CC BY
109
УДК 664:543 Табл. 2. Ил. 1. Библ. 10.
ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И АККУМУЛЯЦИИ БИОГЕННЫХ АМИНОВ В МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ
Куликовский А.В., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук, Николаева А.С., Князева А.С.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
INTENT AND ACCUMULATION OF BIOGENIC AMINES IN MEAT PRODUCTS
Kulikovskii A.V., Ivankin A.N., Nikolaeva A.S., Knyazeva A.S.
The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
биогенные амины, кадаверин, тирамин, гистамин, ВЭЖХ масс-спектрометрия
Реферат
Биогенные амины являются продуктами распада аминокислот и могут служить индикаторами порчи продуктов питания. Накопление биогенных аминов зависит от гигиенического качества сырья и ингредиентов, технологических процессов производства (копчение, ферментация), условий хранения. Содержание биогенных аминов не нормируется в нормативных документах РФ, отсутствуют аттестованные методики их определения. Проведенные исследования позволили подобрать условия хроматогра-фического разделения и масс-спектрометрической идентификации гистамина, кадаверина и тирамина. По результатам работ получены данные относительно содержания биогенных аминов в различных группах мясной продукции.
Keywords:
biogenic amines, cadaverine, tyramine, histamine, HPLC, mass spectrometry
Summary
Biogenic amines are the products of the disintegration of amino acids, and may serve as indicators of food spoilage. The accumulation of biogenic amines depends on the hygienic quality of raw materials and ingredients, manufacturing processes (smoking, fermentation), storage conditions. The content of biogenic amines is not specified in the regulations of the Russian Federation, there are no certified methods of their determination. The research allowed to choose the conditions of chromatographic separation and mass spectrometric identification of histamine, tyramine and cadaverine. As a result of the work provided data on the content of biogenic amines in different groups of meat products.
Введение
иогенные амины образуются в процессе декар-боксилирования аминокислот. Реакции декар-боксилирования в отличие от других процессов промежуточного обмена аминокислот являются необратимыми. Они катализируются специфическими ферментами — декарбоксилазами аминокислот, простетическая группа которых представлена пиридоксальфосфатом [10]. В зону риска накопления биогенных аминов попадают пищевые продукты, кулинарная готовность которых, достигается низкотемпературными режимами обработки (холодное копчение, соление, вяление) [2]. Факторами, влияющими на образование биогенных аминов в продуктах, являются: доступность свободных аминокислот; наличие микроорганизмов, которые могут декарбоксилиро-вать аминокислоты; благоприятные условия для развития данной микрофлоры и продуцирования ее ферментов [3]. Обычно биогенные амины образуются при порче пищевой
продукции, при этом существует риск накопления токсической дозы гистамина (свыше 100 мг/кг продукта) еще до того, как появятся органолептические изменения свежести [4]. Согласно техническому регламенту Таможенного союза допустимая доза гистамина в рыбной продукции (в том числе в рыбных консервах) из тунца, скумбрии, лосося и сельди, допускается не более 100 мг/кг. А в ры-борастительных консервах из тех же видов рыб не более 40 мг/кг.
Биогенные амины образуются в процессе ферментации (например, созревании сыра, хранения и производства продукции из мяса и рыбы, сбраживания вина, производства пива) [5]. Следует отметить, что из всех известных биогенных аминов наиболее изучены такие, как серото-нин, тирамин и гистамин, обладающие сосудосуживающим эффектом. В неферментированных продуктах питания, наличие биогенных аминов выше определенного уровня рассматривается как маркер качества, поскольку свиде-
ВСЕ О МЯСЕ №5 | 201G
тельствует о нежелательной активности микроорганизмов и нарушении технологии производства продукта [6, 7].
Для измерения концентрации биогенных аминов используется ряд современных биохимических и иммуно-химических методов, пришедших на смену недостаточно чувствительному колориметрическому определению. К ним относятся высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуоресцентным, электрохимическим и масс-спектрометрическим детектором и газовая хроматография (ГХ) с масс-спектрометрическим детектором [8].
Биогенные амины играют важную роль в качестве источника азота и являются предшественниками для синтеза гормонов, алкалоидов, нуклеиновых кислот, белков и др. [9]. Однако пищевые продукты, содержащие большое количество биогенных аминов, могут быть токсичными [1].
Методы исследований
Для оценки содержания биогенных аминов была разработана методика масс-спектрометрической идентификации с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1200 (США] и 3-х квадрупольного масс-спектрометра Agilent 6410B. Хроматографическое разделение проводили на колонке 150 x 2.1 мм Cogent Diamond Hydride column 100A (4 мкм), в режиме градиентного элюирования условия при 30 °С. Расход подвижной фазы 0.4 мл/мин. Объем вводимой пробы 1 мкл (таблица 1).
Ионизацию проводили распылением в электрическом поле, оптимизировали параметры масс-спектрометри-ческого детектирования: температура источника 100°С; температура газа для десольватации 400 °С; расход газа для десольватации 12 л/мин; давление иглы распылителя 45 psi (3.1 Бар).
Условия детектирования оптимизировали в ручном режиме. Напряжение фрагментации определяли варьируя с шагом 5 В по максимальному отклику протонированного молекулярного иона, энергию диссоциации оптимизировали с шагом 1 В по максимальному отклику характерного дочернего иона, при этом, соотношение сигнал/шум молекулярного иона должно быть не менее 1:10. Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций представлены в таблице 2.
Биогенные амины идентифицировали по абсолютному времени удерживания хроматографических пиков целевых веществ, регистрируемых в режиме мониторинга множественных реакций. С использованием средств программного обеспечения MassHunter Workstation (Agilent, США) строили градуировочные зависимости площади пика
Таблица 1. Условия хроматографического определения
Время, мин А, об. % В, об. %
0 30 70
2 35 65
6 90 10
8 90 10
9 30 70
А: 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде В: 0,1 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле
от концентрации вещества в пробе. Коэффициент линейной корреляции полученных градуировочных зависимостей составил не менее 0.99.
На рисунке 1 представлена хроматограмма подбора условий масс-спектрометрической регистрации дочерних йонов тирамина с энергией диссоциации от 0 до 50 В.
Из представленной хроматограммы видно насколько сильно могут влиять настройки масс-спектрометра на фрагментацию вещества и интенсивность полученных ионов. Оптимизация условий детектирования позволяет достичь предела количественного обнаружения на уровне 0,1 ррЬ. За счет селективности детектора исключается возможность наложения перекрёстных пиков, как это может происходить с использованием классического спектрофотометрическо-го детектора. Однако нельзя исключать влияние матрицы на подавление общего ионого тока. Для минимизации эффекта матрицы и повышения чувствительности перспективным является использования специфических процедур подготовки проб, таких как твердофазная экстракция (ТФЭ). Помимо очистки процедура ТФЭ позволяет сконцентрировать биогенные амины за счет перевода анализируемых соединений из большого объема жидкой матрицы в твердую фазу концентрирующего сорбента.
В настоящее время наиболее широко используемым методом определения биогенных аминов является метод ВЭЖХ. Метод основан на экстракции биогенных аминов вместе с аминокислотами, растворами органических кислот из субстрата, с последующим применением полученного экстракта для хроматографического определения.
Поскольку детектирование биогенных аминов как таковых затруднено, в данном методе используется пред- или постколоночная дериватизация - получение производных анализируемого вещества, обладающих иными аналитическими свойствами (иным УФ-спектром или флуоресценцией). Несомненным преимуществом жидкостной масс-спек-трометрии при определении биогенных аминов перед флуоресцентным и спектрофотометрическим (УФ-детек-тором) детектором является исключение процедуры дери-ватизации, сильно влияющей на сходимость результатов исследований. Недостатком газовой масс-спектрометрии в случае определения биогенных аминов является присутствие в пробе термолабильных веществ, которые могут искажать сигнал детектора.
Таким образом, возможности разделения, однозначность идентификации делают оптимальной техникой для исследования биогенных аминов метод жидкостной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС). Несомненным пре-
Таблица 2. Условия в режиме мониторинга множественных реакций ионизации распылением в электрическом поле с регистрацией положительных ионов
Аналит Ион-пред-шествен-ник, m / z Ион-продукт, m / z Потенциал фрагментации, В Энергия диссоциации, В
Гистамин 112,1 4 9 ,1 ,1 45 16 24
Кадаверин 103,1 86,2 41,1 35 8 20
Тирамин 138,1 121,3 77,1 70 4 32
2D16 | №5 ВСЕ О МЯСЕ
•€3 Р1САС к» №«4 }17аи. Гив-ЛЛОЯ 1 -> Ч с«й!.ГС**;>ГЭ„Са 3
1И1
II Л
>< ! г : у* '£3 ЛпЬС к» [ОДИЛУги. й Рг*^ Р/С055 0 !>й I lpraJJMi.t73.CSJ : 1 Т'"1 " М 1 1 1 II '1 41
] 1} •
!
а II •
у Т 911 1С11 11*1
I4 г : > У 11
/1Л 1 *
ь^кг 03$« л?«* а юн! сое» до 1 ■»-> вгиим^свс 1 П1
511 «51 II Ш А •
«13 *«х:кг южс И7вт ЯкюЗ НССе<аДО1 -П № т
: • 5 Л И1 9П •
£3 Ркйл кг. (433-0 Л 7тц Я кла] Рц^ТИМ СВДС ДО1 ->
| 771
J | IV •
. . _.......... . . . . . . ...'...
444 44 й й о ы » ы й> й я Л ;1 в |1 и в н <Ь в » * я Й Й Л & ^ 1л [и 111 н Й Й Л Л ы ЙЛ ^ ]!( им 1« 1ЙЙ 111& \И 1Й АА Й А >!■ Й 1Й № Ф г!) 1к * 11« 1Ё & Й А а!
л:: ИнугККгзс^'О
Рисунок 1. Хроматограмма градуировочного раствора тирамина — общий ионный ток и дочерние ионы (потенциал фрагментации — 70 В, энергия диссоциации от 0 до 50 В)
имуществом метода является высокая чувствительность по отношению к исследуемым компонентам. Режим селективного ионного детектирования исключает возможность ложноположительных результатов в случае присутствия в пробах веществ, дающих перекрестные сигналы. Режим мониторинга дочерних ионов дает возможность идентификации искомого соединения даже при совпадении их молекулярных масс.
Результаты исследования и их обсуждение
Предварительно проведенные исследования показали, что в копченных мясных продуктах концентрация ги-стамина и тирамина выше по сравнению с продукцией не подвергнутой копчению. При том наиболее индикаторным является повышение содержания гистамина в процессе созревания колбас. Концентрация биогенных аминов в колбасе зависит от времени ее созревания, а также от декарбоксилазной активности естественной микрофлоры, используемой при производстве данного вида колбас и качества сырья. Содержание гистамина и тирамина так же увеличивается в процессе хранения. Большинство продуктов, в которых развиваются молочнокислые бактерии, содержат значительное количество кадаверина, тирамина и гистамина. Содержание кадаверина может увеличиваться от 10 мг/кг до 200 мг/кг, в зависимости от условий хранения и типа обработки продукции. Примеси растительных белков в рецептурах мясных продуктов несколько снижают уровень содержания кадаверина, выделяющегося в процессе хранения.
Гигиеническое качество сырья и ингредиентов — это один из главных факторов для снижения микробного обсеменения и поэтому представляет критическую точку при контролировании продуцирования биогенных аминов в ферментированных мясных продуктах. Несмотря на необходимость гигиенической чистоты сырья, контроль
аминопродуцирующей способности эндогенных микроорганизмов более важен. Поэтому применение стартовых культур для предотвращения накопления биогенных аминов наиболее приемлемый технологический прием, при условии, что стартовая микрофлора будет ингибировать рост аминогенных микроорганизмов и при этом, сама не будет продуцировать биогенные амины.
Заключение
Производство безопасных продуктов невозможно без изучения путей метаболизма белков и механизмов действия органических контаминантов. Изучение химического состава пищи требует применения селективных и высокоточных методов, позволяющих оценить качество и безопасность сырья и готовой продукции.
Проведенные исследования позволят использовать кадаверин и тирамин в качестве «маркерных веществ» для разработки масс-спектрометрической методики определения биогенных аминов в мясе и мясной продукции. Ш
© КОНТАКТЫ:
Куликовский Андрей Владимирович V +7 (495) 676-79-61 а [email protected]
Иванкин Андрей Николаевич а [email protected]
Николаева Анна Сергеевна а [email protected]
Князева Александра Сергеевна а [email protected]
ВСЕ О МЯСЕ №5 | 201Б
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. Иванкин А.Н. Биогенные метаболиты в системе экологического мониторинга безопасности сырья и продовольствия / Иванкин А.Н., Костенко Ю.Г., Кузнецов А.В., Неклюдов А.Д., Бершова Т.М., Попова Н.В., Дмитриев М.А. // Экологические системы и приборы. - 2004. - № 8. - С. 5-11. Ivankin A.N. Biogenic metabolites in the system of ecological monitoring of raw materials and food safety / Ivankin A.N., Kosten-ko Y.G., Kuznetsov A.V., Nekludov A.D., Bershova T.M., Popova N.V., Dmitriev M.A. // Ecological systems and devices. — 2004. — № 8. — P. 5—11.
2. Юсупов Е.В. Экологические маркеры и их взаимосвязь с качеством сырья животного происхождения и продуктов на его основе. / Юсупов Е.В., Бершова Т.М., Макаров Н.В., Иванкин А.Н. // 11 Сб. докладов Первой международной научно-практической конференции «Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасности наноча-стиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах». МГУПП. - Москва, 2009. - С. 185-191. Yusupov E.V. Environmental markers and their relationship to the quality of animal raw materials and products based on it. / Yusupov E.V., Bershova T.M., Makarov N.V., Ivankin A.N. // 11 Coll. Report of the First International Scientific and Practical Conference "The identification of adulterated food products. Control of content and safety of nanoparticles in agricultural products and foodstuffs. " MGUPP. — Moscow, 2009. — P. 185-191.
3. Морковникова М. Биогенные амины как показатель качества процесса пивоварения/ Марковникова М., Белодедова А. //Индустрия напитков. - 2009. - №5. - С. 20-23. Morkovnikova M. Biogenic amines as an indicator of the quality of brewing / Markovnikov M., Belodedova A. // Beverage Industry. — 2009. — № 5. — P. 20-23.
4. Панов Д.К. Накопление биогенных аминов при производстве сырокопченых и сыровяленых колбас / Панов Д.К., Патие-ва С.В. // Молодой ученый. - 2015. - №15. - С. 147-150. Panov D.K. Accumulation of biogenic amines in the production of smoked and jerked sausage / Panov D.K., Patieva S.V. // Young scientist. — 2015. — №15. — P. 147-150.
5. Suzzi, G. Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. / Suzzi, G., Gardini, F. // International Journal of Food Microbiology. -2003. - № 88. - P. 41-54.
6. Santos M. Biogenic amines: their importance in foods // International Journal of Food Microbiology. — 1996. — № 29. — P. 213-231.
7. Kuznetsov A.V. Cadaverin determination in meat and the possibility of using this indicator in meat freshness assessment. / Kuznetsov, A.V., Kostenko, Yu.G., Ivankin, A.N. // In Proceedings 49th International Congress of Meat Science and Technology 25-30 August 2003, Rio, Brazil. - 2003. - P. 283-284.
8. Fernandes, J. O. Combined ion-pair extraction and gas chromatography-mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines, polyamines and aromatic amines in Port wine and grape juice / Fernandes, J. O., Ferreira, M. A. // Journal of Chromatography. — 2000. № 886. — P. 183-195.
9. Aymerich, T. Safety properties and molecular strain typing of lactic acid bacteria from slightly fermented sausages / Aymerich, T., Martin, B., Garriga, M., Vidal-Carou, M. C., Bover-Cid, S., Hugas, M. // J. Appl. Microbiol. — 2006. — № 100. — P. 40-49.
10. Bover-Cid S. Amino acid-decarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages / Bover-Cid S., Hugas M., Izquierdo-Pulido M., Vidal-Carou M. C. // Int. J. Food Microbiol. — 2001. — № 66. — C. 185-189.
МЯСНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
ЭНЦ И КЛОП EJ {И ЧЕС К И Й
ÀIocjuui 'JOIIj
ЭНЦИКЛОПЕДИЧЕСКИМ СЛОВАРЬ МЯСНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Изданный ВНИИ мясной промышленностью «Энциклопедический словарь. Мясная промышленность» служит инструментом для упрощения взаимопонимания специалистов различных специальностей, работающих в сфере производства и оборота мясного сырья и продукции.
Энциклопедический словарь содержит свыше 700 терминов, охватывающих основную терминологию по различным направлениям производства и переработки мяса: убою; первичной переработке скота; оценке качества мяса и продуктов убоя; технологии колбасных изделий; продуктов из мяса; полуфабрикатов; консервов; специализированных мясных продуктов; ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства; свойствам продуктов и их характеристикам; методам оценки качества и безопасности мясной продукции; стандартизации; экономическим вопросам отрасли и др. В словаре в кратком виде представлен обзор научно-технической информации, включающий базовые знания по терминам, накопленным за последние 20-25 лет. В нем приведены современные классификации продуктов убоя, мясной продукции, процессов производства, свойств, методов оценки, показателей (характеристик) качества и безопасности мясного сырья и мясной продукции, колбасных оболочек и консервной упаковки и т.д.
В конце словаря приведен алфавитный указатель терминов, приведены основные показатели качества и безопасности и методы их определения. За интересующей информацией по Энциклопедическому словарю можно обратиться-109316, Россия, Москва, ул. Талалихина, 26, ВНИИМП E-mail: [email protected]. Тел.: +7(495)676-6851.
2D16 | №5 ВСЕ О МЯСЕ
