CC BY
34
Результаты исследований
DOI: 10.24411/2071-5315-2020-12191
Оценка повреждения ДНК в лимфоцитах у коморбидных пациентов с ишемической болезнью сердца
^ Ю.А. Котова1, А.Н. Пашков2, А.А. Зуйкова1, А.Р. Маргарин1
ФГБОУВО "Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко "МЗ РФ 1 Кафедра поликлинической терапии Лечебного факультета 2 Кафедра биологии Педиатрического факультета
Целью исследования являлось изучение повреждения ДНК в лимфоцитах крови у коморбидных пациентов с ишемической болезнью сердца. В исследование было включено 336 пациентов в возрасте от 47 до 77 лет. Наличие коронарного атеросклероза подтверждали с помощью коронароангиографии с последующим расчетом индекса Gensini. Повреждение ДНК лимфоцитов определяли методом ДНК-комет. Полученные результаты свидетельствуют о достоверных различиях в повреждении ДНК в лимфоцитах в зависимости от выраженности коронарного атеросклероза, количества пораженных артерий и сопутствующей патологии. При проведении корреляционного анализа установлены достоверные положительные взаимосвязи между повреждением ДНК и показателями липидного профиля, глюкозы, клинико-антропометрическими данными, отрицательные — между повреждением ДНК и активностью супероксиддисмутазы.
Ключевые слова: повреждение ДНК, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, ожирение, дислипидемия, окислительный стресс.
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. В структуре сердечно-сосудистых заболеваний лидирует ишемическая болезнь сердца (ИБС), основной причиной развития которой служит атеросклероз [1—3]. За последние годы произошел прогресс в понимании формирования атеросклероза. Важно подчеркнуть, что на сегодняшний день стало понятно, что механизм развития атеросклероза не может объясняться только участием липопротеидов. Ряд факторов, таких как окислительный стресс, эндоте-лиальная дисфункция и активация иммунной системы, являются важными модуляторами формирования и обострения этой патологии [4, 5].
Контактная информация: Котова Юлия Александровна, [email protected]
В условиях гиперхолестеринемии моноциты и лимфоциты мигрируют из кровотока в поврежденную сосудистую стенку. Моноциты, которые дифференцируются в макрофаги, поглощают окисленные липо-протеиды низкой плотности (ЛПНП) и превращаются в пенистые клетки с высоким содержанием липидов; Т-лимфоциты способны продуцировать весь спектр цитоки-нов, что приводит к образованию атеромы [6, 7]. В некоторых исследованиях у больных ИБС наблюдались повреждения ДНК клеток крови [8—10]. Однако о повреждении ДНК у пациентов с разной выраженностью коронарного атеросклероза известно довольно мало.
Целью исследования являлось изучение повреждения ДНК в лимфоцитах крови у коморбидных больных ИБС с различной выраженностью коронарного атеросклероза.
Повреждение ДНК
Материал и методы
В исследование было включено 336 пациентов (158 мужчин, 178 женщин) в возрасте от 47 до 77 лет (средний возраст 59,1 ± 6,0 лет) со стабильной ИБС, находившихся на обследовании и лечении в Воронежской областной клинической больнице № 1. Всем пациентам в стационаре проводился полный спектр обследования с определением общего холестерина (ОХС), холестерина (ХС) ЛПНП, глюкозы, С-реактивного белка. Наличие коронарного атеросклероза у пациентов подтверждалось путем проведения коронаро-ангиографии по методике Judkins (1967 г.). Исследование проводилось при помощи ангиографической системы General Electric Innova 3100 (GE Healthcare, США). Доступ осуществлялся правым трансфеморальным доступом по Seldinger. Тяжесть коронарного атеросклероза оценивали на основании индекса Gensini. Индекс Gensini определяется как сумма произведений индекса тяжести каждого стеноза и индекса функционального значения, рассчитанного для каждого сегмента коронарных артерий [11].
Выборка носила сплошной характер. По индексу Gensini пациенты были разделены на 3 группы: GS0 (индекс Gensini 0) — 162 пациента без признаков коронарного атеросклероза; GS1 (индекс Gensini 0—15) — 80 пациентов с гемодина-мически незначимым поражением коронарного русла; GS2 (индекс Gensini >15) — 94 пациента с гемодинамически значимым поражением коронарного русла. По количеству пораженных артерий пациенты были разделены на 4 группы: 1-я группа — 162 пациента без поражения коронарного русла; 2-я группа — 40 пациентов с односо-судистым поражением; 3-я группа — 60 пациентов с двухсосудистым поражением; 4-я группа — 74 пациента с поражением >3 коронарных артерий.
Повреждение ДНК в лимфоцитах периферической крови исследовали методом ДНК-комет: подготавливали слайды из тугоплавкой агарозы, на них наносили
раствор, состоящий из лимфоцитов и легкоплавкой агарозы, охлаждали и затем ли-зировали с целью диссоциации клеточных структур. После лизиса микропрепарат подвергали электрофорезу, нейтрализовали и окрашивали. Полученные микропрепараты анализировали на микроскопе с соответствующими красителю фильтрами и фотографировали. Фотографии обрабатывали в программе CASP. В качестве метрик повреждения ДНК оценивали количество ДНК в хвосте кометы в процентах (tail DNA (TD)) и хвостовой момент (tail moment (TM)) в произвольных единицах (пр.е.) — произведение TD и длины хвоста кометы. Активность супероксиддисмутазы определяли спектрофотометрическим методом с расчетом процента гашения.
Статистический анализ выполняли с помощью программ Microsoft Excel и SPSS Statistics 20.0. Описание признаков представлено в виде M ± SD (среднее ± стандартное отклонение). Сравнение групп проводили с помощью критерия Круска-ла—Уоллиса (достоверными считались различия при p < 0,05). Для оценки корреляционных связей между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена, который считался значимым при р < 0,05.
Результаты исследования
Сначала оценивали степень повреждения ДНК в зависимости от количества пораженных артерий. Было отмечено, что средний балл повреждения ДНК повышался с увеличением количества пораженных сосудов (рис. 1). При отсутствии поражения коронарных артерий TM составил 4,16 пр.е., при поражении 1 артерии он увеличился в 1,5 раза, при поражении 2 артерий — в 1,9 раза, при поражении >3 артерий — в 2,2 раза. Различия между группами были достоверными (p < 0,05). При оценке TD была установлена такая же тенденция: при интактных коронарных артериях TD составил 8,71%, при поражении 1 арте-
Результаты исследований
Количество пораженных сосудов Количество пораженных сосудов
Рис. 1. Повреждение ДНК в зависимости от количества пораженных сосудов: а — ТМ; б — TD. * р < 0,05.
рии он увеличился в 1,4 раза, при поражении 2 артерий — в 1,7 раза, при поражении >3 артерий — в 2 раза. По этому показателю различия между группами также были достоверными (р < 0,05).
Между группами, разделенными по индексу Gensini, были обнаружены достоверные различия по распространенности факторов риска ИБС (таблица). Наиболее высокая распространенность факторов риска выявлена в группе пациентов с гемоди-намически выраженным атеросклерозом
(GS2), самая низкая — в группе без признаков повреждения коронарного русла (GS0). В группе GS0 артериальная гипертония (АГ) имела место у 34 пациентов, сахарный диабет (СД) 2-го типа — у 24, ожирение — у 26, дислипидемия — у 45, курили 74 пациента. В группе GS1 АГ диагностирована у 34 пациентов, СД 2-го типа — у 12, ожирение — у 18, дислипидемия — у 36, курили 26 пациентов. В группе GS2 АГ отмечена у 48 пациентов, СД 2-го типа — у 34, ожирение — у 32, дислипидемия — у 77, курили 66 пациентов.
Клиническая характеристика больных ИБС в зависимости от выраженности коронарного атеросклероза
Показатель ово 0в1 0в2
Возраст, годы 58,37 ± 5,82 59,60 ± 5,86 59,72 ± 6,54
Артериальная гипертония, % 21,0 43,0 51,0
Сахарный диабет 2-го типа, % 15,0 15,0 36,0
Курение, % 46,0 32,5 70,0
Дислипидемия, % 28,0 45,0 ,0 2, 8
Ожирение, % 16,0 22,5 34,0
ОХС, ммоль/л 5,09 ± 1,13 5,39 ± 1,46 6,39 ± 0,91*
ХС ЛПНП, ммоль/л 2,31 ± 0,93 2,86 ± 1,30 3,19 ± 1,00*
Глюкоза, ммоль/л 5,30 ± 0,45 5,50 ± 0,26 5,70 ± 0,35*
Супероксиддисмутаза, % 38,39 ± 3,65 37,52 ± 4,74 34,61 ± 3,83*
С-реактивный белок, мг/л 0,08 ± 0,02 0,15 ± 0,03 0,44 ± 0,05*
* р < 0,05.
Рис. 2. Фотография ДНК-кометы на примере GS2.
Между группами установлены достоверные различия по показателям липидного профиля, глюкозы, С-реактивного белка и су-пероксиддисмутазы.
При оценке повреждения ДНК в зависимости от тяжести коронарного атеросклероза было выявлено, что чем выше был индекс Gensini, тем больше и ярче был хвост кометы, т.е. при нарастании тяжести коронарного атеросклероза увеличивалось повреждение ДНК (рис. 2). В группе GS0 ТМ составил 16,88 ± 0,25 пр.е., в группе GS1 - 17,98 ± 0,38 пр.е., в группе GS2 -21,55 ± 1,28 пр.е. (р < 0,005). В группе GS0 TD составил 25,12 ± 2,03%, в группе GS1 — 35,12 ± 3,09%, в группе GS2 — 42,67 ± 4,62% (р < 0,05).
Объединив всех пациентов с коронарным атеросклерозом в одну группу, мы оценили различия в повреждении ДНК в зависимости от сопутствующей патологии. Показатели повреждения ДНК были значительно выше у пациентов с СД 2-го типа, дислипидемией или ожирением по сравнению с группой без сопутствующей патологии и были выше у курильщиков, чем у некурящих. Все выявленные различия были достоверными (рис. 3).
При проведении корреляционного анализа были выявлены следующие взаимосвязи: положительные — между ТМ и ОХС (г = 0,321; р = 0,003), ТМ и ХС ЛПНП (г = 0,353; р = 0,0001), ТМ и индексом Gensini (г = 0,569; р = 0,0002), ТМ и количеством пораженных артерий (г = 0,322 р = 0,048), ТМ и курением (г = 0,274 р = 0,05), ТМ и ожирением (г = 0,395
20
О &
15
10
16,13* Н14Д1 14,18
17,45* 17,44*
14Д2 13,68
17,92*
0
СД ДЛП Ожирение Курение
■ Нет Да
Рис. 3. Оценка повреждения ДНК у пациентов с СД 2-го типа, дислипидемией (ДЛП), ожирением и курением и в отсутствие этих факторов. * р < 0,05.
Результаты исследований
р = 0,028), TD и СД 2-го типа (г = 0,284; р = 0,05), ТМ и глюкозой (г = 0,284; р = 0,05), ТМ и С-реактивным белком (г = 0,52; р = 0,0067); отрицательные — между ТМ и активностью супероксиддис-мутазы (г = -0,566; р = 0,0001).
Обсуждение результатов
В настоящем исследовании мы использовали метод ДНК-комет для оценки повреждения ДНК в лимфоцитах у пациентов с ИБС. Полученные результаты свидетельствуют о том, что более выраженное повреждение ДНК наблюдалось у больных ИБС с гемодинамически значимым коронарным атеросклерозом. В некоторых эпидемиологических исследованиях была выявлена взаимосвязь между ДНК-кометами и тяжестью коронарного атеросклероза [12, 13].
Нам удалось установить, что у пациентов с СД 2-го типа, гиперлипидемией, ожирением, а также у курильщиков повреждение ДНК было более значимым. Существует тесная взаимосвязь между повреждением ДНК, тяжестью ИБС и ожирением. В ряде работ отмечается, что в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний играет роль окислительный стресс и/или недостаточная антиоксидантная защита [10, 14, 15]. К повреждению ДНК приводят ряд общепринятых факторов риска атеросклероза [16, 17]. В различных исследованиях выявлено, что курение усиливает повреждение ДНК [9, 18]. Влияние гиперхолестерине-мии и СД на повреждение ДНК при ИБС обусловлено увеличением продукции активных форм кислорода [9, 10, 19].
Также было отмечено, что у больных с гиперлипидемией наблюдается увеличение повреждения ДНК лимфоцитов, вызванное окислительным стрессом, и снижение антиоксидантной способности [9, 10, 20]. При ожирении повышается плазменный уровень свободных жирных кислот и увеличивается способность к липогенезу. Свободные жирные кислоты вызывают синтез и избыточное образование оксида азота. Считается, что оксид азота играет двойную роль, выступая в качестве регулятора в физиологических условиях и в качестве цито-токсина при патофизиологических обстоятельствах [21, 22]. Ожирение у взрослых также ассоциируется со снижением анти-оксидантного статуса [23].
Выводы
Результаты представленного исследования свидетельствуют о том, что повреждение ДНК является более выраженным у пациентов с тяжелым коронарным атеросклерозом. Отмечено увеличение повреждения ДНК у больных ИБС при наличии коморбидной патологии. Повреждение ДНК имеет положительную корреляционную связь с тяжестью ИБС и отрицательную с активностью супероксиддисмутазы. В свете этих данных можно предполагать, что повреждение ДНК может происходить за счет увеличения дисбаланса между продукцией активных форм кислорода и анти-оксидантной защитой у больных ИБС.
Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
The Assessment of DNA Damage of Lymphocytes in Comorbid Patients with Coronary Heart Disease Yu.A. Kotova, A.N. Pashkov, A.A. Zuikova, and A.R. Margaryan
The aim of the study was to assess DNA damage in blood lymphocytes in comorbid patients with coronary heart disease. The study included 336 patients aged from 47 to 77 years. The presence of coronary atherosclerosis was confirmed by coronary angiography with subsequent calculation of Gensini index. DNA damage of lymphocytes was determined using comet assay. The study showed significant differences in DNA damage of lymphocytes depending on the severity of coronary atherosclerosis, the number of affected arteries, and concomitant diseases. Correlation analysis revealed significant positive relationships between DNA damage and lipid profile, glucose level, clinical and anthropometric indicators and negative relationships between DNA damage and superoxide dismutase activity. Key words: DNA damage, coronary heart disease, diabetes mellitus, obesity, dyslipidemia, oxidative stress.
