31Оценка потенциальных рисков, возникающих при снижении температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов по влиянию на основные биологические показатели
Д.Р. Каргопольцева, ветеринарный врач, ORCID 0000-0002-9944-5223, М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-0003-3176-6386, А.А. Зуева, токсиколог, ORCID 0000-0002-2996-0748, К.Ю. Кильдибеков, технический директор
Институт доклинических исследований
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245 Е-mail: [email protected]
Резюме
Риски представляют собой возможность возникновения неблагоприятной ситуации, влекущей за собой различного рода потери. Риски имеются во всех сферах деятельности, в том числе и в работе вивариев и питомников. Для лабораторных животных важно соблюдать необходимые условия микроклимата (температура и влажность воздуха в помещении, воздухообмен) и световой режим. В случае возникновения нештатных ситуаций в работе вивария возможны отклонения от установленных норм для данных показателей микроклимата, что, в свою очередь, может существенно повлиять на здоровье животных и, как следствие, может привести к получению недостоверных результатов в исследованиях. В нашей предыдущей работе было проведено исследование по оценке потенциальных рисков, возникающих при повышении температуры содержания лабораторных животных (мыши, крысы и морские свинки) вплоть до 4°С выше верхней границы рекомендованных диапазонов по влиянию на основные биологические показатели. В ходе данного исследования было выяснено, что повышение температуры содержания не влияет на основные жизненные показатели животных. В данной работе мы изучали риски, возникающие при
снижении температуры содержания животных ниже рекомендованного диапазона на 3°С с точки зрения таких основных показателей здоровья как: общее состояние животных, масса тела, гематологические и биохимические показатели крови и массовые коэффициенты органов. При проведении исследования мышей, крыс и морских свинок в течение одной недели содержали при температурах 19°С, 18°С и 17°С и в течение трех недель при постепенном снижении температуры от 19°С на 1°С каждую неделю до достижения температуры 17°С. По итогам проведенного исследования было установлено, что незначительное снижение температуры содержания (от 19°С до 17°С) не оказывает клинически значимого влияния на жизненные показатели животных и риски при возникновении нештатных ситуаций, связанных с обеспечением рекомендуемой температуры содержания, минимальны.
Ключевые слова: температура содержания, риски, термонейтральная зона, мыши, крысы, морские свинки.
Для цитирования: Каргопольцева Д.Р., Макарова М.Н., Зуева А.А., Кильдибеков К.Ю. Оценка потенциальных рисков, возникающих при снижении температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов по влиянию на основные биологические показатели. Лабораторные животные для научных исследований. 2019; 4 https://doi. org/ 10/29926/2618723X-2019-04-02
Impact Assessment оf Potential Risks From Enviromental Temperature Decrising оf Laboratory Animals (Mice, Rats, Guinea Pigs) Outside the Recommended Range for Main Biological Parameters D.R. Kargopoltceva, M.N. Makarova, A.A. Zueva, K.Yu. Kildibekov
«Institute of Preclinical Research» Ltd. 188663, Russia, Leningrad oblast, Vsevolozhskiy district, Kuzmolovskiy t.s., Zavodskaya st. 3-245 Е-mail: [email protected]
Abstract. Risks are the possibility of an adverse situation attracts various losses. There are risks in all spheres of activity including the work of vivariums and sources. It is important to observe the necessary environmental conditionals (room temperature, air humidity and air exchange) and light cycle. It may be deviations from the established standards for these microclimate indicators that, in turn, might severely effects on animal health and trigger inaccurate study results in case emergency situations in the vivarium. In previous work study was conduct to assess the potential risks resulting from elevation of environmental temperature of laboratory animals (mice, rats and guinea pigs). It was found, that an environmental temperature increase by 4°C above the upper limit of the recommended ranges didn't effect on vital indicators of laboratory animals. In current study we researched risks
emerging by decrease of the environmental temperature 3°C above lower recommended range influence main health indicators like: general animal state, body weight, hematological and blood biochemical parameters and weight of internal organs to body weight ratio. Mice, rats and guinea pigs were housed at the temperature: 19, 18 and 17°C for week. Other animals were housed for 3 weeks at the initial temperature 19°C with gradual lowering by 1°C weekly until 17°C. The study found that the small lowering of environmental temperature (between 19 and 17°C) didn't effect on animal vital signs and risks in case of emergency situations related to the provision of the recommended content temperature are minimal. Key words: environmental temperature, risks, thermoneutral zone, mice, rats, guinea pigs.
For citation: Kargopoltceva D.R., Makarova M.N., Zueva A.A., Kildibekov K.Yu. Impact Assessment of Potential Risks From Enviromental Temperature Decrising of Laboratory Animals (Mice, Rats, Guinea Pigs) Outside the Recommended Range for Main Biological Parameters. Laboratory Animals for Science. 2019; 4 https://doi.org/10/29926/2618723X-2019-04-02
Введение
В нашей предыдущей работе, посвященной изучению влияния повышения температуры содержания лабораторных животных на основные биологические показатели, рассматривалась важность соблюдения этических принципов при работе с животными и необходимость обеспечения надлежащих условий содержания, в том числе поддержание комфортной температуры окружающей среды. Были рассмотрены различные действующие в наше время руководства и рекомендации по содержанию лабораторных животных, которые содержат разные данные по усредненной комфортной температуре содержания животных (мышей, крыс и морских свинок) [1]. Как правило, при содержании мышей, крыс и морских свинок придерживаются температуры от 20 до 26°С. Однако в работе вивариев и питомников нельзя исключить нештатных ситуаций, вследствие которых контролируемые показатели микроклимата отклоняются от рекомендованных диапазонов [1].
Предпочтительный температурный диапазон, комфортный и относительно теплый для животных называется термонейтральной зоной (ТНЗ).
При анализе литературных источников были найдены данные по влиянию экстремальных температур на организм животных. Например, при изучении длительного действия низких температур (+4°С в течение
2 нед) наблюдалось изменение двигательной активности крыс Wistar в установке «Открытое поле» [2].
М. Ferreira и соавт. [3] проводили исследование на самцах крыс Wistar, которых однократно в течение 4 ч подвергали воздействию температуры -8°С. После эвтаназии у животных было обнаружено истощение запасов гликогена и липидов в печени и надпочечниках, что связано со стрессовыми условиями, в результате которых происходит выброс катехоламинов, вследствие чего происходит окислительный гликогенолиз [3].
М.Р. Kulkarni и соавт. проводили исследование на мышах, которых содержали при температуре +4°С в течение 1 ч на протяжении 7 дней. У животных отмечали значительное увеличение массы надпочечников и снижение массы селезенки, обнаружено также увеличение концентрации гормона кортикостерона и увеличение концентрации глюкозы, общего белка, холестерина и триглицеридов [4].
Однако в литературе нет данных, описывающих влияние некритичного снижения температуры содержания на ключевые показатели, которые оцениваются при проведении доклинических исследований.
Таким образом, после анализа данных литературы была поставлена цель - изучить влияние пониженной температуры содержания мышей, крыс и морских свинок на такие основные показатели животных, как общее состояние, масса тела, гематологические и биохимические показатели крови и массовые коэффициенты органов.
Материал и методы
Экспериментальные животные. Исследования проводили на самцах и самках мышей, крыс и морских свинок, полученных из питомника НПО «Дом Фармации».
Условия содержания. В период эксперимента мыши, крысы и морские свинки были размещены в индивидуально-вентилируемых клетках Shangai Pretty Industries Co., LTD (Китай), группами по 5 особей одного пола для мышей, по 4 для крыс и по 2 для морских свинок, на древесном подстиле. Поскольку данное исследование было направлено на оценку потенциальных рисков при смещении температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов по влиянию на основные показатели, температура содержания снижалась до уровня от 17 до 19°С. При этом уровень относительной влажности воздуха поддерживали на уровне 30-70%.
Также были предусмотрены контрольные группы животных, которых содержали при рекомендуемой температуре 20-26°С. Температуру в помещениях содержания животных фиксировали и контролировали с помощью даталоггеров.
Световой режим составил 12 ч света и 12 ч темноты. Корм для содержания лабораторных животных ПК-120-1, приготовленный по ГОСТ Р50258-92 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия» давали ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Дополнительно в рацион морских свинок входило сено и морковь. Животным давали воду, очищенную и нормированную по органолептическим свойствам, по показателям рН, сухого остатка, восстанавливающих веществ, диоксида углерода, нитратов и нитритов, аммиака, хлоридов, сульфатов, кальция и тяжелых металлов на основании СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Воду в стандартных поилках со стальными крышками-носиками давали ad libitum.
Данная научно-исследовательская работа была рассмотрена на биоэтической комиссии АО НПО «Дом Фармации» и одобрена для проведения (№БЭК 1.71/18 от 09 ноября 2018 г.).
Дизайн исследования. Для проведения данного исследования было сформировано по 5 групп мышей (по 5 самцов и самок), крыс (по 4 самца и самки) и морских свинок (по 4 самца и самки) (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика экспериментальных групп аутбредных мышей, крыс и __морских свинок_
№ группы Количество мышей/ крыс / морских свинок Температура и длительность содержания
самцы самки
2 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 20-26°С в течение 1 нед
8 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 20-26°С в течение 3 нед
9 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 19-17°С в течение 3 нед (каждую неделю температуру содержания снижали на 1°С)
10 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 19°С в течение 1 нед
11 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 18°С в течение 1 нед
12 5 / 4 / 4 5 / 4 / 4 17°С в течение 1 нед
Мышей, крыс и морских свинок групп №2 и 8 содержали при стандартном уровне температуры +20-26°С в течение 1 и 3 нед соответственно. Животных группы №9 в первую неделю исследования содержали при температуре +19°С, далее каждую неделю температуру содержания снижали на 1°С до достижения температуры +17°С. Мышей, крыс и морских свинок групп №10, 11 и 12 содержали в течение недели при температурах +19, 18 и 17°С соответственно.
Контролируемые показатели. В период проведения эксперимента за животными осуществляли ежедневное клиническое наблюдение, при котором у животных оценивали поведение, реакцию на раздражители, состояние кожных покровов и слизистых оболочек, наличие патологических выделений, тонус мускулатуры, нарушение координации движений и наличие одышки.
У лабораторных животных регистрировали массу тела в первый день эксперимента и в день эвтаназии, а у животных групп № 8 и 9 взвешивание проводили еженедельно. Взвешивание животных осуществляли на лабораторных электронных весах Vibra AJ-1200CE (Shinko Denshi, Япония).
Также для оценки влияния пониженной температуры содержания на организм мышей, крыс и морских свинок осуществляли забор проб крови в день эвтаназии для проведения гематологического анализа, который осуществляли на гематологическом анализаторе Mythic 18 Vet (Orphee, Швейцария), и биохимического анализа крови, выполнявшегося на биохимическом анализаторе Random Access А-25 (Biosystems, Испания).
При проведении гематологического анализа крови у животных определяли количество эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит, количество лейкоцитов и тромбоцитов, подсчитывали лейкоформулу.
При проведении биохимического анализа крови у животных определяли концентрацию аланинаминотрансферазы,
аспартатаминотрансферазы, общего билирубина, щелочной фосфатазы, креатинина, мочевины, общего белка, альбуминов, глобулинов, общего холестерина, триглицеридов, глюкозы и рассчитывали отношение A/G.
Для расчета процентного отношения массы органов к массе тела у животных при проведении плановой некропсии были извлечены и взвешены на электронных весах Adventurer модель RV 214 (OHAUS, Китай) сердце, легкие с трахеей, тимус, печень, селезенка, почки, надпочечники (за исключением мышей), головной мозг, семенники у самцов и яичники у самок.
Методы статистического анализа данных. Для всех данных была применена описательная статистика: данные были проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были рассчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением n (количество наблюдений) представлены в итоговых таблицах. Для оценки данных более двух выборок с признаками нормального распределения использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), в случае обнаружения достоверного влияния исследуемого фактора последующие межгрупповые сравнения (post hoc analysis) проводили с использованием критерия Тьюки (Tukey^s test analysis). Для оценки данных двух выборок с признаками нормального распределения использовали t-критерий Стьюдента. Различия определяли при уровне значимости р<0,05.
Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft, США).
Результаты и обсуждение
Снижение температуры содержания мышей, крыс и морских свинок за пределы рекомендованных диапазонов в течение одной недели (температура содержания 19-17°С) и в течение 3 нед (последовательное еженедельное снижение уровня температуры на 1°С от 19 до 17°С) не оказало влияния на общее состояние животных. При осмотре в клетке у всех экспериментальных животных поведение было стандартным, без признаков угнетения или возбуждения. При взятии на руки у всех животных на протяжении исследования отмечали стандартную реакцию на раздражители. При осмотре кожных покровов и видимых слизистых оболочек изменений не обнаружено. Патологических выделений из глаз, носовой полости, анального отверстия и уретры не наблюдали. Тонус мускулатуры у экспериментальных животных был умеренным. Моторика животных была стандартной, без каких-либо отклонений от физиологической нормы. Патологического положения тела в пространстве, нарушений походки и координации движений не наблюдали.
Таблица 2
Влияние смещения температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов в сторону понижения на протяжении недели на массу тела самцов и самок мышей, крыс и
№ груп пы Температур а содержания, °С Вид животных
мыши крысы морские свинки
самцы | самки самцы | самки самцы | самки
день эксперимента
1-й 7-й 1-й 7-й 1-й 7-й 1-й 7-й 1-й 7-й 1-й 7-й
2 20-26 29±0,5 28±0,3 26±0,7 26±0,7 290±6,6 269±5,0 245±1,4 244±3,0 945±8,4 918±12,7 865±11,3 848±8,7
10 19 29±1,1 31±1,0 25±0,3 27±0,6 284±8,3 295±9,4 249±1,5 258±1,5 954±5,8 950±6,8 893±2,3 850±11,9
11 18 28±0,3 29±0,5 24±0,7 24±0,9 289±10,8 298±10,4 242±15,0 243±16,0 964±8,8 949±22,2 842±20,7 836±16,5
12 17 31 ±2,1 30±1,9 24±0,6 24±1,1 272±7,1 280±8,9 268±14,9 270±15,3 939±19,0 924±11,0 838±19,7 801±12,7
В табл. 2 представлены данные по массе тела самцов и самок мышей, крыс и морских свинок, которых в течение одной недели содержали в условиях пониженной температуры.
Данные соответствовали закону нормального распределения. Дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями не выявил влияния фактора «смещение температуры содержания животных за пределы рекомендованных диапазонов в течение одной недели» на массу тела самцов и самок мышей, крыс и морских свинок (р>0,05).
Данные массы тела животных, которых содержали в условиях последовательного еженедельного снижения уровня температуры на 1°С от 19 до 17°С, представлены на рис. 1-3.
День эксперимента
Рис. 1. Влияние смещения температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов на протяжении 3 нед на массу тела самцов и самок мышей (п=5)
День эксперимента
Рис. 2. Влияние смещения температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов на протяжении 3 нед на массу тела самцов и самок крыс (п=4)
День эксперимента
Рис. 3. Влияние смещения температуры содержания лабораторных животных за пределы рекомендованных диапазонов на протяжении 3 нед на массу тела самцов и самок морских свинок (п=4)
Данные соответствовали закону нормального распределения. Статистический анализ с применением ^критерия Стьюдента не выявил влияния фактора «смещение температуры содержания животных за пределы рекомендованных диапазонов в течение трех недель» на массу тела самцов и самок мышей, крыс и морских свинок.
При проведении анализа данных гематологического и биохимического анализа крови у мышей, крыс и морских свинок также не отмечали клинически значимых отклонений по исследуемым показателям. Все показатели гематологического и биохимического анализа крови находились в пределах физиологических норм для соответствующего вида животных, согласно внутрилабораторным нормам и данным, представленным в научной литературе.
При анализе данных массовых коэффициентов органов мышей, крыс и морских свинок влияния смещения температуры содержания животных за пределы рекомендованных диапазонов в сторону снижения в течение одной и трех недель для животных соответствующих групп также не установлено.
Обобщая полученные данные, можно заключить, что незначительные колебания температуры содержания животных (19, 18 и 17°С) в течение одной недели и постепенное снижение температуры от 19°С на 1°С каждую неделю до достижения температуры 17°С не оказывают значимого влияния на такие основные показатели, как общее состояние животных, масса тела, гематологические и биохимические показатели крови и массовые коэффициенты внутренних органов самцов и самок мышей, крыс и морских свинок.
Заключение
Данное исследование было направлено на оценку потенциальных рисков, возникающих при смещении температуры содержания лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки) за пределы рекомендованных диапазонов в сторону снижения.
При наблюдении за мышами, крысами и морскими свинками у животных не отмечали признаков ухудшения общего состояния при снижении температуры от 19 до 17°С.
Снижение температуры также не оказало влияния на массу тела животных и не привело к клинически значимым отклонениям по параметрам гематологического и биохимического анализов крови. При взвешивании органов отличий по массовым коэффициентам между животными, которых содержали при пониженной температуре от 19 до 17°С, от животных, содержавшихся при рекомендованном диапазоне температуры содержания от 20 до 26°С, не обнаружено.
Таким образом, по результатам проведенного исследования можно заключить, что содержание половозрелых животных в течение одной и трех недель при температуре от 19 до 17°С (что ниже рекомендованного диапазона на 3°С), не оказывает клинически значимого влияния на жизненные показатели животных и риски при
возникновении нештатных ситуаций, связанных с обеспечением рекомендуемой температуры содержания, минимальны.
Список литературы
1. Каргопольцева Д.Р., Крышень К.Л., Кательникова А.Е., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Зуева А.А., Матичин А.А., Гайдай Д.С. Оценка потенциальных рисков, возникающих при повышении температуры содержания лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки) за пределы рекомендованных диапазонов по влиянию на основные биологические показатели // Лабораторные животные для научных исследований. 2019. №3. DOI: 10.29296/2618723X-2019-03-09 [Kargopol'ceva D.R., Kryshen' K.L., Katel'nikova A.E., Makarova M.N., Makarov V.G., Zueva A.A., Matichin A.A., Gajdaj D.S. Ocenka potencial'nyh riskov, voznikayushchih pri povyshenii temperatury soderzhaniya laboratornyh zhivotnyh (myshi, krysy, morskie svinki) za predely rekomendovannyh diapazonov po vliyaniyu na osnovnye biologicheskie pokazateli // Laboratornye zhivotnye dlya nauchnyh issledovanij. 2019. №3. (In Russ.)].
2. Мартынов Н.Н., Санникова О.А. Влияние длительной холодовой адаптации на поведение крыс Wistar // Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований: тезисы конф. (Москва, 20 - 22 ноября 1990 г.) - Москва, 1990. - С. 51. [Martynov N.N., Sannikova O.A. Vliyanie ditel'noj holodovoj adaptacii na povedenie krys Wistar // Laboratornye zhivotnye dlya mediko-biologicheskih i biotekhnologicheskih issledovanij: tezisy konf. (Moskva, 20 - 22 noyabrya 1990 g.) - Moskva, 1990. - P. 51. (In Russ.)].
3. Ferreira M. et al. Electric countershock and cold stress effects on liver and adrenal gland // Clinics. 2010. Vol. 65(3): 291-296. DOI: 10.1590/S1807-59322010000300009.
4. Kulkarni M. P., Juvekar A. R. Attenuation of acute and chronic restraint stress-induced perturbations in experimental animals by Nelumbo nucifera Gaertn // Indian journal of pharmaceutical sciences. 2008. Vol. 70 (3): 327-332. DOI: 10.4103/0250-474X.4298
