Оценка состояния иммунитета и баланса цитокинов методами системного математического анализа (на примере больных с гнойно-хирургической патологией) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология 2000, Т. 2, № 3, стр 279-290 © 2000, СПб РО РААКИ

Точка зрения

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ИММУНИТЕТА И БАЛАНСА ЦИТОКИНОВ МЕТОДАМИ СИСТЕМНОГО МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (на примере больных с гнойно-хирургической патологией)

Останин А.А., Гельфгат ЕЛ/, Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Черных Е.Р.

Лаборатория клеточной иммунотерапии, * лаборатория иммуногенетики,

Институт клинической иммунологии СО РАМН, 630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская 14

Резюме. У больных с различными нозологическими формами гнойно-хирургической патологии выявлены сочетанные нарушения функциональной активности Т-лимфоцитов и моноцитов. При этом установлено, что оценка “стандартных” параметров иммунного статуса не позволяет определить характер иммунных дисфункций в целом по группе хирургических больных. Тем не менее многомерный анализ таких показателей иммунограммы, как абсолютный лимфоцитоз, относительное количество CD3+, CD4+, CD8+T- и С072+В-лимфоцитов, CD4/CD8 индекс, концентрация IgA, IgM, IgG в сыворотке крови, четко визуализирует в величинах главных компонент наиболее важные и ранее скрытые факторы, детерминирующие своеобразие функционального состояния иммунной системы конкретного больного в реальный момент времени. Индивидуальная оценка значений главных компонент позволяет определить у больного: а) преобладание воспалительных vs супрессорных/противовоспалительных факторов в сыворотке крови; б) вариант доминирующей продукции IL-2 vs 1L-4; в) выраженность проявлений основных патогенетических синдромов, характерных для гнойно-хирургической патологии - синдромов эндогенной интоксикации и вторичной иммунной недостаточности. Кроме того, результаты дискриминантного анализа показали, что тесная взаимосвязь между величинами главных компонент и балансом продукции IL-2/IL-4 позволяет также с высокой эффективностью (Q < 0.001) идентифицировать тип доминирующей Т-хелпер-ной активности у обследованных больных, не используя процедуру непосредственного измерения ЦИТОКИНОВ тем или иным известным способом. Методология системного анализа делает доступной информацию о ключевых параметрах иммунного реагирования, таких, как, например, баланс цитокинов Т1 и Т2 типа, что, безусловно, повышает эффективность прогноза течения заболевания и обоснованность выбора иммунокорригирующей терапии.

Ключевые слова: цитокииы, Т-хелперы 1 и 2 типа, главные компоненты, дискриминантный анализ, гнойно-септические заболевания

Ostanin A.A., Gelfgat E.L., Leplina О. Yu., Shevela Е. Ya., Chernykh E.R.

EVALUATION OF IMMUNITY AND CYTOKINE BALANCE BY

METHODS OF SYSTEMIC MATHEMATICAL ANALYSIS

(ON AN EXAMPLE OF THE SURGICAL PATIENTS WITH PURULENT INFECTION)

Abstract. The investigations of surgical patients with various forms of purulent infections revealed combined T-cell and monocyte functional disturbances. It was determined, that the evaluation of “standard” parameters of the immune status does not allow defining the nature of immune disorders in this group of patients. Nevertheless, complex analysis of

____________________________________________ some parameters (such as absolute lymphocyte number,

Адрес для переписки: CD3+, CD4+, CD8+T- and CD72+B-lymphocyte number,

630091, Новосибирск, ул. Ядринцевская 14, CD4/CD8 index, IgA, IgM, IgG concentrations in blood

Институт клинической иммунологии СО РАМН, serum) obviously defines the most significant, previously

Останину A.A. unknown factors which are expressed in principal compo-

Тел.: 3832-28-21 -01 nent values and determine patient’s immunity state in the

Факс: 3832-22-70-28 definite period of time. The evaluation of principal compo-

E-mail: ctlab @ drbit.ru. nent values in patients let us define: a) inflammatory vs.

suppressor/anti-inflammatory factors predominance in serum; b) predominance of either IL-2 or IL-4 cytokine production; c) the severity of main pathogenic syndromes, developing during purulent-surgical infection, such as systemic inflammatory response syndrome and acquired immunodeficiency. Furthermore, discriminant analysis has shown, that close correlation between principal component values and IL-2/IL-4 balance allows also to identify in patients the type of dominant T-helper activity with high efficacy

(Q=0,001) and without the procedure of any known cytokine assay. The methodology of systemic analysis makes the information about key immune parameters such as, for instance, T1 and T2 cytokine balance easily available and there is no doubt that it may increase accuracy in prediction of the disease course and helps to favour an appropriate immunotherapy.

(MedJmmunol., 2000, vol.2, N3,pp 279-290)

Введение

Хорошо известно, что основой функционирования иммунной системы является межклеточная кооперация, которая осуществляется либо через прямые контактные взаимодействия клеток-учас-тников, либо опосредуется действием различных цитокинов [18, 8]. Стремительное накопление новых знаний о сложных сетевых межклеточных взаимодействиях, во-первых, четко показывает, что иммунной системе, как и любой другой биосистеме, присуще такое фундаментальное системное свойство как “целостность”, и, во-вторых, со всей очевидностью диктует необходимость поиска новых подходов к оценке состояния иммунитета в норме и патологии. В настоящее время ясно, что исследование иммунитета по отдельно взятым параметрам, даже если при этом используется так называемый “комплексный подход” к изучению иммунного статуса, не позволяет оценить иммунную систему как единое целое. В этой связи использование методов системного анализа представляется наиболее обоснованным и перспективным подходом при проведении иммунологических исследований [11, 12].

Успешное применение методологии системного анализа при вполне естественном недостатке исчерпывающих знаний обо всех процессах, происходящих в иммунной системе, обусловлено несколькими обстоятельствами. Прежде всего, благодаря наличию астрономического числа потенциально и реально существующих взаимодействий в иммунной системе нет элементов, подсистем, структур и т.д., функционирующих изолированно и полностью независимо друг от друга. Поэтому активация какого-либо одного элемента системы иммунитета неизбежно индуцирует и другие элементы, входящие в ее состав. В итоге иммунная система, как и любая другая биосистема, всегда может быть представлена как совокупность взаимодействующих структур, состояние которой отражается многомерными характеристиками их взаимосвязей [14]. Кроме того, необходимо отметить, что для оценки состояния иммунитета совершенно не обязательно анализировать взаимодействия всех элементов иммунной системы, поскольку каждый из них либо прямо, либо косвен-

но влияет на существующую структуру многомерных корреляционных взаимосвязей. Следует подчеркнуть, что именно методы системного анализа позволяют наиболее эффективно оценить весь комплекс этих многомерных взаимосвязей и выявить наиболее важные но, как правило, непосредственно неопределяемые - латентные факторы (так называемые “факторы-детерминаторы”), определяющие своеобразие функционального состояния иммунной системы конкретного индивида в реальный момент времени.

Настоящее исследование было предпринято с целью показать эффективность и преимущества применения системного математического анализа при оценке состояния иммунитета на примере больных с гнойно-хирургической патологией (ГХП). Данная категория больных отличается большой гетерогенностью, обусловленной разнообразием нозологических форм, степенью тяжести осложнений, распространенностью инфекции и т.д. Неудивительно, что у больных с ГХП обнаруживаются самые разные комбинации нарушений количества и/ или функциональной активности клеток иммунной системы (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов, Т-или В-лимфоцитов) [13, 2, 3, 23]. При этом иммунологические исследования хирургических больных с гнойной инфекцией, как правило, ограничиваются лишь констатацией отклонений тех или иных показателей от средних нормативных значений, тогда как различные аспекты функционирования иммунной системы как единого целого остаются неизученными.

Кроме того, нередко упускается из виду, что нарушения количества и/или функций иммуноком-петентных клеток очень часто имеют вторичный характер, т.е. являются проявлениями первичных дефектов продукции, активности или рецепции регуляторных цитокинов [15]. В этой связи исключительную важность для понимания патогенеза многих иммунопатологических процессов представляет изучение последовательности активации, переключения и негативного контроля функциональной активности Т-лимфоцитов 1-го и 2-типов (ТЫ и ТЬ2-клеток), синтезирующих определенный спектр цитокинов и участвующих в регуля-

ции различных типов иммунных реакций [24]. Так, своевременная и точная диагностика активности оппозитных (Tl Т2) пулов цитокинов признается в настоящее время одним из ключевых элементов прогноза течения и исхода инфекционновоспалительных заболеваний. Однако существующие современные методы (биологические, имму-нохимические, цитометрические) оценки цитоки-нового статуса, как правило, имеют определенные недостатки [15], что существенно снижает их информативность. В представленной работе нами показано, что существующий баланс цитокинов и преобладающий тип Т-хелнерной активности могут быть эффективно идентифицированы в результате многомерного математического анализа “стандартного” набора показателей иммунного статуса без непосредственного измерения продукции цитокинов.

Материалы и методы

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ

Исследования были выполнены в группе 37 хирургических больных и 30 здоровых доноров крови, представленных лицами обоего пола в возрасте от 18 до 50 лет. Исследуемая группа больных включала 24 мужчин (65 %) и 13 женщин (35 %) в возрасте от 15 до 75 лет (средний возраст 39,5 ± 3 лет) с различными нозологическими формами и вариантами клинического течения гнойно-инфекционной патологии. Так, 56,7 % (21/37) больных были оперированы по поводу нагноительных заболеваний органов брюшной полости, таких как гангренозный аппендицит, язвенная болезнь желудка или 12-пер-стной кишки с перфорацией, острая кишечная непроходимость и др. В 43,3 % случаях (16/37) хирургическое лечение проводилось по поводу гнойной инфекции (абсцессы, флегмоны) мягких тканей. 22 из 37 обследованных пациентов (59,5 % случаев) характеризовались развитием генерализованных осложнений (сепсис, разлитой гнойный перитонит).

Клинико-лабораторное обследование проводилось по стандартным схемам с оценкой объективного состояния больного по международной балльной системе SAPS (Simplified Acute Physiology Score) [22]. В целом по группе индивидуальные значения по шкале SAPS варьировали от 2 до 19 баллов (в среднем 9,4 ± 0,9). В качестве интегрального критерия тяжести заболевания у всех больных с гнойно-хирур-гической патологией оценивалась выраженность синдрома эндогенной интоксикации (СЭИ) [17]. Среди обследованных пациентов эндотоксикоз средней (I), тяжелой (II) и крайне тяжелой (III) степени выраженности был выявлен в 35, 32,5 и 32,5 % случаев, соответственно.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования иммунитета у хирургических больных были выполнены как в раннем (до 7 суток; п= 14), так и в позднем (свыше 7 суток; п=23) послеоперационном периоде. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 0,1х106/лунку культивировали в 96-луноч-ных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров IY (АВ) группы крови при 37°С в С02-инкубаторе, Для стимуляции клеток использовали конканавалин A (ConА, 15 мкг/ мл, Sigma), липополисахарид E.coli 0111 :В4 (LPS, 20 нг/мл, Sigma).

Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина (1 цКю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ТОО “Сорбент”, Москва), определяли относительное содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и С08+Т-лимфоцитов, СТ>72+В-лимфоцитов) и моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены. Рассчитывали также величину иммунорегуля-торного индекса (ИРИ= CD4/CD8). В супернатантах, полученных от МНК (0,1х106/лунку), культивированных в течение 48 ч, оценивали уровень спонтанной продукции IL-2 и IL-4 методом элект-рохемилюминесценции в соответствии с протоколом IGEN inc. (США). Данная технология является высокочувствительной “сэндвич”-методикой, при которой на первом этапе парамагнетические бусы (IGEN inc., 25 мкл), покрытые стрептавиди-ном М-280, в течение 20 мин при комнатной температуре инкубируются с равным объемом соответствующих антицитокиновых антител (R&D Systems), меченных биотином. Затем, на втором этапе, добавляется 100 мкл тестируемых супернатантов и 25 мкл антицитокиновых антител, меченных рутениумом. После часовой инкубации при комнатной температуре реакция останавливается добавлением соответствующего assay-буфера (IGEN inc., 250 мкл). Количество образовавшихся комплексов измеряется на анализаторе ORIGEN

1.5 и соотносится со значениями, полученными в параллельных исследованиях rIL-2 и rIL-4 (R&D Systems) в серийных, калибровочных разведениях. Полученные результаты отражают концентрацию (пкг/мл) цитокинов в исследуемых образцах.

Содержание фактора некроза опухолей-а (TNF-а) и интерлейкина-ip (IL-1(3) в 24-часовых супер-

натантах от интактных и ЬРБ-стимулированных МНК определяли методом иммуноферментного анализа (тест-системы НПО “Цитокин”, Санкт-Петербург).

Наличие в сыворотке больных факторов, подавляющих пролиферативную активность лимфоцитов, оценивали по степени снижения СопА-ин-дуцированного пролиферативного ответа МНК тест-доноров в присутствии 10% интактной сыворотки больных (опыт) в сравнении с уровнем ми-тогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). При этом рассчитывался индекс супрессии (ИС) по следующей формуле:

ИС = 1 - (О - К) • 100%.

О суммарной активности эндогенных медиаторов воспаления в сыворотке больных судили по величине индекса воспалительной активности (ИВА) [9]. Сущность метода заключается в том, что среди клеток крови тест-доноров (п=2-3) методом проточной цитофлюориметрии оценивалось относительное количество моноцитов с внутриклеточным содержанием ТОТ-а/р после 1,5-

часовой инкубации лейковзвеси с интактной сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в соотношении 1:3 (v/v). ИВА высчитывался по формуле:

ИВА = О - К.

Выявление моноцитов, содержащих TNF-a/p, проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson, используя мышиные античеловеческие ФИТЦ-меченные моноклональные антитела, специфично распознающие общие детерминанты TNF-a и Р (любезно предоставленные к.м.н. С.В. Киселевым, г. Новосибирск).

Концентрацию иммуноглобулинов класса А, М, G в сыворотках крови больных определяли методом турбодиметрического анализа с использованием соответствующих наборов “Микроанализ IgA, IgM, IgG” (производства АО “СИНТЭКО”) на многоканальном спектрофотометре при длине волны 340 нм.

МАТЕМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на пер-

Табл. 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА В ГРУППАХ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

Показатель Доноры (п=16-30) М ± SE (диапазон) Больные (п=37) М ± SE

Абс. лимфоцитоз х 109/л 1,85 ± 0,09 (1,55 - 2,05) 1,78 ± 0,13

СРЗ Т-лимфоциты % 66,8 ± 1,0 (62,0 - 71,5) 70,0 + 1,9

СМ Т-лимфоциты % 38,8 + 1,3 (32,5 - 44,5) 41,8 ± 2,3

С08 Т-лимфоциты % 26,0 ± 1,0 (22,0 - 30,0) 31,4 ± 2,0

СР4/С08 индекс 1,63 + 0,09 (1,2 -1,9) 1,58 ± 0,16

Спонтанная пролиферация имп/мин 2,090 ± 410(1,350 - 2,980) 1,500 ± 100

СопА-индуц. пролиферация имп/мин 58,330 ± 3,990 (33,120 - 71,640) 26,420 ± 2,410**

С072 В-лимфоциты % 16,0 ±0,9 (12,0-18,0) 15,9 ± 1,8

ІдА г/л 2,8 ± 0,4 (0,9 -3,5) 2,58 ± 0,26

ІдМ г/л 1,1 ±0,4 (0,6-2,8) 1,52 ± 0,14

ідє г/л 17,9 ± 2,2 (8,0 - 19,0) 18,9 ± 1,9

ИС % 0 % 32,5 ± 3,5**

ИВА расч.ед. 1,0 1,43 ± 0,1**

НІА-ОЯ моноциты % 54,6 + 2,7 (37,0 - 68,5) 28,2 ± 2,7**

Спонтанная продукция Т^-а пкг/мл 1,450 ± 180 (700 - 1,940) 1,090 + 170

ЬРБ-индуц. продукция Т^-а пкг/мл 1,950 ± 200 (940 - 2,450) 1,450 ± 170

Спонтанная продукция ІПР пкг/мл 1,660 ± 110 (1,310 - 1,800) 335 + 90**

(-РБ-индуц. продукция И-1р пкг/мл 2,040 ± 110 (1,630 - 2,270) 760 + 130**

Спонтанная продукция И-2 пкг/мл 750 ± 116 (300 - 1,120) 637 ± 121

Спонтанная продукция И-4 пкг/мл 970 ± 76 (825 - 1,150) 644 ± 56**

Примечания: Диапазон - нижнее и верхнее квартильное (± 25 %) отклонение. ** р<0,01, достоверность различий между группами (и - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

сональном компьютере с использованием программы “Statistica 4.3”. Были использованы также методы многомерного анализа с выделением главных компонент [4, 5, 6], а также метод дискриминантного анализа по Андерсону-Pao [1,7].

Результаты исследования

НАРУШЕНИЯ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

Клинико-иммунологический анализ показал, что два синдрома - эндогенной интоксикации и вторичной иммунной недостаточности - являются той единой патогенетической основой, которая позволяет объединить пациентов с различными нозологическими формами гнойно-хирургичес-кой патологии (ГХП) в общую группу. Так, у всех обследованных больных обнаруживались не только клинические, но и лабораторные проявления эндотоксикоза, а именно, токсическая анемия, ускорение СОЭ, увеличение лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ, в среднем до 4,2 ± 0,4 при норме 1,2 ± 0,4 расч.ед.) и уровня среднемолекулярных пептидов (в среднем до 0,7 ± 0,05, при норме 0,3 ± 0,01 усл.ед.). Кроме того, у большинства больных с ГХП были выявлены сочетанные нарушения функциональной активности Т-лим-фоцитов и моноцитов. Так, из данных табл. 1 видно, что по сравнению со здоровыми донорами у обследованных пациентов достоверно снижены митогенная реактивность Т-лимфоцитов и интенсивность спонтанной продукции 1Ь-4, а также относительное содержание ЛЬА-ОИ-позитивных моноцитов и секреция 1Ь-1(3. При этом у больных обнаруживалась как супрессорная, так и воспалительная активность гуморальных сывороточных факторов. Отметим, что при столь выраженных

изменениях функциональной активности Т-кле-ток их относительное и абсолютное количество, а также содержание С072+ В-лимфоцитов и концентрация сывороточных иммуноглобулинов в целом по группе больных с ГХП сохранялись в пределах нормативных значений.

Из представленных данных видно, что для выявления и четкой характеристики иммунных нарушений у хирургических больных требуется проведение достаточно трудоемких и дорогостоящих исследований. В то же время простые и легко воспроизводимые методы “традиционной” оценки иммунного статуса (например, количества и субпопуля-ционного состава лимфоцитов, концентрации 1§ в сыворотке крови) оказываются малоинформативными и не позволяют, как правило, идентифицировать уровень и характер дефектов системы иммунитета. Исходя из этого, был проведен многомерный математический анализ “стандартных” показателей иммунограммы (таких как, абсолютный лим-фоцитоз, относительное количество СОЗ+, СБ4+, СЭ8+Т- и С072+ В-лимфоцитов, СВ4/С08 индекс, концентрация ^А, ^М, в сыворотке крови) с целью выявления “латентных” факторов, последующая оценка которых должна была дополнить полученные данные о нарушениях иммунитета у больных с ГХП.

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ

Как известно, многофакторный анализ корреляционных взаимосвязей (так называемых, “многомерных матриц”) показателей иммунограммы с использованием метода главных компонент позволяет вначале извлечь первую главную компоненту (ГК-1), характерную для большинства обследованных больных и определяющую наибольшее число событий в иммунной системе индивида. Выделяя все последующие компоненты (ГК-

11, ГК-ІІІ и т.д. в зависимости от количества ис-

Табл. 2. СОБСТВЕННЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ И ДОЛИ (ОТДЕЛЬНЫЕ И СУММАРНЫЕ) КОНТРОЛИРУЕМОЙ ИМИ ДИСПЕРСИИ

Главные компоненты Собственное число (X) Вклад в общую дисперсию (%) Суммарный вклад в общую дисперсию (%)

ГК-1 2,36179 26,24 26,24

ГК-11 2,10122 23,35 49,59

ГК-111 1,16583 12,95 62,54

ГК-IV 1,08925 12,10 74,65

ГК-V 0,83585 9,29 83,93

ГК-VI 0,56008 6,22 90,16

ГК-VII 0,47313 5,26 95,41

ГК-Vill 0,28955 3,22 98,63

ГК-IX 0,12331 1,37 100,00

Сумма: 9,00000 100

ходных параметров, взятых для анализа), данный метод позволяет ранжировать выявляемые “латентные” факторы по степени их воздействия на процессы, протекающие в иммунной системе. Чем больше собственное число главной компоненты (Я), а также доля контролируемой ею дисперсии (т.е. чем выше вклад фактора в разнообразие событий, происходящих в иммунной системе и принятых за 100 %), тем выше ее информативная значимость.

Как видно из данных табл. 2, собственное число первых четырех компонент (ГК НУ), выявленных при многомерном анализе девяти “стандартных” показателей иммунограммы обследованных больных, превышало значение 1,0, а их суммарный вклад в общую дисперсию составил 75 %, т.е. эти факторы детерминируют основную часть иммунных процессов у пациентов с ГХП.

Проведенный анализ корреляционных взаимосвязей между величинами главных компонент и другими исследованными клинико-иммунологическими параметрами продемонстрировал, что выявленные “латентные” факторы (количественно оцененные в виде значений главных компонент) в отличие от исходных “стандартных” параметров иммунного статуса отражают ключевые свойства и состояние иммунной системы как целостной структуры. Так, наиболее значимый по силе влияния на систему иммунитета больных фактор, за-

фиксированный в величине ГК-1, прямо коррелировал с супрессорной активностью сыворотки крови (г = 0,37, р<0,05), а также находился в обратной взаимосвязи с уровнем воспалительной активности сывороточных факторов (г = -0,45, р<0,01) и интенсивностью спонтанной продукции 1Ь-1(3 (г = -0,39, р<0,05).

Второй по степени воздействия на состояние иммунной системы фактор, количественно выраженный ГК-П, был тесно ассоциирован с продукцией 1Ь-4/1Ь-2, что проявлялось достоверной прямой (г = 0,39, р<0,05) и обратной (г = -0,47, р<0,01) корреляционной взаимосвязью с интенсивностью спонтанной продукции 1Ь-4 и 1Ь-2 соответственно. Из данных табл. 2 видно, что ГК-Ш и ГК-1У характеризовались примерно равной силой влияния на иммунитет больных (доля контролируемой этими факторами дисперсии составляла 13 и 12 % соответственно). Однако корреляционный анализ выявил для ГК-Ш только одну статистически значимую обратную взаимосвязь с относительным содержанием НЬА-ОЯ+моноцитов (г = -0,38, р<0,05), что, тем не менее, не исключает существования возможных связей ГК-Ш с другими, не исследованными нами параметрами иммунитета. Четвертая компонента, в свою очередь, была сопряжена с уровнем спонтанной и ЦРЗ-индуцированной продукции ТОТ-а /1Ь-1а (коэффициент корреляции варьировал от 0,38 до 0,46, р<0,05) и находилась в обратной зависимости

Табл. 3. ДОСТОВЕРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА И ЗНАЧЕНИЙ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ, 0ПП03ИТНЫХ ПО СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ЭНДОТОКСИКОЗА И ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ

Г руппы больных

Показатель Эндотоксикоз Иммунопаралич

I степени (п=13) III степени (п=12) р, Нет (п=28) Есть (п=9) Р2

ЛИИ расч.ед. 2,2 ± 0,2 7,3 ± 0,7 < 0,01 3,5 ± 0,5 6,9 ± 1,4 < 0,01

Абс. лимфоцитоз х 109/л 2,3 ± 0,2 1,2 ± 0,15 < 0,01 1,95 ± 0,14 1,2 ± 0,2 < 0,05

СопА-индуц. пролиферация имп/мин 36,760 ± 3,290 20,430 ±4,160 < 0,01 29,960 ± 2,620 15,410 ± 3,950 < 0,01

НЬА-РР! моноциты % 37,7 ± 5,3 21,6 ± 3,9 < 0,05 33,0 ± 4,0 19,0 ± 2,1 < 0,05

Спонтанная продукция Т^-а пкг/мл 1,830 ± 290 630 ± 185 < 0,01 1,360 ± 190 260 ± 100 < 0,01

[.РЭ-индуц. продукция Т^-а пкг/мл 2,220 ± 200 775 ± 210 < 0,01 1,820 ± 150 226 ± 81 < 0,01

Спонтанная продукция 11.-1 (3 пкг/мл 510 ± 130 234 ± 174 475 ± 120 160 ± 60 < 0,05

ІРБ-индуц. продукция И-1(3 пкг/мл 1,270 ± 270 451 ± 166 < 0,01 900 ± 160 271 ± 95 < 0,05

ГК-ІУ 0,464 ± 0,221 -0,799 + 0,290 < 0,01 0,205 ±0,165 - 0,638 ± 0,436 < 0,05

Примечание: Р, и Р2 - достоверность различий показателей в группах больных, оппозитных по степени тяжести эндотоксикоза и по наличию состояния иммунопаралича соответственно критерий Стьюдента для независимых выборок).

от степени тяжести эндотоксикоза и выраженности иммунных нарушений (г = -0,5 и -0,52 соответственно, р<0,01).

Таким образом, можно заключить, что многофакторный анализ с использованием метода главных компонент позволил нам заменить “общепринятые”, но вместе с тем малоинформативные параметры иммунного статуса на новые интегративные, ранее скрытые факторы, которые действительно отражают ключевые свойства системы иммунитета больных с ГХП. Так, оценивая только первые четыре компоненты у каждого отдельного пациента и не имея больше никакой дополнительной клинико-иммунологической информации об особенностях его заболевания, можно определить: а) преобладание воспалительных га супрессорных/противовоспалительных факторов в сыворотке крови больного на момент обследования; б) вариант доминирующей продукции 1Ь-2 vs 1Ь-4 и, следовательно, вероятный тип Т-хел-перной активности; в) выраженность проявлений основных патогенетических синдромов, характерных для гнойно-хирургической патологии - синдромов эндогенной интоксикации и вторичной иммунной недостаточности.

Для иллюстрации данного заключения в табл. 3 представлены значения отдельных показателей иммунного статуса и величины ГК-1У, которые достоверно различались у больных со средней (I) и крайне тяжелой (III) степенью эндотоксикоза, а также у пациентов оппозитных по развитию состояния иммунопаралича, клинико-иммунологические критерии которого нами были охарактеризованы ранее [10].

На следующем этапе предполагалось на основе дискриминантного анализа оценить возможность использования главных компонент для оценки баланса продукции 1Ь-2/1Ь-4 и вероятностной диагностики доминирующего типа Т-хелперной активности.

ЭКСПЕРТНАЯ ОЦЕНКА ТИПА ДОМИНИРУЮЩЕЙ Т-ХЕЛПЕРНОЙ АКТИВНОСТИ

Для более точной экспертной оценки характера продукции 1Ь-2/1Ъ-4 и выявления тина доминирующей Т-хелперной активности на предварительном этапе был проведен квантильный анализ индивидуальных значений продукции 1Ь-2 и 1Ь-4 здоровыми донорами (п=16) и больными с ГХП (п=37 ). В результате были определены диапазоны уровня секреции 1Г-2/1Ь-4 , в соответствии с которыми каждый из обследованных больных был отнесен в одну из подгрупп с доминирующей ТЫ, ТЬ2 или ТЫ) активностью. Так, в подгруппу с преобладанием активности ТЫ клеток были выделены случаи, при которых интенсивность продукции 1Ь-4 выходила за нижнюю границу диапазона квантильных отклонений (< Ь(},

т.е. < 450 пкг/мл), тогда как продукция IL-2 превышала величину средних значений общей выборки (> Mean , т.е. > 670 пкг/мл). Оппозитную подгруппу с преобладающей Th2 активностью составили больные, у которых, наоборот, продукция IL-2 выходила за нижнюю границу диапазона квантильных отклонений (< LQ, т.е. < 80 пкг/мл), при этом продукция IL-4 была выше средней величины (> Mean , т.е. > 740 пкг/мл). И, наконец, в подгруппу с ThO вариантом хелперной активности были выделены случаи, при которых интенсивность продукции IL-2 и IL-4 оставалась в рамках средних диапазонов.

Из 37 пациентов с диагностированным таким образом типом Т-хелперной активности примерно 2/3 больных (п=23) были включены в, так называемые, “обучающие” выборки, а оставшиеся 14 человек составили отдельную группу для последующего анализа частоты совпадений экспертной и программной оценки той или иной активности Т-хелперов.

На рисунке 1 видно, что больные, разделенные в результате экспертной оценки на три подгруппы и выделенные в состав “обучающих” выборок, четко различаются по характеру спонтанной продукции IL-2/IL-4. Так в группе с доминирующей ТЫ- активностью (п=8) уровень продукции IL-2 в 2 раза превышал средние значения здоровых доноров и 10-крат -но превалировал над уровнем спонтанной продук-

□ IL-2

IL-4

250

£200

3

5

о.

о

t 150

х

О)

100

X

о

03

О

5- 50

214

108

22

Th1

Th2

ThO

Рис. 1. Характер продукции 11-2 и И-4 в подгруппах больных с различными типами доминирующей Т-хелпер-ной активности, сформированными на основе экспертной оценки.

Здесь и на рисунке 2 данные представлены в виде относительной величины от среднего уровня спонтанной продукции И-2 и 11.-4 в культурах МНК здоровых доноров (п=16), принятого за 100 %.

Табл. 4. ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОГО СТАТУСА И ЗНАЧЕНИЙ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ В ПОДГРУППАХ БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ДОМИНИРУЮЩЕЙ Т-ХЕЛПЕРНОЙ АКТИВНОСТИ, СФОРМИРОВАННЫМИ НА ОСНОВЕ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ

Показатель Тип доминирующей Т-хелперной активности

Th1 (п=8) Th2 (п=6) ThO (п=9) Р

АЛ х 109/л 1,56 ± 0,2 1,73 ± 0,41 1,78 ± 0,34

СОЗТ-клетки % 72,5 ± 4,8 77,0 ± 2,0 68,6 ± 4,8

С04+Т-клетки % 30,5 ± 3,9 53,8 ± 2,9 41,4 ± 5,0 Р,<0,01

СМТклетки % 31,1 ± 6,9 36,8 ± 3,7 26,8 ± 3,9

CD4/CD8 1,4 ± 0,32 1,5 ± 0,2 2,0 ± 0,5

С072+В-клетки % 8,5 ± 1,1 15,0 ± 2,4 22,6 ± 4,8 Р,<0,05 Р2<0,01

IgA г/л 1,86 ± 0,2 3,42 ± 0,7 2,89 ± 0,71 Р,<0,05

IgM г/л 1,92 ± 0,46 1,57 ± 0,12 1,28 ± 0,31

IgG г/л 11,5 ± 2,1 32,6 ± 7,2 17,9 ± 2,5 Р,<0,01 Р3<0,05

ГК-I - 0,102 ± 0,589 0,790 ± 0,302 - 0,596 ± 0,759

ГК-П - 1,386 ± 0,355 1,274 ± 0,502 0,370 ± 0,484 Р,<0,01 Р2<0,01

ГК-Ш - 0,229 ± 0,404 - 0,133 ± 0,305 0,473 ± 0,428

ГК-IV - 0,413 ± 0,472 - 0,202 ± 0,324 0,185 ± 0,398

ГК-V - 0,008 ± 0,372 0,222 ± 0,385 - 0,079 ± 0,378

ГК-VI 0,072 ± 0,221 0,486 ± 0,402 - 0,153 ± 0,286

ГК-VII - 0,243 ± 0,244 0,522 ± 0,306 - 0,271 ±0,153 Р3<0,05

ГК-VIII - 0,275 ±0,152 - 0,071 ±0,168 0,239 ± 0,243

ГК-1Х 0,033 ±0,151 - 0,108 ± 0,075 0,192 ± 0,158

Примечания: Р, - достоверность различий в показателях между группами 77?/ vs Ш, Р2~ достоверность различий между группами ТЫ ю Ш, и Р3- достоверность различий между группами Ш 1« Ш Ц-критерий Стьюдента для несвязанных выборок).

ции IL-4. В оппозитной подгруппе (п=6) с доминирующей ТЬ2-активностью секреция IL-2 была минимальной и составляла 2 % от уровня нормы, тогда как интенсивность продукции IL-4 оставалась сохранной. Среди больных с ThO-активностью (п=9) столь ярких различий в характере секреции IL-2 и IL-4 не обнаруживалось.

Данные табл. 4 наглядно демонстрируют, что больные из “обучающих” выборок различались не только по уровню и соотношению продукции IL-2/IL-4, но и по ряду других “стандартных” показателей иммунограммы, выраженных как в абсолютных значениях, так и в величинах главных компонент. Пациенты с преобладающей ТЬ2-ак-тивностью отличались от больных с ТЫ типом увеличением относительного количества CD4+T-лимфоцитов и сывороточного IgG, концентрация которого также достоверно превышала средние значения в подгруппе с ThO вариантом хелпер-ной активности. Характерным признаком для больных с доминирующей ТЫ-активностью являлось умеренное снижение концентрации IgA и резкое уменьшение количества С072+В-лимфоци-тов, что отличало их от всех остальных пациентов. Дополнительные различия между Thl, Th2 и ThO подгруппами обнаруживались также в величинах ГК-11 и ГК-VII.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИПА Т-ХЕЛПЕРНОЙ АКТИВНОСТИ МЕТОДОМ ДИСКРИМИНАНТНОГО АНАЛИЗА

Для разработки диагностического правила, в соответствии с которым определялся тот или иной тип Т-хелперной активности, был проведен дискриминантный анализ больных из “обучающих” выборок с использованием четырех главных компонент (ГК-1, ГК-П, ГК-1У и ГК-УП). Отбор именно этих компонент был обоснован их прямой (для ГК-П) или опосредованной (для ГК-1, ГК-1У и ГК-VII) взаимосвязью с типом Т-хелперной активности. Результаты дискриминантного анализа показали, что величины главных компонент, полученные в результате многомерного анализа “стандартных” показателей иммунограммы, позволяют с высокой эффективностью ((2 < 0,001) распознавать соответствующий тип Т-хелперной активности. Процедура автораспознавания пациентов с априорно известным вариантом продукции цитокинов показала правильное их выявление с точностью 87,5,100 и 88,9 % в подгруппах с доминирующей ТЫ, ТИ2 и ТЬО активностью соответственно.

Контрольный дискриминантный анализ больных (п=14), которые не вошли в “обучающие” выборки, показал высокую частоту совпадений экспертной и программной оценки соответствующего типа Т-хел-перной активности (р<0,05). При этом коэффици-

ент конкордации Кендалла [16] , характеризующий согласованность оценок, полученных экспертным путем и выявленных в результате дискриминантной классификации, составил ¥=0,90 ( величина \¥=1,0 свидетельствует о полном совпадении экспертных и программных оценок).

Все обследованные пациенты с ГХП, разделенные в результате классификационной процедуры на три подгруппы, четко различались по характеру спонтанной продукции И-2/1Ь-4 (рис. 2). Видно, что в группе с доминирующей ТЫ- активностью (п=12) продукция И-2 более чем в 4 раза превышала уровень секреции 1Ь-4 . В оппозитной подгруппе (п=12) с доминирующей ТЬ2- активностью интенсивность продукции И-4 была в 5 раз выше соответствующих значений 1Ь-2 секреции, тогда как у больных с ТЬ0 -активностью (п=13) уровни продукции 1Ь-2 и 1Ь-4 практически не различались.

Пациенты с определенным типом Т-хелперной активности, которые были отнесены в соответствующие подгруппы после проведения дискриминантного анализа, сохранили, в целом, свои характерные отличия по “стандартным” показателям иммунограммы и величинам ГК-П и ГК-VII ( табл. 5), которые были выявлены на предварительном этапе при сравнительном анализе больных из “обучающих” выборок (см. табл. 4). Таким образом, полу-

□ И-2 ■ И-4

г

о.

о

X

Н

о

(К

со

X

п

Л

X

ф

ка

О

о.

ТЬО

Рис. 2. Характер продукции И-2 и И-4 в подгруппах больных с различными типами доминирующей Т-хелпер-ной активности, сформированными в результате дискриминантного анализа.

Табл.5. ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОГО СТАГ/СА И ЗНАЧЕНИЙ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ В ПОДГРУППАХ БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ДОМИНИРУЮЩЕЙ Т-ХЕЛПЕРНОЙ АКТИВНОСТИ, СФОРМИРОВАННЫМИ В РЕЗУЛЬТАТЕ ДИСКРИМИНАНТНОГО АНАЛИЗА

Показатель Тип доминирующей Т-хелперной активности

ТМ (п=12) ТТі2 (п=12) Ш (п=13) Р

АЛ х 109/л 1,67 ± 0,16 1,92 ± 0,26 1,78 ± 0,25

С03+Т-клетки % 74,7 ± 4,0 76,0 ± 2,0 68,8 ± 3,6

Сй4+Т-клетки % 29,8 ± 2,7 54,5 ± 1,9 41,0 ± 3,5 Р12<0,01

С08+Т-клетки % 33,5 ± 5,0 33,6 ± 2,3 27,6 ± 2,8

С04/СЭ8 1,2 ± 0,24 1,7 ± 0,15 1,8 ± 0,38

С072+В-клетки % 8,4 ± 0,9 17,3 ± 2,6 21,5 ± 3,9 Р12<0,01

ІдА г/л 2,05 ± 0,26 3,0 ± 0,5 2,67 ± 0,49

ІдМ г/л 1,87 ± 0,33 1,35 ± 0,11 1,34 ± 0,22

ІдЄ г/л 12,3 ± 2,3 27,8 ± 4,5 18,5 ± 1,8 Р,<0,01 Р23<0,05

ГК-І 0,273 ± 0,467 0,263 ± 0,254 - 0,496 ± 0,523

ГК-П - 1,306 ± 0,252 1,084 ± 0,323 0,205 ± 0,342 Р,<0,01 Р2<0,01

ГК-ІІІ - 0,317 ± 0,302 - 0,185 ± 0,254 0,464 ± 0,329

ГК-IV - 0,225 ± 0,323 0,055 ± 0,289 0,156 ± 0,293

ГК-У - 0,061 ± 0,277 0,191 ± 0,203 - 0,120 ± 0,297

ГКЛ/І 0,068 ±0,186 0,053 ± 0,240 - 0,112 ± 0,222

ГК-М - 0,397 ±0,175 0,508 ± 0,200 - 0,102 ± 0,127 Р,<0,01 Р3<0,05

ГК-УМ! - 0,112 ± 0,146 - 0,041 ±0,122 0,142 ± 0,181

ГК-IX 0,009 ±0,103 - 0,101 ± 0,053 0,103 ± 0,123

Примечания: Р1 - достоверность различий в показателях между группами 7711 к? 77)2г Р2 - достоверность различий между группами 77?/ № Ш, и Р3 - достоверность различий между группами ТЬ2 ку Ш (¡-критерий Стьюдента для несвязанных выборок).

ченные результаты демонстрируют высокую эффективность предложенного подхода для оценки баланса продукции IL-2/IL-4 и диагностики доминирующего варианта Т-хелперной активности. При этом непосредственное измерение продукции цитокинов необходимо только на этапе формирования “обучающих” массивов, тогда как последующая идентификация преобладающего типа активности Т-хелперов может быть выполнена в результате многомерного математического анализа “стандартного” набора показателей иммунного статуса.

Обсуждение

Проведенные нами клинико-иммунологические исследования хирургических больных с различными нозологическими формами гнойной инфекции выявили у них вторичный иммунодефицит в виде сочетанных нарушений функциональной активности Т-лимфоцитов и моноцитов, что хорошо согласуется с известными литературными данными [13, 21]. В то же время установлена низкая информативность простых и легко воспроизводимых методов “традиционного” исследования иммунного статуса, которые не позволяют охарактеризовать уровень дефектов системы иммунитета в целом по группе обследованных пациентов, что обусловлено, по-видимому, исходной гетерогенностью больных с ГХП. В свою очередь, латентные факторы, обнаруженные в результате многомерного анализа “стандартных” показателей иммунограммы и зафиксированные в величинах главных компонент, более четко отражают ключевые свойства и состояние иммунной системы как целостной структуры.

Оценивая у больного индивидуальные значения первых четырех компонент, которые визуализируют ранее скрытые и наиболее сильно влияющие на иммунную систему факторы (суммарная доля контролируемой ими общей дисперсии составляет 75 %), можно даже при отсутствии дополнительной клини-ко-иммунологической информации составить определенное представление о патогенетических особенностях течения инфекционно-воспалительного процесса у конкретного больного на момент обследования. Величина ГК-I, находящаяся в обратной корреляционной взаимосвязи с уровнем воспалительной активности сыворотки крови и непосредственно ассоциированная с супрессорной активностью гуморальных факторов, свидетельствует, очевидно, о соответствующей фазе биологического ответа организма на бактериальную агрессию - доминирующем системном воспалительном (SIRS) или противовоспалительном (CARS) синдроме [19,20]. Отрицательное значение ГК-I указывает на смещение баланса воспалительных и противовоспалительных реакций

за счет чрезмерной продукции провоспалительных медиаторов, тогда как максимальная величина ГК-1 отражает, по-видимому, вариант несбалансированного течения CARS-cиндpoмa, который, как правило, завершается развитием иммуносупрессии различной степени выраженности.

Второй по силе влияния на иммунитет больных с ГХП фактор, количественно выраженный в величине ГК-П, находился в прямой и обратной корреляционной взаимосвязи с интенсивностью продукции 1Ь-4 и 1Ь-2 соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о роли данного фактора в определении варианта доминирующей продукции 1Ь-2 ул- 1Ь-4 и, следовательно, наиболее вероятного типа Т-хелперной активности, и, во-вто-рых, дополнительно подтверждают хорошо известный антагонизм цитокинов, продуцируемых ТЫ и ТЬ2-клетками [24].

Нами была выявлена только одна статистически значимая обратная взаимосвязь между фактором, зафиксированным в величине ГК-Ш, и содержанием HLA-DR+ моноцитов. Между тем этот латентный фактор контролирует примерно 13 % всех событий происходящих в иммунной системе больного, поэтому нельзя исключать его сопряженности с какими-то другими, не исследованными нами параметрами иммунитета, например, с количеством и/или функциональной активностью нейт-рофилов. Данный пример еще раз показывает, что многомерный математический анализ с использованием метода главных компонент позволяет нам обнаружить и ранжировать по силе влияния на иммунную систему ранее скрытые факторы, причем сделать это даже в том случае, если существующий объем знаний и/или проведенных исследований не позволяет нам их четко интерпретировать. Важно констатировать, что выявленные латентные факторы существуют объективно и вносят свой вклад в разнообразие состояний иммунитета в норме и патологии, и, конечно же, при условии более полной оценки процессов, протекающих в иммунной системе, могут быть охарактеризованы достаточно точно.

Интересную информацию о состоянии больного с гнойно-хирургической патологией содержит в себе четвертая главная компонента. Величина ГК-1У отражает не только количественные (интенсивность спонтанной и ЬР8-индуцированной продукции ТМР-а/ТЬ-1|3), но и качественные характеристики развития инфекционно-воспалительного процесса, такие как степень тяжести эндотоксикоза и выраженность иммунных нарушений. Противоположная направленность корреляционных взаимосвязей между ГК-ГУ и этими количественными и качественными параметрами показывает, что повышенный уровень продукции ТОТ-аЛИр не ассоциируется с крайними проявлениями или про-

грессией эндотоксикоза у больных с ГХП. Напротив, именно недостаточная продукция провоспа-лительных цитокинов сопряжена с нарастанием степени тяжести эндогенной интоксикации и иммунодепрессии, что, по-видимому, отражает преобладание в организме больного противовоспалительных реакций, которые приводят к подавлению иммунитета (вплоть до развития состояния иммунопаралича) и снижают эффективность защиты от инфекции. Проведенный сравнительный анализ пациентов, оппозитных по степени тяжести эндотоксикоза, и по развитию состояния иммунопаралича четко продемонстрировал их различия в отношении как отдельных показателей иммунного статуса, так и величины ГК-IV.

Таким образом, можно утверждать, что, используя методы системного анализа и заменяя “общепринятые”, но вместе с тем малоинформативные показатели иммунного статуса новыми, интегративными параметрами, выраженными в величинах главных компонент, мы можем получить более точные, комплексные характеристики состояния иммунитета у каждого конкретного больного в реальный момент времени. Совершенно очевидно, что методология системного анализа открывает перспективы по классификации тех или иных иммунопатологических процессов, поскольку в качестве классификационных признаков выделяет основные, самые важные факторы, детерминирующие взаимосвязанное реагирование различных элементов иммунной системы. Так, в частности, распознавание варианта доминирующей Т-хелперной активности у больных с ГХП методами системного анализа позволяет оценить закономерности активации и переключения ТЫ- и ТЬ2-клеток и дополнить этими знаниями существующие классификационные характеристики иммунитета в динамике инфекционно-воспалительного процесса. Доступная и оперативная информация о ключевых параметрах иммунного реагирования, таких как, например, баланс продуцируемых цитокинов Т1 и Т2 типа^-безуслов-но, повышает эффективность прогноза течения и исхода заболеваний, а также может быть использована для обоснования выбора корригирующей иммунотерапии.

Благодарности

Авторы выражают искреннюю благодарность д.м.н. Кожевникову B.C. за помощь в проведении цитофлюорометрических исследований, а также к.м.н. Пальцеву В.А. за высококвалифицированное обеспечение клинического раздела работы.

Список литературы

1. Айвазян С.А., Бухштабер В.М., Ешоков И.С., Мешалкин Л.Д. Прикладная статистика: Классифи-

кация и снижение размерности.- М.: Финансы и статистика, 1989.- 607 с.

2. Брискин Б.С., Савченко З.И. Иммунная недостаточность у больных с хирургической инфекцией //Врач,- 1994,- № 12,- С. 5-8.

3. Булава Г.В., Никулина В.П. Оценка эффективности иммуномодуляторов при лечении больных с гнойно-септическими послеоперационными осложнениями// Хирургия.- 1996.- № 2.- С. 104-107.

4. Дубров А.М. Обработка статистических данных методом главных компонент,- М.: Статистика, 1978.-135 с.

5. Ефимов В.М., Галактионов Ю.К. О возможности прогнозирования циклических изменений численности млекопитающих // Журн. общ. биологии,-1983,- №3,- С. 343-352.

6. Животовский Л.А. Интеграция полигенных систем в популяциях. Проблемы анализа комплекса признаков,- М.: Наука, 1984.- 183 с.

7. Кендалл М.Дж., Стьюарт А. Многомерный статистический анализ и временные ряды. - М.: Наука, 1976,- 736 с.

8. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. Санкт-Петер-бург, Гиппократ,- 1992, 256 с.

9. Кожевников B.C., Киселев С.В. Перспективы использования методов оценки внутриклеточной экспрессии молекул цитокинов для иммунодиагностики // Бюл. СО РАМН,- 1988,- № 2,- С. 50-54.

10. Козлов В.А., Останин A.A., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Пальцев A.B., Черных Е.Р. Экстракорпоральная иммунотерапия в коррекции состояния “иммунопарализиса” у больных с хирургической инфекцией // Int. J. on Immunorehabilitation .-1997.-№6,- C. 135-138.

11. Лебедев K.A., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике.- М.: Наука, 1990.- 224 с.

12. Лозовой В.П., Шергин С.М. Структурно-функциональная организация иммунной системы.- Новосибирск.: Наука, 1981,- 229 с.

13. Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций // Int. J. on Immunorehabilitation.-1998,- № 10,- C. 86-99.

14. Славин M.Б. Методы системного анализа в медицинских исследованиях.- М.: Медицина, 1989.-304 с.

15. Фрейдлин И.С. Цитокины в клинике // В кн.: Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. 2-ой Нац. Конгресс РААКИ,- Москва, 1998.- С. 104-112.

16. Хеттманспергер Т. Статистические выводы, основанные на рангах,- М.: Финансы и статистика, 1987,- 218 с.

17. Чаленко В.В., Кутушев Ф.Х. Эндогенная интоксикация в хирургии // Вести, хирургии,- 1990.-№ 4,- С. 3-8.

18. Ярилин А.А. Молекулярные основы межклеточной кооперации при иммунном ответе //В кн.: Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. 2-ой Нац. Конгресс РААКИ.- Москва, 1998.- С. 59-80.

19. Bone R.C., Grodzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process // Chest-1997.- Vol. 112, № 1,- P. 235-242.

20. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS // Crit. Care Med.- 1996,- Vol. 24, № 7,- P. 1125-1128.

21. Docke W-D., Randow F., Syrbe U., et al. Monocyte deactivation in septic patients: restoration by IFN-y

treatment // Nature Medicine.- 1997,- Vol. 3, № 6,- P. 678-681.

22. Le Gall J.R., Lemeshow S., Saulnier F. A new simplified acute physiology score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study // J.A.M.A.-

1993.- Vol. 270,- P. 2957-2963.

23. Mandell G.L. Role of neutrophils in bacterial infections - pneumonia and sepsis.- Amgen inc. USA,

1994,- P. 7-40.

24. Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more // Immunol. Today.- 1996,- Vol. 17, № 3,- P. 138-146.

поступила в редакцию 31.12.1999 отправлена на доработку 27.02.2000 принята к печати 31.05.2000