CC BY
132
УДК 639.3.034.2
ОЦЕНКА ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ОСЕТРОВЫХ РЫБ В УСЛОВИЯХ АКВАКУЛЬТУРЫ
Н. В. БАРУЛИН, Т. П. ЮРЧЕНКО, М. В. ШАЛАК, Н. А. САДОМОВ
УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» г. Горки, Могилевская область, Республика Беларусь, 213407
(Поступила вредакцию 09.12.2013)
Резюме. В статье представлены результаты исследований по оценке подвижности сперматозоидов осетровых рыб в условиях аквакультуры с помощью компьютерного анализа. Приводятся результаты измерений подвижности по таким параметрам, как криволинейная скорость, прямолинейная скорость, средняя скорость движения по траектории, колебание, линейность.
Ключевые слова: аквакультура, сперматозоиды, осетровые рыбы, качества спермы, самцы.
Summary. The article presents the results of surveys measuring sperm motility in sturgeon aquaculture conditions by computer analysis. Results of measurements of the mobility on such parameters as: curvilinear velocity, straight line velocity, average path velocity, oscillation, linearity.
Key words: aquaculture, sperm, sturgeon fish, sperm quality, males.
Введение. Проблемы сохранения биоразнообразия водных организмов выдвинулись на первый план из-за серьезной уязвимости водных экосистем и большей, чем на наземные территории, антропогенной нагрузки на акватории (аккумуляция загрязнений, в том числе поступающих с суши, нефтедобыча и водные транспортировки, сверхнормативное безвозвратное изъятие воды на хозяйственные и агропромышленные нужды и т.п.), что сказывается на утрате естественного нереста, выживаемости и росте молоди. Вследствие этих процессов стремительно сокращается биоразнообразие, исчезают многие виды и популяции рыб и других водных организмов. Поэтому очень важную роль в ак-вакультуре занимает искусственное воспроизводство [1, 8].
Оценка подвижности сперматозоидов получила широкое распространение в технологии искусственного воспроизводства, поскольку такой метод позволяет установить качество получаемых половых продуктов, выявить аномалии и предотвратить неэффективность оплодотворения [13]. Современные методы компьютерной диагностики качества спермы позволяют проводить точные исследования на высоком методическом уровне [4].
Анализ источников. Основная функция сперматозоида состоит в активации яйца, побуждении его к развитию, а также в снабжении гаплоидным ядром. В связи с этим подвижность сперматозоидов является одним из важных параметров [15]. Основная роль в снабжении сперматозоида энергией принадлежит митохондриям, которые у рыб сконцентрированы в средней части сперматозоида. С функциональной точки зрения, подвижность сперматозоидов напрямую зависит от уровня АТФ [3], поэтому способность влияния на уровень АТФ может существенно изменить подвижность сперматозоидов [11]. Сперматозоиды являются популярным биологическим объектом для оценки влияния факторов физической и химической природы на качество мужских половых продуктов. Так, увеличение срока хранения спермы индейки наблюдалось при добавлении витаминов E и C [13], а введение цианокобаламина в криозащитную среду на начальных этапах криоконсервации спермы русского осетра повышает выживаемость и время движения сперматозоидов [5]. Воздействие на сперму человека рентгеновским излучением угнетало, ультрафиолетовым излучением не влияло [12], а инфракрасным излучением и электромагнитным полем повышало подвижность сперматозоидов [7, 17].
Воздействие гамма-излучением на сперматозоиды крысы оказывало негативное влияние [18], а воздействие лазерным излучением красной области спектра повышало качество спермы индейки и собаки [10, 14]. Кроме того, воздействие на сперму телапии светом белой, а также красной областей спектра приводило к повышению подвижности сперматозоидов. Воздействие светом синей и ультрафиолетовой областей спектра оказывало отрицательный результат [16].
В ветеринарии и животноводстве много лет известны следующие методы оценки качества спермы животных [2]: изучение анатомического строения сперматозоидов, объема эякулята, цвета, запаха, консистенции; оценка подвижности, густоты, интенсивности дыхания, резистентности, скорости обесцвечивания и др.
В животноводстве оценку спермы по подвижности проводят по десятибалльной системе. Наивысшую оценку - 10 баллов дают сперме в том случае, если все спермин обладают поступательным движением; при оценке 9 баллов - 9 спермиев из 10 обладают прямолинейно-поступательным движением, при оценке 6 баллов - 6 из 10 и так далее [2].
В рыбоводстве активность выражают в баллах по шкале Персова, в которой за 5 баллов принимается быстрое поступательное движение всех спермиев; за 4 балла - быстрое поступательное движение большинства спермиев, но в поле зрения встречаются отдельные сперматозоиды, осуществляющие замедленное зигзагообразное, круговое или колебательное движение; за 3 балла принимается быстрое поступательное движение части спермиев, преобладает замедленное зигзагообразное, круговое или колебательное движение, имеются неподвижные спермин; 2 балла - быстрое поступательное движение, редко у части спермиев - колебательное движение, около 75 % спермиев неподвижно; 1 балл - все спермин неподвижны [8].
Густота спермы, определяемая при глазомерной микроскопической оценке, дает приблизительное представление о количестве спермиев в 1 мл эякулята. Резистентность спермы выражается количеством миллилитров 1 % раствора хлористого натрия, которое нужно добавить к 1 мл спермы, чтобы в ней прекратилось поступательное движение спермиев. Активность спермы оценивают по скорости обесцвечивания (восстановления) метиленовой синьки, смешанной со спермой. Подсчет сперматозоидов позволяет оценить число сперматозоидов с приемлемой изменчивостью из-за разбавления и подсчета ошибок и оценивать до 6 % на 300 сперматозоидов при наблюдении, когда подсчет 1/500 разбавленной спермы повторяется 3 раза [2].
Все вышеперечисленные методы являются достаточно субъективными с большим процентом ошибок, который очень сильно зависит от человеческого фактора.
С развитием высокоскоростной съемки и компьютерных технологий стали возможны исследования движения одновременно нескольких клеток с определением траектории их перемещения и скорости. Использование аппаратно-программных комплексов для определения концентрации, характеристики движения сперматозоидов, а также морфологических критериев клеток легло в основу новой технологии в лабораторной медицине - CASA (computer-assisted semen analysis) - компьютерного анализа подвижности сперматозоидов. CASA позволяет проводить оценку таких показателей подвижности, как криволинейная скорость, прямолинейная скорость, линейность. Совокупное использование полученных данных позволяет дать объективную оценку качеству спермы и преодолеть субъ -ективность интерпретации, присущей стандартной спермограмме [3, 13]. Основное преимущество компьютерного анализа - это достоверное определение. В зависимости от количества одновременно находящихся в поле наблюдения сперматозоидов компьютер рассчитывает параметры движения либо всех, либо большей их части, что невозможно при ручном производстве спермограммы. Другое важное преимущество - воспроизводимость, т. е. результат исследования не зависит от лаборанта, производящего исследование, от уровня его подготовки, степени концентрации внимания или усталости. Можно быть уверенным, что проведенный одному пациенту анализ подвижности в разное время будет правильно отражать изменения показателей, исключая погрешности преаналитической стадии [3, 13]. Следующее преимущество - объективность: анализатор измеряет истинные скорости движения сперматозоидов, позволяя объективно судить о фертильности спермы [3, 13]. Совершенствование компьютерной морфологической диагностики позволяет получить принципиально новую количественную информацию, недоступную врачу при обычном визуальном анализе изображений под микроскопом [3].
Цель работы - апробация современного компьютерного анализа подвижности сперматозоидов осетровых рыб в условиях аквакультуры.
Материал и методика исследований. В качестве объекта исследований была выбрана сперма самцов ленского осетра, выращенных от стадии личинки до половозрелого состояния в условиях ус -тановки замкнутого водоснабжения (частное хозяйство «Акватория», фермерское хозяйство «Василек», Дзержинский р-н, Минская обл.). Возраст самцов - 5 лет, средняя масса - 6,3 кг, средняя длина -92,7 см. Самцов отбирали осенью для возможного использования в воспроизводстве с гонадами, находящимися в III-IV и IV стадиях зрелости. Осенняя бонитировка самцов проводилась при снижении температуры воды до 12 °С, при которой рыбу обычно прекращали кормить. Для отбора зрелых самцов при осенней бонитировке использовали метод определения стадий зрелости гонад при помощи неинвазивного экспресс-метода УЗИ [8]. Температурный режим во время зимовки самцов составлял 4-5 °С. При этом допускалось кратковременное повышение температуры до 7 °С и ее понижение до
2 °С. Во время весенней бонитировки основным требованием к режиму преднерестового содержания самцов являлось сохранение их репродуктивных качеств. Поскольку самцы обычно готовы к нересту уже при кратковременном выдерживании при нерестовых температурах, наиболее эффективным приемом сохранения их репродуктивных качеств являлось содержание при невысоких температурах. Для стимулирования созревания самцов применяли суперактивный синтетический аналог гонадотро-пин-релизинг-гормона млекопитающих (GnRHa, сурфагон). Для инъекций использовали медицинские шприцы. Инъекцию производили в спинные мышцы между спинными и боковыми жучками на уровне 3-5 спинной жучки. При введении препарата в мышечные ткани соблюдали осторожность и следили за тем, чтобы рыба при сжатии мышц не вытолкнула препарат. Отбор спермы осуществляли при помощи катетера и пластикового шприца Жане. Средний объем полученного эякулянта - 110 см3. Температура воды в период взятия половых продуктов составляла 14,5 °С. Вся отобранная сперма оценивалась в 5 баллов по 5 бальной шкале Персова. Для исследования подвижности спермиев пробу разбавляли водой в соотношении 1:20-1:50. Температура воды соответствовала температуре эякулята. Перед получением спермы производители обтирали полотенцем или марлевой салфеткой, особенно тщательно вытирали место у анального отверстия, а также анальный и хвостовой плавники. При этом следили, чтобы в пробирку не попали вода, полостная жидкость или экскременты рыбы. Пробирки со спермой ставили в холодильник или в холодное затененное место.
Подвижность сперматозоидов исследовали на тринокулярном (тип Зидентопфа) биологическом микроскопе проходящего света серии MMC-KZ-900 с независимой планахроматической оптической системой на бесконечность F=200mm. Для анализа подвижности использовали счетные камеры с фиксированной глубиной марки Leja. Запись подвижности сперматозоидов осуществляли при помощи видеокамеры MMC-31C12-M, построенной на основе сенсора компании Aptina. Частота кадров в секунду - 12 к/с при разрешении 2048x1536, 60 к/с - при 800x600, 95 к/с - при 640x480, 135 к/с -при 512x384. Для исследований качества спермы использовали автоматизированное программное обеспечение ММС Сперм, которое представляло собой основу для компьютерного спермоанализато-ра (CASA). Оценка концентрации сперматозоидов и анализ их подвижности производился на видеоклипах в формате AVI (захваченных в память компьютера или записанных на жесткий диск), на основе алгоритма анализа с учетом требований руководства Всемирной организации здравоохранения [19].
Для статистической обработки использовали компьютерные статистические пакеты STATISTICA 8, BioStat 2009, OriginPro 8, Stat Plus 2007. Для соблюдения условий возможности применения параметрических статистических методов мы осуществляли проверку анализируемых данных на подчинение закону нормального распределения (распределение Гаусса). Для этого использовали тест Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса, а также W-критерий Шапиро-Уилка. Дополнительно, для проверки закона нормального распределения мы использовали график нормальных вероятностей, или т. н. график «вероятностной бумаги». Проверку гипотезы о равенстве дисперсий осуществляли с помощью F-критерия. Проверку гипотезы о равенстве нескольких дисперсий осуществляли с помощью критерия Кохрэна. Учитывая, что условиям распределения Гаусса, а также равенству дисперсий удовлетворяла лишь часть эмпирических распределений признаков, проверку гипотезы о равенстве генеральных дисперсий во всех случаях проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни для независимых переменных [20, 21].
Результаты исследований и их обсуждение. Простота получения, относительная доступность и массовость сперматозоидов животных и рыб делают их популярными объектами в биологических, ветеринарных и сельскохозяйственных исследованиях, при изучении механизмов искусственного оплодотворения. Применение компьютерного анализа при исследовании качества спермы животных и рыб позволяет стандартизировать методику таких исследований и минимизировать субъективизм и человеческий фактор в процессе получения новых научных результатов.
В большинстве случаев сперма, получаемая у рыб в условиях технологии искусственного воспроизводства, находится в неподвижном состоянии. Однако при добавлении обычной воды, в которой осуществляется выращивание и содержание рыб, сперматозоиды приобретают подвижность. Поэтому очень важно в целях недопущения преждевременной активации в процессе получения половых продуктов у самцов рыб, тщательно вытирать полотенцем или марлевой салфеткой анальный и хвостовой плавники, а также место у анального отверстия. При этом необходимо следить, чтобы в пробирку не попали вода, полостная жидкость или экскременты рыбы. Сперматозоиды ленского осетра перед активацией водой представлены на рис. 1.
Рис. 1. Сперматозоиды ленского осетра перед активацией
В качестве анализируемых параметров мы использовали следующие показатели, получившие распространение при исследовании подвижности сперматозоидов человека в медицинских исследованиях [19]: VCL - криволинейная скорость (микрон/сек), усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль его реальной траектории, как она воспринимается в двухмерном пространстве под микроскопом; VSL - прямолинейная скорость (микрон/сек), усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль линии, проведенной между начальной и конечной точкой траектории; VAP - средняя скорость движения по траектории (микрон/сек), усредненная по времени скорость движения сперматозоида по усредненной траектории; WOB - колебание (величина, описывающая колебание реальной траектории относительно усредненной VAP/VCL); LIN - линейность (линейность реальной траектории). Схема траекторий подвижности сперматозоидов представлена на рис. 2.
Рис. 2. Показатели подвижности сперматозоидов ленского осетра [19]
Результаты апробации метода оценки подвижности сперматозоидов осетровых рыб в условиях ак-вакультуры с использованием современных методов компьютерной диагностики представлены в таблице. В результате наших исследований было установлено, что средняя криволинейная скорость сперматозоидов (УСЬ) ленского осетра, которая представляет собой усредненную по времени скорость движения сперматозоидов вдоль его реальной траектории, составила 173,37±1,59 микрон/сек. Средняя прямолинейная скорость (У8Ь), которая представляет собой усредненную по времени ско-
рость движения сперматозоидов вдоль линии, проведенной между начальной и конечной точкой траектории, составила 164,19±1,82 микрон/сек. Средняя скорость движения по траектории (УЛР), которая представляет собой усредненною по времени скорость движения сперматозоида по усредненной траектории, составила 171,22±1,20 микрон/сек.
Такой подробный анализ подвижности в случае необходимости оценки массового количества сперматозоидов от племенных производителей рыб позволяет формировать сперму по категориям подвижности. Выделяя пробы с быстрым и прямолинейным движением; пробы с медленным прямолинейным движением; пробы с непрямолинейным движением и пробы с полностью неподвижными сперматозоидами. При этом появляется возможность выявлять умершие или умирающие «от старости » сперматозоиды на фоне здоровых, «молодых» сперматозоидов.
Результаты измерений подвижности сперматозоидов осетровых рыб с использованием автоматизированного программного обеспечения ММС Сперм
Показатель подвижности Бдиница измерений Среднее значение Коэффициент вариации, % Ср. квадратичное отклонение
УСЬ микрон/сек 173,37±1,59 2,9 5,05
УЯЬ микрон/сек 164,19±1,82 3,5 5,76
УЛР микрон/сек 171,22±1,20 2,2 3,81
WOB - 0,99±0,01 2,7 0,02
ЬШ - 0,95±0,01 3,5 0,03
ЯТЯ - 0,96±0,10 3,2 0,31
В наших исследованиях мы также определяли продолжительность подвижности сперматозоидов, а также зависимость средней криволинейной скорости (УСЬ) от времени после активации водой (рис. 3).
Рис. 3. Зависимость средней криволинейной скорости (УСЬ) от времени после активации водой
Как видно, из данных, представленных на рис. 3, максимальные показатели средней криволинейной скорости у ленского осетра наблюдаются в первые 30 секунд после активации водой. Данный показатель стремительно падает уже к 90 секундам после активации. После 90 секунд в наших исследованиях наблюдалось значительное уменьшение показателя УСЬ, а затем полное прекращение подвижности. Аналогичная зависимость от времени после активации наблюдалась при изучении показателя процента (доли) подвижных сперматозоидов. Поэтому в процессе искусственного оплодотворения икры ленского осетра (и в целом осетровых) очень важно соблюдать четкую, последовательную технологическую цепочку и не допускать медлительности в действиях, начиная с момента запуска (разбавления спермы) до момента добавления осеменяющего раствора к икре. Наши результаты пока-
зывают, что длительное осеменение икры (более 90 секунд) нецелесообразно, т. к. возможность успешного оплодотворения икры резко снижается. Учитывая высокую клеящую способность икры, которая наступает уже через 3-5 минут после оплодотворения, передержка икры в осеменяющем растворе опасна, т. к. может вызвать преждевременное приклеивание икры в осеменяющей емкости.
Заключение. Использование компьютерных программ для исследования качества спермы рыб является перспективным для аквакультуры, особенно для племенной работы с ценными и редкими видами рыб. При этом компьютерный анализ дает ряд преимуществ. Например, захват изображений и видеоклипов в формате AVI с устройства ввода изображения, хранение текстовых данных, изображений и видеоклипов во встроенной базе данных, возможность проводить ручные измерения для индивидуальных задач. Статистика позволяет сделать дополнительные выводы о качестве спермы. Эти поля базы, как и результаты анализа подвижности и морфологии сперматозоидов, заполняются автоматически в процессе проведения анализа спермы. Статистику можно выводить на печать, предварительно выбрав соответствующий шаблон отчета.
В процессе исследований, нами был впервые применен компьютерный анализ оценки качества спермы рыб в условиях аквакультуры Беларуси. При этом открытым остается вопрос нормирования качества спермы рыб не только у осетровых, но и других объектов аквакультуры. Однако этот вопрос -тема последующих публикаций.
Исследования выполнялись при финансовой поддержке инновационного фонда Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь (договор № 297).
ЛИТЕРАТУРА
1. Григорьев, С. С. Индустриальное рыбоводство. Ч. 2: интенсивное разведение рыбы в индустриальных условиях: учебное пособие / С. С. Григорьев, Н. А. Седова; под ред. Г. Ф. Майорова. - Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2008. -353 с.
2. Комлык, И. П. Биотехника размножения. Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» / И. П. Комлык, В. Ю. Сиротинина - Петрозаводск: ПТУ, 2002. - 43 с.
3. Лабораторная диагностика мужского бесплодия / В. В. Долгов [и др.]. - M. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. - 145 с.
4. ММС Сперм [Электронный ресурс] / - Режим доступа: http://www.mmcatalog.com/index.html. - Дата доступа: 08.10.2013.
5. Подбор криопротекторов и оптимизация режимов охлаждения спермы русского осетра при криоконсервации / Е. Н. Пономарева [и др.] // Вестник КБГУ. Биологические науки. - 2006. - Вып. 8. - С. 66-69.
6. Тур даков, А. Ф. Воспроизводительная система самцов / А. Ф. Турдаков. - Фрунзе «Илим», 1972. - 280 с.
7. A preliminary study of oscillating electromagnetic field effects on human spermatozoon motility / R. Iorio [et al.] // Bioelec-tromagnetics. - 2007. - Vol. 28. - № 1. - P. 72-75.
8. Chebanov, M. S. Sturgeon hatchery manual / M. S. Chebanov, E. V. Galich. - FAO, Ankara. - 2013. - 303 p.
9. Donoghue, A. M. Effects of water- and lipid-soluble antioxidants on turkey sperm viability, membrane integrity, and motility during liquid storage / A. M. Donoghue, D. J. Donoghue // Poultry Science. - 1997. - Vol. 76. - № 10. - P. 1440-1445.
10. Effect of 655-nm diode laser on dog sperm motility / M. I. Corral-Baques [et al.] // Lasers Med Sci. - 2005. - Vol. 20. - № 1. -P. 28-34.
11. Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh ejaculates / T. Rigau [et al.] // Therioge-nology. - 2001. - Vol. 56. - P. 801-815.
12. Factors affecting sperm motility. III. Influence of visible light and other electromagnetic radiations on human sperm velocity and survival / A. Makler [et al.] // Fertil Steril. - 1980. - Vol. 33. - № 4. - P. 439-444.
13. Fauvel, C. Evaluation of fish sperm quality / C. Fauvel, M. Suquet, J. Cosson // Journal of Applied Ichthyology. - 2010. -Vol. 26, Iss. 5. - P. 636-643.
14. Improvement of stored turkey semen quality as a result of He-Ne laser irradiation / N. Iaffaldano [et al. ] // Anim Reprod Sci. -2005. - Vol. 85. - № 3-4. - P. 317-325.
15. In vitro capacitation and acrosome reaction of dog spermatozoa can be feasibly attained in a defined medium without glucose / J. L. Albarracin [et al.] // Reprod Dom Anim. - 2004. - Vol. 39. - P. 1-7.
16. Influence of Visible Light and Ultraviolet Irradiation on Motility and Fertility of Mammalian and Fish Sperm / T. Zan-Bar [et al.] // Photomedicine and Laser Surgery. - 2005. - Vol. 23. - № 6. - P. 549-555.
17. Low energy narrow band non-coherent infrared illumination of human semen and isolated sperm / R. Singer [et al.] // Andro-logia. - 1991. - Vol. 23. - № 2. - P. 181-184.
18. Radiation exposure exerts its adverse effects on sperm maturation through estrogen-induced hypothalamohypophyseal axis inhibition in rats / M. J. Makinta [et al.] // African Zoology. - 2005. - Vol. 40. - № 2. - P. 243 -251.
19. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Fifth edition. World Health Organization. -2010. - 271 p.
20. Glantz, S. A. Primer of Biostatistics. / S. A. Glantz. - McGraw-Hill: New York, 2011. - 320 p.
21. Hill, T. Statistics: Methods and Applications / T. Hill, P. Lewicki. - StatSoft, Inc., 2005. - 800 p.
