CC BY
29
УДК 612.398.1:547.964.4 Вестник СПбГУ. Сер. 3 2004, вып. 4
А. Д. Краснодембская, Г. М. Алешина, В. Н. Кокряков, . '
Е. Г. Краснодембский, В. А. Попова
ОЦЕНКА РАЗНООБРАЗИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ЦЕЛОМОЦИТОВ ПЕСКОЖИЛА ARENICOLA MARINA (ANNELIDA, POLYCHAETA)*
Введение. Микроорганизмы представляют собой постоянную угрозу для всех многоклеточных животных. Многоклеточные' организмы сохраняют способность к самоподдержанию и самовоспроизведению лишь постольку, поскольку они могут противостоять агрессивному потенциалу окружающей их микробной флоры. Необходимым условием эволюции всего живого являлось развитие защитных механизмов, т. е. способности противостоять инфекциям [1].
У беспозвоночных и древнейших позвоночных животных (круглоротых) защиту от инфекций и паразитарных инвазий обеспечивает совокупность факторов врожденного иммунитета. Общими свойствами большинства этих факторов являются конститутивность их продукции (хотя индукция некоторых веществ также может осуществляться), широкая перекрестная реактивность и низкая специфичность распознающих рецепторов.
. Активация механизмов.врожденного иммунитета происходите течение короткого периода времени и обеспечивает защиту на первых этапах заражения патогенами. Именно с помощью врожденного иммунитета осуществляется контроль над уровнем естественной микрофлоры организма.
В течение последних 20 лет стало ясно, что традиционное представление об эффек-торных молекулах врожденного иммунитета является неполным без учета роли катионных антимикробных пептидов (АМП). Открытие этих веществ вызвало очень большой интерес исследователей во всем мире, и накопленные к настоящему моменту сведения позволяют сделать вывод о том, что антибиотические пептиды являются ведущими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета [2].
К АМП относят группу пептидов, обладающих следующими свойствами: они положительно заряжены (минимальный положительный заряд +2, чаще +4,+5), имеют низкий молекулярный вес (не более 10 кДа) и формируют такую третичную структуру, в которой гидрофобные и гидрофильные боковые радикалы аминокислот пространственно разобщены, т. е. молекула является амфипатической (важную роль в стабилизации подобной ¿трук-туры играют внутримолекулярные дисульфидные связи). Эти свойства лежат в основе механизма действия АМП на клетки патогенов.
Антимикробные пептиды являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов, что свидетельствует об эффективности их функционирования. АМП дестабилизируют и в конечном итоге разрушают клеточную мембрану, вызывая серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью клетки, в отличие от других антибиотиков, действие которых обычно направлено на разнообразные мишени, локализованные внутри клетки (в этом случае общая клеточная морфология не нарушается, и бактерия может выработать резистентность). .
Помимо трех указанных выше общих качеств АМП демонстрируют большое разнообразие первичных и надпервичных структур и имеют разный характер антимикробной активности.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 03-04-49349; 2003—2005 гг.); МО (грант «Универси-, теты России» 07.01.030; 2004-2005 гг.); Персонального фанта 2004 г. для молодых ученых и специалистов М04-2.6К-329; ООО ЦКП Аналитическая спектрометрия.
© А. Д. Краснодембская, Г. М. Алешина, В. Н. Кокряков, Е. Г. Краснодембский, В. А. Попова, 2004
и
Необходимо отметить, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами системы врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективную защитную реакцию организма-хозяина.
К настоящему моменту известно уже более 800 антимикробных пептидов, выделенных из самых различных организмов. Наиболее изученными в этом плане являются млекопитающие и насекомые. Сведения об антимикробных пептидах беспозвоночных животных (за исключением насекомых) очень немногочисленны.
Особый интерес представляет группа кольчатых червей (Annelida), занимающая ключевое систематическое положение. Антимикробные пептиды у этих животных еще не были обнаружены другими исследователями, хотя были описаны другие (высокомолекулярные) белковые антимикробные факторы [4].
Мы уже сообщали ранее об обнаружении двух новых катионных антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina (с молекулярной массой 2 770 , и 2 750 Да) [3]. Однако согласно многим данным [5], в одном организме часто обнаруживается несколько различных (до 40) антимикробных пептидов. Такое разнообразие может, например, компенсировать ограниченность спектра действия каждой отдельной молекулы.
Целью данной работы являлось выделение новых антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила и изучение их основных физико-химических и функциональных свойств.
Материалы и методы исследования. Объектом наших исследований служил пескожил (Arenicola marina), класс Polychaeta, тип Annelida, обитающий на литорали и сублиторали Белого моря.
Из пойманных животных получали це-ломическую жидкость с целомоцитами, которые отделяли центрифугированием при 100 g в течение 10 мин. Полученную суспензию клеток фиксировали в 10%-ной уксусной кислоте и транспортировали в Санкт-Петербург.
Полученную суспензию клеток разрушали гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Гомогенат суспендировали на магнитной мешалке на холоде (+4°С) 18-24 ч, затем центрифугировали при 15 000 g в течении 1 ч. Супернатант подвергали ультрафильтрации через фильтр с номинально отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 1 к Да (фильтр «Amicon» YM-1). Задержавшийся над мембраной раствор концентрировали высушиванием в вакууме на центрифуге «SpeedVac» CS-18 и подвергали препаративному электрофорезу в полиакри--ламидном геле (ПААГ) [6].
Фракции белков и пептидов после препаративного электрофореза концентрировали и далее фракционировали с помощью обратно-фазовой жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке, фирмы «Beckman» на колонке :<Vydac»C-18.
Спектр пептидов в препаратах оценивали методами электрофореза в ПААГ в кислой буферной системе в присутствии мочевины [7] и диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДС-Na) [8], в качестве стандартов использовали смесь дефенсинов кролика (NP-1,2,3,4,5) и молекулярно-весовой маркер для белков соответственно.
Для оценки чистоты и определения точной молекулярной массы выделенные фракции пептидов подвергались масс-спектрометрическому анализу на времяпролетном масс-спектрометре с ионизацией посредством лазерной десорбции (в качестве матрицы использовалась а-циано-4-гидроксикоричная кислота (Sigma)). Измерения
2,7 кДа
МР-5
ще-1,2
Рис. 1. Электрофореграмма в ПААГ в кислой буферной системе (А) й антимикробный тест методом наложения ПААГ геля (после проведения электрофореза) на чашку с культурой микроорганизма {Escherichia coli) (Б).
I - экстракт целомоцитов пескожила (10%-ной уксусной кислоты); 2 - смесь дефенсинов кролика (NlP-1,2,3,4,5).
500 1500 2500
15(10 2500" 3500 МАССА [га/3]
1000
2000 3000 4000 3000 МАССА [т/3]
проводились на приборе «Voyager DE» («Perspective Biosystem Inc.», Framingham, MA, USA) с источником ионов замедленной экстракции в линейном режиме.
Антимикробная активность препаратов изучалась методом наложения ПААГ геля после проведения в нем электрофореза (в кислой буферной системе) на чашку с культурой микроорганизма и методом Радиальной диффузии пептидов в агарозном геле с культурой микроорганизма [9]. В качестве тестируемых микробов использовались грамм-отрицательная бактерия Escherichia coli ML-35p, грамм-положительная бактерия Listeria monocytogenes EGD, дрожже-подобный гриб Candida albicans 820. Оценка активности произ-водилась по наличию и величине пятна лизиса на ковре микроорганизма.
Результаты исследований и их обсуждение. Предварительный анализ экстракта (10%-ной уксусной кислотой) целомоцитов пескожила показал, что он содержит спектр пептидных фракций с антимикробной активностью (рис. 1). Из приведенной ил-.,, люстрации видно, что по своей электрофоретической подвижности в ПААГ в кислой буферной системе антимикробные фракции/ экстракта целомоцигов; находятся на уровне дефенсинов кролика, что свидетельствует об их сильной катионной природе.
После процесса очистки с использованием вышеописанных методов из экстракта целомоцитов бы-
ции 5 антимикробных пептидов с молекулярными массами 1161,1450,2000, ^ТзбЗоХТшс 2/Г Методом радиальной диффузии пептида в агарозном геле (рис. 2, Б) установлено что все они проявляют значительную активность (сравнимую с активностью д^фенсГа ЫрТ^шка одного из самых сильных из известных пептидных антибиотиков)
бактерии £ colt и не активны или очень слабс активны против тым-n^^lZ^Ha monocytogenes (на иллюстрации виден неполный лизис микроорганизма)
Рис. 2. Результаты масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOP) очищенных фракций пептидов из целомоцитов пескожила (А) и антимикробная активность выделенных пептидов (радиальная диффузия в агарозном геле с .культурой микроорганизма {Escherichia coli, наверху и Listeria monocytogenes, внизу) (Б).
1 - пептид 1161 Да; 2 - пептид 1450 Да; 3 - пептид 2000 Да- 4 - пептид 2450 Да; 5 пептид 3630 Да; б - отрицательный контроль (0 01%-ная уксусная кислота); 7- дефенсин кролика NP-I
Таким образом, нами показано, что набор антимикробных пептидов, содержащихся в целомоцитах пескожила, состоит по меньшей мере из 7 молекул с различными молекулярными массами и характером антимикробного действия. Необходимо отметить, что фракции новых 5 пептидов (1161, 1450,2000,2 450,3 630 Да) удается выделить в очень малом количестве (5-10 мкг), и основная роль в защите животного от инфекций принадлежит, по-видимому, описанным ранее пептидам (2 770 и 2 750 Да), которые обнаруживаются в экстрактах целомоцитов разных лет в значительно больших концентрациях и в равной стёпени токсичны для всех трех тестируемых микробов.
Для окончательного заключения о положении новых описанных пептидов в принятой на сегодняшний день системе необходимо установить их первичную структуру. Весьма вероятно, что какие-то из выделенных нами антимикробных пептидов могут быть фрагментами более крупных белков, например, гистонов. Подобные факты нередки в природе, расщепление крупных белковых молекул является распространенным способом производства АМП в организме животных [10, 11].
Присутствие в клетках и жидких средах одного и того же организма целого спектра AMIV обладающих ^азншт v, vkskks.
быть объяснено тем, что в процессе эволюции отбирался набор молекулярных матриц, который наиболее эффективно осуществлял защиту организма-хозяина от патогенов, характерных именно для конкретной экологической ниши. Еще одним фактором, способствующим поддержанию такого разнообразия, может быть приспособление против возможных мутаций, в то же время это усиливает синергизм с другими факторами врожденного иммунитета. Весьма вероятно, что АМП могут иметь в организме и другие биологические функции, помимо прямого антибиотического действия.
Авторы выражают свою глубокую благодарность О. В. Шамовой за помощь в осуществлении масс-спектрометрии.
Summary
Krasnodembskaya A. D„ Aleshina G. М„ Kokryakov V: N„ Krasnodembskiy E. G, Pop'ovaV.A. Estimation of diversity of antimicrobial peptides, present in coelomocytes of the lugworm Arenicola marina (Annelida, Polychaeta).
The goal of this project was to study novel antimicrobial peptides of the lugworm Arenicola marina (Annelida, Polychaeta). In acidic extracts of coelomocytes the presence of an агтау of cationic antimicrobial fractions was detected Five oi them were purified, their exact molecular weights (1161, 1450, 2000, 2450, 3630 Da) were estimated. An analysis of their antimicrobial activity revealed that all of them are strongly toxic against gram-negative Escherichia coli and in a less degree so against gram-positive Listeria monocytogenes.
Литература
r
1. Климович В. Б. Актуальные проблемы эволюционной иммунологии // Журн. эвол. биохимии и физиол. 2002. Т. 38, № 5. С. 442-450. 1 Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения СПб 1999 3 Краснодембская А. Д., Алешина Г. М., Овчинникова Т. В., Краснодембский Е: Г., Кокряков В. Н. Антимикробные пептиды из целомоцитов пескожила Arenicola marina II Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2001. Вып. 4 (Js 27). 4. Cooper £ L Kauschke E„ Gossarizza A. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff II Bio Essays 2002* У, t' iJJ 333' 5- HancockR- E- w- Diamond G. The role of cationic peptides in innate host defences // Trends in Microb. 2000. Vol. 8, N 9. P. 402-410. 6. HarwigS. S., ChenN. P., Park A. S. K., Lehrer R. 1. Purification of cysteine rich b'oactive peptides from leucocytes by continuous acid-urea-polyacrilamide gel electrophoresis // Anal. Biochem 1993a Vol.208. P-382-386. 7. PanyimS., ChalkleyR. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem And Biophys. 1969. Vol. 130. N 2. P. 337-346. 8. Schagger H., von Jagow- G. Tricine-sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis for separation of protein in the range from 1 to 100 kDa // Anal Biochem 1987 Vol. 166. P. 368-379. 9. Lehrer R. /., RosemanM., HarwigS. S. e. a. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides// J. Immunol Meth. 1991b. Vol. 137. P. 167-1 3. 10. ZasloffM. Antimicrobial peptides of multicellular organisms II Nature 2002. Vol. 415. P. 389-395. 1 . VizioliJ.. SalzetM. Antimicrobial peptide from anir : focus on ' invertebrates // Trends m pharm. scien. 2002. Vol. 23, N 11. P. 494-496.
Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г.
