CC BY
292Физиология
ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ АНТОЦИАНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ЯГОДАХ И ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ ГЕРОПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ
EVALUATION OF ANTHOCYANIN CONTENT IN THE VARIOUS BERRIES AND THEIR POTENTIAL GEROPROTECTIVE ACTIVITY
Д. А. Голубев, В. В. Пунегов, М. В. Шапошников, А. А. Москалев
D. A. Golubev, V. V. Punegov, M. V. Shaposhnikov, А. A. Moskalev
Антоцианы - водорастворимые пигменты растений, относящиеся к фенольным соединениям. Ягоды, такие как жимолость, черника, брусника, клюква, характеризуются высоким содержанием антоцианов. Исследования экстрактов антоцианов на различных моделях показывают, что данные вещества обладают антиоксидантными, антидиабетическими, противоопухолевыми свойствами, защищают от сердечно-сосудистых заболеваний, улучшают зрение, помогают в борьбе с ожирением.
Anthocyanins - are water-soluble coloring pigments of plants belonging to the phenolic group. Berries such as honeysuckle, bilberry, cowberry, cranberries have a high content of anthocyanins. Studies of anthocyanin extracts tested on various models show that mentioned substances have antioxidant and other properties: antidiabetic, аnti-obesity, anti-tumor, protection against cardiovascular diseases, anti-cancer effect and improvement of vision.
Ключевые слова: антоцианы, жимолость, черника, брусника, клюква, геропротекторы.
Keywords: anthocyanins, honeysuckle, bilberry, cowberry, cranberry, geroprotectors.
Введение
Антоцианины (антоцианы) - природные флавоноиды, которые содержатся в клеточном соке цветков, плодов, листьев растений, обусловливают их окрас от красного до фиолетового цвета. Спектры поглощения антоцианов характеризуются максимумами поглощения в области 240-260 нм и 500-540 нм. Также на окрас могут влиять температура и структура самого пигмента. Общая молекулярная структура антоцианов представлена на рис 1.
На сегодняшний день известно около 700 структурно различных антоцианино-вых производных. Антоцианы имеют широкий спектр применения: используются в качестве натуральных красителей, пищевых добавок и лекарственных средств, они обладают антидиабетическими [1], противоопухолевыми [2], противовоспалительными [3], антиоксидантными свойствами [4], а также являются потенциальными геропротекторами. В работе по влиянию антоцианов клюквы на продолжительность жизни Drosophila было выявлено продление средней продолжительности жизни на 10 % [5]. Тест-объект Caenorhabditis elegans был подвержен воздействию
антоцианов из пурпурной пшеницы, продление максимальном и медианнои продолжительности жизни по сравнению с контролем составило 5-10 %, также у этого объекта была увеличена средняя продолжительность жизни на 17 % после обработки антоцианами из плодов шелковицы белой (Morus alba L.) [6, 7].
Рис. 1. Общая структура антоцианов. R1, R2, R3 - радикалы и их положения в формуле
Старение - это сложный многофакторный процесс, характеризующийся постепенной потерей физиологических функций [8]. Старение сопровождается снижением устойчивости организма к различным стресс-факторам среды, таким как эндогенные (например, усиление образования активных форм кислорода) и экзогенные (гипертермия, голодание, окислительный стресс) [9]. Антоцианы, относящиеся к классу полифенольных соединений, способны увеличивать устойчивость клеток к окислительному стрессу за счет антиоксидантной активности и активации экспрессии антиоксидантных ферментов. Работа по влиянию добавок экстракта аронии черноплодной (Aronia melanocarpa) на экспрессию генов SOD1, SOD2 и CAT показала значительное увеличение уровня экспрессии генов данных ферментов [4]. Сверхэкспрессия SOD или CAT по отдельности незначительно увеличивала продолжительность жизни у мух, но сверхэкспрессия обоих ферментов (SOD и CAT) давала наиболее значимый результат в увеличении продолжительности жизни [10]. В этой же работе экспрессия генов стрессоустойчивости (Hsp68, l (2) efl и Jafracl) была увеличена и сделано предположение, что гены Hsp68 и l (2) efl, скорее всего, способствовали увеличению продолжительности жизни [4]. Hsp - шаперон, класс белка, который борется с термическим и окислительным стрессом, продлевая продолжительность жизни [11]. L (2) efl - ген стрессоустойчивости - также улучшает устойчивость к окислительному стрессу [12]. Добавление экстракта аронии увеличило регуляцию данных генов. Экстракт аро-
нии представлял собой смесь, содержащую различные полифенолы и флавонои-ды, включая антоцианы. В исследованиях in vitro было установлено, что комбинация различных фитохимических соединений может принести больше пользы для здоровья организма, чем одно вещество-антиоксидант, благодаря аддитивному и синергетическому эффекту [13]. Из этого следует, что добавки антоциано-вых соединений могут увеличивать продолжительность жизни и оказывать антивозрастное действие [4]. При добавлении антоцианов из черники в культуральную среду было обнаружено, что они могут ослаблять повреждения в клетках HepG2, облученных ультрафиолетом, однако предварительная обработка экстрактом снижала экспрессию генов Gadd45 и MDM2 [14]. Gadd45 активирует множественные процессы репарации ДНК. Функцию белка MDM2 можно характеризовать как способность увеличивать время остановки G1 -фазы, которая позволяет уже восстановленным клеткам повторно войти в клеточный цикл. Именно описанные функции делают упомянутые гены важными для восстановления ДНК. Также ранее Liu et al. [15] обнаружили, что после УФ-облучения ДНК была значительно повреждена и концентрация белков p53 и p21, связанных с клеточным старением, была увеличена. Поскольку с возрастом происходит накопление ошибок в ДНК, данные белки важны для своевременного репарирования повреждений генетического материала. В клетках, предварительно обработанных антоцианами из черники, профили экспрессии белков p53 и p21 были снижены, что указывает на способность антоцианов вносить вклад в механизм репарации ДНК [15].
Ягоды черники (Vaccinium myrtillus), брусники (Vaccinium vitis-idaea), клюквы (Oxycoccus sp.), жимолости Палласа (Lonicera pallasii) наиболее широко распространены в Северном Полушарии, в том числе и на территории России. Известно, что ягоды этих видов содержат различные антоцианы, такие как петунидин, циани-дин, пеларгонидин, дельфинидин, пеонидин и мальвидин [16; 17].
Для хроматографии были выбраны ягоды жимолости и черники, так как в них содержатся антоцианы с большим количеством полярных гидроксильных групп, и это обусловливает малую хроматографичскую подвижность, если элюенты состава - хлороформ и этиловый спирт, и высокую подвижность при жидкостной хроматографии с применением сильных полярных элюентов (например: этанол - ацетонит-рил - муравьиная кислота).
Материалы и методы
Плоды черники (Vaccinium myrtillus), брусники (Vaccinium vitis-idaea) и клюквы (Oxycoccus sp.) были собраны в Сыктывдинском районе около р. Малая Чов-Ю в августе 2017 года. Плоды жимолости (Lonicera pallasii) были собраны сотрудником Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН в июле 2012 года и хранились в морозильной камере.
Для экстракции антоцианов плоды измельчали блендером до состояния однородной смеси. После чего центрифугировали 20 мин. со скоростью 4000 оборотов/мин. Полученный супернатант смешивали с глиной, которая была подвержена обработке 0.1 молярным раствором соляной кислоты. Затем смесь подвергали цен-
трифугированию. По завершении насадочную жидкость сливали и сорбент смешивали с экстрагентом: 1 %-ным раствором соляной кислоты в этаноле. Полученную смесь центрифугировали 20 мин. со скоростью 4000 оборотов/мин. и декантировали супернатант, содержащий концентрат антоцианов.
Последним этапом было удаление этанола из раствора антоцианов. Этанол отгоняли из экстракта на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 35°С, а затем при температуре 65°С избавлялись от следов влаги.
В колбе оставался сухой остаток в виде плёнки, которую снимали спиртом при помощи ультразвуковой ванной УЗВ-21150-ТН. Антоцианы, помещённые в чашку Петри, оставляли под вытяжкой до полного высыхания.
Оптическую плотность приготовленных растворов измеряли с использованием спектрофотометра Shimadzuuv-1700. Измерение проводили в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно цианидин-3-глюкозида. На основе спектров антоциановых пигментов в УФ и видимой области в качестве аналитических длин волн были выбраны 2 длины волны: 543 нм - средняя длина волны из диапазона длин волн максимумов антоцианинов (500-550 нм), близкая к длинам волн максимумов основных антоцианинов, содержащихся в объектах исследования, и 284 нм -общая для всех антоцианинов.
Концентрацию антоцианов (моль/л) рассчитывали по формуле.
Содержание антоцианов в сухом остатке
где X - содержание антоцианов, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
M - масса антоцианов в веществе;
626 - удельный показатель поглощения цианидин-3-гликозида.
Результаты анализа антоцианов спектрофотометрическим методом
Результаты анализа методом спектрофотометрии экстрактов из плодов разных ягод при длинах волн 584 нм (табл. 1) и 284 нм (табл. 2) свидетельствуют о том, что наибольшее количество антоцианов содержится в жимолости и чернике.
Таблица 1
Количественный состав антоцианов при 584 нм
Растение Концентрация веще- Оптическая плот- Содержание
ства, С, мкг/мл ность вещества, D антоцианов в мг на 100 гр ягод
Клюква 35.719 0.022 795
Жимолость 46.956 0.028 1232
Брусника 63.01 0.038 366
Черника 67.023 0.041 1215
Таблица 2
Количественный состав антоцианов при 284 нм
Растение Концентрация веще- Оптическая плотность Содержание
ства, С, мкг/мл вещества, D антоцианов в мг на 100 гр ягод
Клюква 14.452 0.132 808
Жимолость 8.618 0.79 1377
Брусника 14.149 0.129 379
Черника 12.201 0.14 1562
С помощью хроматографа Милихром-5 был зарегистрирован хроматографиче-ский профиль экстракта жимолости (рис. 2) и черники (рис. 3) при длине волны 284 нм. В экстракте черники обнаружено 3 компонента. В экстракте жимолости было обнаружено 4 компонента. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что состав антоцианов разнится и зависит от вида растения.
Заключение
Наши исследования показали, что из плодов различных ягодных культур (Vaccinium myrtillus, Lonicera pallasii) могут быть получены экстракты, обогащенные различными антоцианами. Потенциальный практический эффект полученных экстрактов может заключаться в их тестировании в экспериментах по продлению жизни и защите от окислительных повреждений, вызванных активным формами кислорода.
Рис. 2. Хроматограмма экстракта жимолости Палласа (Lonicera pallasii) Ось ординат - интегральная интенсивность хроматографического сигнала; ось абцисс -время хроматографического удержания компонентов в аналитической колонке; сигнал при длине волны = 284 нм.; аналитическая колонка Nucleosill-Cl8 размером 80 мл*2 мл,
заполненная сорбентом 5 мкм
Рис. 3. Хроматограмма аэкстракта черники (Уаеетшш шуНШж) Ось ординат - интегральная интенсивность хроматографического сигнала; ось абцисс -время хроматографического удержания компонентов в аналитической колонке; сигнал при длине волны = 284 нм; аналитическая колонка 'Ыис1ео8Ш-С18 размером 80 мл*2 мл,
заполненная сорбентом 5 мкм
Исследования выполнены в рамках государственного задания по теме «Разработка геропротекторных и радиопротекторных препаратов», № АААА-А19-119021590022-2.
Экспериментальная часть, а именно: экстракция антоцианов ГЖХ-анализ экстрактов, проводилась на базе УНУ «Научная коллекция живых растений» Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН, рег. номер 507428.
1. Sivamaruthi B.S., Kesika P., Subasankari K., Chaiyasut C. Beneficial effects of anthocyanins against diabetes mellitus associated consequences-A mini review // Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2019. Vol. 8. P. 471-477.
2. Zhou L., Wang H., Yi J., Yang B., Li M., He D., Yang W., Zhang Y., Ni H. Antitumor properties of anthocyanins from Lonicera caerulea 'Beilei' fruit on human hepatocellular carcinoma: In vitro and in vivo study // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2018. Vol. 104. P. 520-529.
3. Valenza A., Bonfanti C., Pasini M. E., Bellosta P. Anthocyanins Function as Anti-Inflammatory Agents in a Drosophila Model for Adipose Tissue Macrophage Infiltration // Biomed Res Int. 2018. Vol. 2018. P. 1-9.
4. Jo A.R., Imm J.Y. Effects of aronia extract on lifespan and age-related oxidative stress in Drosophila melanogaster // Food SciBiotechnol. 2017. Vol.26. P. 1399-1406.
5. Wang L., Li Y. M., Lei L., Liu Y., Wang X., Ma K. Y., Chen Z.Y. Cranberry an-thocyanin extract prolongs lifespan of fruit flies // Experimental Gerontology. 2015. Vol. 69. P.189-195.
6. Chen W., Müller D., Richling E., Wink M. Anthocyanin-rich purple wheat prolongs the lifespan of Caenorhabditis elegans probably by activating the DAF-16/FOXO transcription factor // J Agric Food Chem. 2013. Vol. 61(12). P. 3047-3053.
7. Sillapakong P., Yamamoto H., Mangetsu M., Noda S., Kondo H., Kofujita H., Miura M., Naganuma A., Tatsumi M., Wakabayashi T., Suzuki K. Morus alba leaf extract increases lifespan in Caenorhabditis elegans // Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 2011. Vol. 80. P. 3_089-3_092
8. Rodríguez-Rodero S., Fernández-Morera J. L., Menéndez-Torre E., Calvanese V., Fernández A. F., Fraga M. F. Aging Genetics and Aging // Aging Dis. 2011. Vol. 2(3). P. 186-195.
9. Wickens A. P. Ageing and the free radical theory // Respir Physiol. 2001. Vol. 128. P.379-391.
10. Orr W., Sohal R.S. Extension of lifespan by the over expression of superoxide-dismutase and catalase // Science. 1994. Vol. 263. P. 1128.
11. Lin Y. J., Seroude L., Benzer S. Extended life-span and stress resistance in the Drosophila mutant methuselah // Science. 1998. Vol. 282. P. 943-946.
12. Wang M. C., Bohmann D., Jasper H. JNK extends life span and limits growth by antagonizing cellular and organism-wide responses to insulin signaling // Cell. 2005. Vol. 121. P.115-125.
13. Liu R. H. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals // Am. J. Clin. Nutr. 2003. Vol. 78. P. 517S-520S.
14. Liu W., Lu X., He G., Gao X., Xu M., Zhang J., Li M., Wang L., Li Z., Wang L., Luo C. Protective Roles of Gadd45 and MDM2 in Blueberry Anthocyanins Mediated DNA Repair of Fragmented and Non-Fragmented DNA Damage in UV-Irradiated HepG2 Cells // Int. J Mol Sci. 2013. Vol. 14(11) P. 21447-21462.
15. Liu W., Lu X., He G., Gao X., Li M., Wu J., Li Z., Wu J., Wang J., Luo C. Cyto-solic protection against ultraviolet induced DNA damage by blueberry anthocyanins and anthocyanidins in hepatocarcinoma HepG2 cells // Biotechnol Lett. 2013. Vol. 35. P. 491-498.
16. Полина С.А., Ефремов А.А. Состав антоцианов плодов черники обыкновенной, брусники обыкновенной и клюквы обыкновенной Красноярского края по данным ВЭЖХ // Журнал растительного сырья. 2014. № 2. С. 103-110.
17. Чулков А.Н. Плоды жимолости синеплодной как источник антоцианов // Химия растительного сырья. 2011. № 4. С. 173-176.
