ELISPOT применим к оценке специфического противоопухолевого иммунитета.

Ключевые слова: меланома, «Мелавак», ELISPOT, специфический противоопухолевый иммунитетет, интерферон-у.

А E. Barmashov, K.D. Nikitin, I.N. Mikhailova, L.F. Morozova, A.N. Inshakov,

K.A. Baryshnikov, L.V. Demidov, A.Yu. Baryshnikov

SPECIFIC ANTITUMOR RESPONSE ESTIMATE IN CANCER PATIENTS BY ELISPOT METHOD TREATED WITH «MELAVAC» VACCINE

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

Abstract

In this study we have examined the immune response in cancer patients treated with «Melavac» vaccine. Specific antitumor response was estimated by ELISPOT method, one of the basic methods determining the number of inter-feron-y-produced cells. Lymphocytes were incubated with phytohaemagglutinin (PHA), tumor lysate or without stimulator. It was determined that the number of non-stimulated cells producing interferon-y was 4.34 per 100 000 mononuclear cells before immunization and 5.39 after vaccination. When lymphocytes were incubated in presence PHA, the number of cells producing interferon-y was 64.75 before vaccination and 71.88 after immunisation per 100 000 mononuclear cells. When lymphocytes were incubated with tumor lysate the number of interferon-y producing cells reached 6.46 per 100 000 mononuclear cells. It is worth to note that the number of mononuclear cells increased during vaccination. The data observed indicate that «Melavac» vaccine does not stimulate the specific antitumor effect in melanoma patients. However, based on the observed increasing of T-cell response in the presence of PHA we conclude that the ELISPOT method is well applied to estimate specific antitumor immunity.

Key words: melanoma, «Melavac», ELISPOT, specific antitumor innumity, interferon-y.

Введение

В последние десятилетия в области противоопухолевого иммунитета появилось большое число работ, которые наметили пути изменения или восстановления иммунного ответа на опухоль. Одним из таких направлений является противоопухолевая вакцинотерапия [1; 5-9]. В качестве вакцины в том числе используют облученные клетки опухоли, как, например, в препарате «Мелавак» [3].

Вакцина «Мелавак» представляет собой клеточную линию меланомы, трансфицированную геном ГМ-КСФ.

Для трансфекции была использована созданная в Институте биологии гена РАН генетическая конструкция на основе вектора рВК-СМУ (С1опТеЛ), содержащая кДНК человеческого ГМ-КСФ [2].

Метод ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) -твердофазная модификация метода иммунофермент-ного анализа. Изначально ELISpot был разработан С.С. Czerkinsky et al. в 1983 г. [4] для подсчета В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела, а затем был адаптирован для разных задач, в особенности для идентификации и подсчета цитокин-продуцирующих клеток с точностью вплоть до отдельных клеток. ELISPOT позволяет визуализировать вещество, продуцируемое отдельными активированными клетками, и предоставляет как качественную (тип продуцируемого вещества), так и количественную (число активированных клеток) информацию.

Метод ELISPOT удобен и надежен в оценке иммунного ответа у больных ЗНО, получающих иммунотерапию, в особенности - в условиях нехватки исследуемого материала.

Материалы и методы

Мононуклеары периферической крови получали путем разделения в градиенте плотности фи-колл-урографина (р=1,077 г/мл) по стандартной методике. Клетки линии mel Kor культивировали в соответствующей полной среде RPMI-1640, содержащей 10 % ТЭС, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гента-мицина (ICN, США), 0,1% 1000х раствора аминокислот и 0,1% 1000х раствора витаминов (ПанЭко, Россия). Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена.

Для получения опухолевого лизата наращивали 150 000 000 клеток линии MelKor и проводили процедуру замораживание-оттаивание 6 раз. Затем поврежденные клетки осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 2 мин. Супернатант стерильно фильтровали через одноразовые поликарбо-натные фильтры с низкой сорбцией белка с размером пор 0,22 мкм. Определяли концентрацию белка, разливали по аликвотам и хранили при -20 °С.

Иммунизация больных вакциной «Мелавак» проводилась в дозе 30 000 000. облученных опухолевых клеток с интервалом раз в 2 недели. На разных этапах вакцинации проводился забор крови, условно обозначенный «точка».

При постановке ELISPOT раскапывали покровные МКА к ИФН-у на белок-связывающую мембрану 96-луночного планшета по 50 мкл на лунку и инкубировали 18 ч при 37 °С и 5 % СО2. Плато отмывали от несвязавшихся МКА стерильным раствором PBS. Блокировали белок-связывающую мембрану средой, содержащей 5 % ТЭС.

Инкубировали 2 ч при комнатной температуре. После чего блокирующую среду сливали. В лунки вносили по 5x104 (в присутствии ФГА) и 1x105 (в присутствии лизата и без стимулятора) мононук-леаров в присутствии ФГА, 1x105 мононуклеаров в присутствии лизата. Инкубировали 18 ч при 37 °С и 5 % СО2. После инкубации 10-кратно отмывали от клеток буферным раствором, содержащим 0,1% Tween 20. Затем, добавляли 100 мкл на лунку биоти-нилированных МКА к интерферону-у, разведенные 1:1000 в PBS с 0,5 % BSA и 0,1 % Tween 20, инкубировали 2 ч и отмывали от несвязавшихся АТ.

Затем, добавляли 0,01 %-ную щелочную фосфатазу по 100 мкл на лунку. Инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Плато отмывали и добавляли субстрат к щелочной фосфатазе по 100 мкл на лунку. Плато инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции плато отмывали проточной дистиллированной водой в течение 2 мин.

Плато высушивали при комнатной температуре в темноте. Количество пятен в лунках определяли на приборе ELISPOT-reader. В качестве опыта использовался лизат опухолевых клеток (из расчета лизат из 10 000 опухолевых клеток на 100 000 лимфоцитов); в качестве положительного контроля - неспецифический активатор лимфоцитов ФГА в концентрации 10 мкг/мл; в качестве отрицательного - клетки без какого-либо стимулятора.

Результаты и обсуждение

Изучалась продукция ИФН-у лимфоцитами крови 10 больных меланомой, получавших вакцину «Мелавак». Результаты работы представлены в табл.

Число ИФН-у-продуцирующих клеток только у 1 пациента (больная Л. С. В.) выше в опытной пробе, чем в отрицательном контроле до вакцинации. У 2 больных этот показатель больше в отрицательном контроле, чем в опыте (пациенты Д.В.Ю. и Т.Т.В.) также до иммунизации.

У остальных 7 пациентов число ИФН-у-про-дуцирующих клеток было примерно равным в сравниваемых пробах. Результаты говорят о том, что существенной (значимой) разницы между продукцией данного цитокина лимфоцитами, инкубируемыми с опухолевым лизатом, и нестимулированными клетками на данном этапе нет.

Из вышесказанного можно заключить: до вакцинации нет специфического противоопухолевого иммунитета на опухолевый АГ. Подобное явление наблюдается у больных в процессе вакцинации.

Только в 2 из 18 точек (в 11,1 %) у разных больных количество ЛФ, секретирующих ИФН-у, оказалось выше в опыте, чем в отрицательном контроле. Этот факт может свидетельствовать либо о том, что опухолевый лизат не является иммуногеном, либо специфический иммунитет против клеток меланомы на протяжении вакцинации не активируется.

В процессе вакцинации число клеток секре-тирующих интерферон-у в отрицательном контроле либо не изменяется (у одной половины больных), либо уменьшается (у другой половины пациентов). Неспецифический иммунный ответ на ФГА в ряде случаев у одних и тех же больных изменяется на разных этапах вакцинации: либо сначала увеличивается, а потом уменьшается, либо наоборот.

В 2 других случаях (у Д.В.Ю. и Д.А.Ш.) в процессе иммунизации зафиксировано стабильное увеличение ИФН-у-продуцирующих клеток инкубируемых с ФГА. Также у 2 больных (Т.Т.В., П.М.В.) число ЛФ, секретирующих интерферон-у, в положительном контроле в процессе вакцинации неуклонно уменьшалось. В опытной пробе в 50 % случаев данный показатель остается неизменным в процессе вакцинации. В 20 % случаев - уменьшается. У одного пациента - увеличивается. В 20 % случаев число ИФН-у-продуцирующих клеток сначала возрастает, а затем убывает в процессе вакцинации.

Таким образом, нет четкой зависимости в секреции интерферона-у в указанных пробах на протяжении вакцинации.

При сравнении числа клеток (среднее по всем больным) секретирующих исследуемый цитокин до вакцинации и в процессе вакцинации (было взято максимальное значение в точке у данного пациента) было установлено, что в отрицательном контроле оно составило 4,34 на 100 000 мононуклеаров до вакцинации и 5,39 в процессе вакцинации (Р>0,05).

В присутствии опухолевого лизата обнаружено 6,46 клеток, продуцирующих ИФН-у на 100 000 мононуклеаров до вакцинации. В процессе иммунизации это число не увеличивалось (Р>0,05).

Заключение

Исследование по использованию вакцины ««Мелавак»» для иммунизации больных меланомой проводилось в рамках I фазы клинических испытаний. На основании полученных результатов можно заключить, что данная вакцина не способствует появлению специфического противоопухолевого иммунитета против клеток меланомы, трансфицированных геном ГМ-КСФ. Данная вакцина была задумана как стимулятор иммунной системы против опухолевых клеток указанного происхождения.

Т аблица

Число ИФН-у-продуцирующих клеток больных, получающих вакцину «Мелавак» на разных этапах вакцинации__________________________________________

Больные № точки Отрицательный контроль, М ± т Положительный контроль, М ± т Опыт, М ± т Р1* Р2” РЗ*”

до вакцинации 1,67± 1,53 125,67±22,50 37,33±3,79 Р<0,05 Р<0,01 Р<0,05

Л.С.В. 3 28,67± 1,53 37,33±25,54 37,67±11,15 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05

5 23,67± 1,53 39,33±8,14 20,67±4,73 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05

Д.В.Ю. до вакцинации 28,67± 10,50 15,67±6,50 19,67±4,93 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,01

3 2,67± 1,53 21,33± 16,20 10±3,6 Р>0,05 Р<0,05 Р>0,05

т.т.в. до вакцинации 8,33±2,89 99±3,6 3,67±4,04 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

3 9±7,81 29,33±5,03 5±2,65 Р>0,05 Р>0,05 Р<0,05

до вакцинации 0,67± 1,21 29,33±9,54 0,55±0,69 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

Б.В.В. 1 0,33±0,52 52,17±12,59 1,25± 1,48 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

2 0,5±0,55 32±8,60 0±0 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

3 1±1,1 80,6± 12,22 0,67±0,78 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

до вакцинации 0,25±0,5 123,75±6,85 0,38±0,52 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

Б.Н.Е. 1 1,75±0,5 137±7,66 2,43±1,81 Р<0,01 Р<0,05 Р<0,01

2 0,5±0,58 123,75± 11,79 1,13±1,13 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

до вакцинации 1,75±0,5 42,5±3,87 1±1,12 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

Б.Ю.А 1 2± 1,41 22,5±7,05 1± 1,07 Р<0,05 Р>0,05 Р<0,01

2 0,75±0,96 26,75±5,32 0,63±1,06 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

до вакцинации 0,5±1 27,25±5,62 0,25±0,71 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

П.О.В 1 0,5±0,58 10±3,83 0,5±0,76 Р<0,05 Р>0,05 Р<0,05

2 0,75±1,5 5,25± 1,71 0±0 Р<0,05 Р>0,05 Р<0,01

до вакцинации 0,33±0,58 9±5,66 0,38±0,74 Р>0,05 Р>0,05 Р>0,05

Д.А.Ш. 1 0,5±0,58 48,75±9,71 0,38±0,52 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

2 0,5±1 93,75± 11,44 1,25± 1,58 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

П.М.В. до вакцинации 1±0,71 110±3 1± 1,2 Р<,01 Р>0,05 Р<0,01

1 1,8±0,45 81,33±3,06 1,25± 1,16 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

до вакцинации 0,2±0,45 65,33±5,69 0,38±0,52 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

К.Н.Г. 1 5,8± 1,10 199,33±19,86 4,25± 1,49 Р<0,01 Р>0,05 Р<0,01

2 3± 1,22 187,33±43,62 1,5±1,20 Р<0,05 Р>0,05 Р<0,05

*Р1 - достоверность между + и - контролями; ** Р2 - достоверность между опытом и - контролем; ***РЗ _ достоверность межу опытом и + контролем

40 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО...

Поскольку, даже в аллогенной системе все клетки данной патологии несут общие антигены, а секретируемый ГМ-КСФ привлекает дендритные клетки, которые и являются ключевым звеном в противоопухолевом иммунитете. Однако опыт показал, что данная модель не индуцирует специфический иммунитет против меланомы. Причина может заключаться в том, что клетки меланомы не несут на своей поверхности молекулы НЬД-ДБС и ЫЬЛ-БК, которые необходимы для взаимодействия с лимфоцитами. Тем не менее, было зафиксировано повышение Т-клеточного ответа на ФГА.

Следовательно, метод ELISPOT применим в оценке специфического противоопухолевого иммунитета. Кроме того метод высокочувствителен и позволяет фиксировать секрецию интерферона-у клетками, количество которых 5x1G4.

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки Российской Федерации от «14» мая 2009 г. № 02.512.12.2039 в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2007-2012 годы».

Литература

1. Балдуева И А. Противоопухолевые вакцины // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4, № 3. - С. 157-66.

2. Бережной А.Е., Ларин С.С, Бурова О.С. и др. Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 6-7.

3. Михайлова Л.М., Ермакова Н.П., Меркулова И.Б. Исследование туморогенности противоопухолевой вакцины «Мелавак» // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6., № 1. - С. 60-1.

4. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A, Nygren H. et a1. A Solid-phase Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells//Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol. 65. -Р. 109-21.

5. LotzeM, DallalR.M., Kirwood J.M., Flickinger J.C. Cutaneous melanoma / Cancer: Principles & Practice of oncology /Eds. V.DeVita, S.Hellman, S.Rosenberg, 6th Ed. - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. - P. 2012-69.

6. Pardoll DM. Cancer vaccines // Nat. Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 525-31.

7. Parmiani G, Pilla L, Castelli C, Rivoltini L. Vaccination of patients with solid tumours // Ann. Oncol. -2003. - Vol. 418. - P. 817-24.

8. Rosenberg S. Principles of cancer management: biologic therapy / Cancer: Principles & Practice of Ocology, 5th ed./Eds. V.DeVita, S.Hellman, S.Rosenberg; Chapter 18. Philadelphia: Lippincott - Raven Publishers, 1997. - Р. 49-373.

9. Rosenberg S.A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy // Nature. - 2001. - Vol. 411. - P. 380-4.

Издание 2-е, переработанное и дополненное

ЭНЦИКЛОПЕДИЯ

КЛИНИЧЕСКОЙ

ОНКОЛОГИИ

Готовится к печати Издательская группа РОНЦ