CC BY
20УДК 631.453:547.759.33:582.282.123.4:611.24:599.323.4
ОЦЕНКА ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНВАЗИВНОМ АСПЕРГИЛЛЕЗЕ НОВОГО ЗАМЕЩЕННОГО КАРБАЗОЛА PLX01107
1,2 Еремина Н.В. (руководитель проекта), 1 Казей В.И. (директор по доклиническим исследованиям), 2 Сорокина А.В. (в.н.с.), 2 Алексеева С.В. (с.н.с.), 3 Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), 3 Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, 3 Выборнова И.В. (н.с.), 3 Босак И.А. (с.н.с.), 3 Елинов Н.П. (проф. кафедры), 3 Игнатьева С.М. (в.н.с), 3Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), 3Степанова А.А. (зав. лаб.), 3Фролова Е.В. (зав. лаб.), 3Филиппова Л.В. (с.н.с.), 3Чилина Г.А. (зав. лаб.), 4 Пурмаль А.А. (вице-президент по химическому развитию) 1 ООО «Панацела Лабс», Москва, Россия; 2 НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова, Москва, Россия; 3 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия; 4 Кливленд БиоЛабс, Инк., Баффало, Нью-Йорк, США
©Коллектив авторов, 2016
Соединение PLX01107, являющееся производным карбазола, ранее продемонстрировало антимикотический потенциал in vitro в отношении Aspergillus fumigatus [1]. В настоящей работе оценена острая токсичность и противогрибковая активность PLX01107 in vivo.
При однократном внутривенном введении среднелетальная доза ЛД50 PLX01107 составила 64,9 мг/кг - у самок и 56,6 мг/кг - у самцов беспородных белых мышей; при пероральном введении: 85,7 мг/кг - у самок и 94,4 мг/кг - у самцов. ЛД50, определенная при внутривенном введении, составила 30,6 мг/кг - у самок и 30,1 мг/кг - у самцов беспородных белых крыс, а при пероральном введении самкам - 80,3 мг/ кг, самцам - 79,0мг/кг.
Эксперименты по оценке противогрибковой активности осуществляли на модели инвазивного аспергиллеза легких у мышей. Эффект оценивали путем сравнения долей выживших животных с отрицательным высевом из легких в разных группах. В качестве препарата сравнения использовали вориконазол (Вифенд", Пфайзер) в дозе 25 мг/кг. PLX01107 в дозах 1, 3 и 9 мг/кг, вводимый в течение 5 дней внутривенно мышам, интраназально зараженным A. fumigatus, не оказывал значимого эффекта на регистрируемый показатель.
Таким образом, карбазольное соединение PLX01107 относится к 3 классу токсичности и, в отличие от вориконазола, не проявляет противогрибковую активность в дозах 1, 3 и 9 мг/кг на модели аспергиллеза легких у мышей.
Ключевые слова: карбазольные соединения, модель аспергиллеза легких у мышей, острая токсичность, PLX01107
Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, тел.: (812) 510-62-69
EVALUATION OF ACUTE TOXICITY AND EFFICACY IN EXPERIMENTAL INVASIVE ASPERGILLOSIS OF A NEW CARBAZOLE DERIVATIVE PLX01107
1,2 Eremina N.V. (project manager), 1 Kazey V.I. (director of preclinical researches), 2 Sorokina A.V. (leading scientific collaborator), 2 Alekseeva S.V. (senior scientific collaborator), 3 Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the chair), 3 Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 3 Vybornova I.V. (scientific collaborator), 3 Bosak I.A. (senior scientific collaborator), 3 Yelinov N.P. (professor of the chair), 3 Ignatyeva S.M. (leading scientific collaborator), 3 Avdeenko Yu.M. (senior scientific collaborator), 3 Stepanova A.A. (head of the laboratory), 3 Frolova E.V. (head of the laboratory), 3 Filippova L.V. (senior scientific collaborator), 3 Chilina G.A. (head of the laboratory), 4 Purmal A.A. (vice president of chemistry) 1 Panacela Labs LLC, Moscow, Russia; 2 Zakusov Institute of Pharmacology, Moscow, Russia; 3 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia; 4 Qeveland BioLabs, Inc., Buffalo, NY, USA
©Collective of authors, 2016
Carbazole derivative PLX01107 has previously demonstrated antifungal potential in vitro against Aspergillus fumigatus [1]. In the present research the acute toxicity and in vivo antifungal activity of PLX01107 was evaluated.
The average lethal doses LD50 of PLX01107 evaluated in white outbred mice were 64,9 mg/kg in female and 56,6 mg/kg in male after single intravenous administration, and 85,7 mg/kg in female and 94,4 mg/ kg in male after oral administration. LD50 evaluated in white outbred rats were 30,6 mg/kg in female and 30,1 mg/kg in male after single intravenous administration, and 80,3 mg/kg in female and 79,0 mg/kg in male after oral administration.
Murine invasive pulmonary aspergillosis model was used in the experiment to estimate the antifungal activity. The effect was evaluated by comparing the percentage of surviving animals with negative inoculation from lungs. Voriconazole (Vifend", Pfizer), 25 mg/kg, was used as a comparator. PLX01107 at doses of 1, 3 and 9 mg/kg administered intravenously 5 days daily to intranasally infected with A. fumigatus mice did not cause any significant effect on the registered parameter.
Thus, carbazole derivative PLX01107 relates to the 3rd class of toxicity and does not demonstrate antifungal activity at doses of 1, 3 and 9 mg/kg on murine invasive pulmonary aspergillosis model in contrast to voriconazole.
Key words: acute toxicity, carbazole compounds, murine invasive pulmonary aspergillosis model, PLX01107
ВВЕДЕНИЕ
Инвазивные грибковые заболевания, вызванные грибами рода Aspergillus, являются важной причиной летальности пациентов с ослабленным иммунитетом [2, 3]. Развитие резистентности у патогенных видов Aspergillus к существующим средствам терапии обусловливает необходимость разработки новых противогрибковых лекарств [Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. // Иммунопатол., аллергол., инфектол. - 2004. - №1].
В ходе фармакологической оптимизации структуры ранее изученного карбазольного соединения CBL0100 [4, 5] был синтезирован ряд новых веществ с потенциальной противоинфекционной активностью.
■
В частности, было обнаружено, что карбазольное соединение PLXQ11Q7 в концентрациях 5-2Q мкМ проявляет выраженную противогрибковую активность в отношении широкого ряда патогенных микромицетов, что определило перспективу его разработки в качестве противогрибкового средства [l]. Необходимый этап этой работы - исследование противогрибковой активности соединения PLXQ11Q7 in vivo и оценка параметров острой токсичности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали субстанцию PLXQ11Q7 (6-(2-Диэтиламиноэтил)-9-оксазол-2-ил-1,2-дигидро-6Н-циклопента[с]карбазол-3-он; ЗАО «Фарм-Синтез»), готовые лекарственные формы и плацебо (3Q% гидроксипропил бетациклодекстрин (HPßCD) в 5Q мМ ацетате натрия) (ООО «Биоинтегратор»). Надлежащее качество препаратов было подтверждено соответствующими фармакопейными методиками [6]. В качестве препарата сравнения использовали ворико-назол (Вифенд®, Пфайзер). Выбор доз вориконазола определяли по данным предварительных исследований и сведениям из научной литературы [7; Denning D.W., Warn P. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 4, №11].
Эксперименты выполняли на сертифицированных животных (Филиалы «Андреевка» и «Столбовая» ФГБУН «НЦ биомедицинских технологий» ФМБА России), которых содержали в контролируемых условиях окружающей среды: 18-26 °C, относительная влажность воздуха -3Q-7Q%, 12-ти часовой цикл освещения и 8-Ю-ти кратная смена объема воздуха в час. Все процедуры с животными были утверждены Этическими комитетами учреждений.
Изучение острой токсичности PLXQ11Q7 при однократном внутривенном и пероральном введении мышам и крысам проводили на 279 аутбредных мышах (153 самца, 126 самок) и 18Q аутбредных крысах (9Q самцов, 9Q самок) в соответствии с действующими рекомендациями по доклиническим исследованиям [8]. PLXQ11Q7 (в концентрациях 1Q мг/мл и 5 мг/мл в составе готовой лекарственной формы (3Q% HPßCD в 5Q мМ ацетате натрия)) предельно медленно вводили в хвостовую вену мышам в объеме Q,5 мл, крысам - 2,Q мл и перорально с помощью металлического атравма-тического зонда мышам - в объеме Q,5 мл, крысам -5,Q мл. Животных наблюдали в течение 14 дней после введения препаратов. Среднелетальные дозы рассчитывали по методу Литчфилда - Уилкоксона [Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1998].
Для изучения противогрибковой активности PLXQ11Q7 in vivo на мышиной модели инвазивного аспергиллеза легких использовали штамм A. fumigatus РКПГ F 1384 (Российская коллекция патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России). Исследование проводили на 168 самцах мышей BALB/С (массой 22-23 г), которые были распределены в 9 групп: группы 1-3 - лечение PLXQ11Q7 в дозах 9, 3 и 1 мг/кг, группа 4 - лечение вориконазолом (25 мг/ кг), группы 5-8 - контрольные (мониторинг нейтропе-нии, плацебо, без лечения, без заражения). Введение препаратов осуществляли путем внутривенной инъекции животным ежедневно в течение 5 дней, спустя
сутки после инфицирования. Заражение мышей проводили путем интраназального введения 0,05 мл взвеси конидий гриба в концентрации 1-107 КОЕ/мл в 0-й день исследования в соответствии с ранее описанной методикой [9].
Развитие инвазивного аспергиллеза подтверждали присутствием галактоманнана (антигена A. fumigatus) в сыворотке крови зараженных мышей (тест-система «Platelia Aspergillus Ag», Bio-Rad Laboratories, США; пороговая величина коэффициента оптической плотности - 0,5 в соответствии с инструкцией производителя), а также результатами гистопатологического (количество и размер очагов поражения A. fumigatus, выявляемые при окрашивании срезов тканей легких гематоксилин-эозином, по Гомори-Грокотт и PAS-методом) и культурального (количество жизнеспособных клеток гриба на единицу массы легкого (КОЕ/г)) исследований.
Противогрибковую активность соединений оценивали через 14 дней после инфицирования по доле выживших животных, у которых при посеве легких не было роста A. fumigatus, в соответствующих экспериментальных группах мышей в сравнении с результатами контрольных групп.
Полученные в ходе исследования данные статистически обрабатывали с помощью программы Statistica 6.0 for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В остром эксперименте установлено, что PLX01107 в выбранном диапазоне дозировок при внутривенном и пероральном введении в отдельных дозах вызывает гибель части животных (табл.).
Таблица
Летальность мышей и крыс после однократного перорального и внутривенного введения PLX01107 к 14 дню
наблюдения в остром эксперименте
Мыши Крысы
Перорально Внутривенно Перорально Внутривенно
Доза, мг/ кг Количество погибших / всего в Доза, мг/кг Количество погибших / всего в Доза, мг/кг Количество погибших / всего в группе Доза, мг/ кг Количество погибших / всего в
группе группе группе
50 0/12 25 0/12 70 1/6 25 1/12
75 1/12 50 6/24 75 3/12 30 5/12
80 3/12 60 3/6 80 3/6 35 10/12
90 4/15 70 4/6 85 5/6 40 12/12
100 19/24 75 10/12 90 11/12
125 12/12 100 23/24 100 12/12
При внутривенном введении РЬХ01107 ЛД50 составила у самок беспородных белых мышей 64,9 (52,2^80,7) мг/кг, у самцов - 56,6 (48,9^65,5) мг/кг, при пероральном: у самок - 85,7 (77,3^95,0) мг/кг, у самцов - 94,4 (86,9^102,7) мг/кг. ЛД50, определенная при внутривенном введении самкам беспородных белых крыс, составила 30,6 (26,7^35,7) мг/кг, самцам - 30,1 (25,4^35,7) мг/кг, при пероральном введении: самкам - 80,3 (75,9^76,0) мг/кг, самцам - 79,0 (72,2^ 86,5) мг/кг. Не было выявлено существенных половых и видовых различий в реакциях на введение РЬХ01107.
При патологоанатомическом исследовании животных, павших после однократного внутривенного или перорального введения РЬХ01107, установлено, что гибель наступала в результате патологических изменений со стороны желудочно-кишечного тракта и обе-
звоживания.
Анализ совокупности данных по оценке острой токсичности позволил отнести соединение РЬХ01107 к третьему классу токсичности по К.К. Сидорову (Токсикология новых промышленных химических веществ. - Л., 1973) и ко второму классу опасности -по ГОСТ 12.1.007-76 [10].
У мышей с экспериментальным аспергиллезом легких показатели содержания галактоманнана (коэффициенты оптической плотности -1,11+1,80) во всех группах превышали контрольные значения, что являлось показателем активного протекания инфекционного процесса. Все колонии грибов, выделенные при высевах тканей легких на плотную питательную среду, не отличались по макро- и микроскопическим морфологическим признакам от штамма А. fumigatus РКПГ Б 1384, использованного для заражения. Воспалительная реакция в ткани была представлена немногочисленными нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами, наблюдали полнокровие и присутствие участков неравномерной воздушности в виде эмфиземы и ателектазов, отеков.
Динамика гибели животных при экспериментальном аспергиллезе представлена на рисунке 1.
— PLX01107 9МГ/КГ " "плацебо
- PLX01107 ЗМГ/КГ —Ж—Вормконазол 25 мг/кг
' PLX01107 1 мг/кг _ контрол ь без
РЬХ01107 в дозах 3 мг/кг и 1 мг/кг, роста А. fumigatus не обнаружили. Из легких одной выжившей мыши из группы РЬХ01107 9 мг/кг выявлен А. fumigatus в количестве 1,6-102 КОЕ/г. При посеве легких от 7-ми из 8-ми (87,5%) выживших животных, леченных вори-коназолом, А. fumigatus не выделен; из легких 1 мыши из этой группы получен рост гриба в концентрации 7,3-103 КОЕ/г. При статистической обработке результатов культурального исследования легких мышей из групп леченных животных не отмечали достоверных различий.
Результаты эффективности лечения зараженных мышей разными препаратами представлены на рисунке 2. В контрольной группе без лечения высевы А. fumigatus получены из легких всех погибших мышей (доля животных с отрицательным высевом - 0 %).
Плацебо
PLX01 107 3 мг/кг PLX01107 1 мг/кг Вориконазол 25
мг/кг
Рис. 1. Динамика гибели животных, интраназально зараженных А. ^т1даи и леченных различными дозами PLX01107 и вориконазолом.
Выживаемость животных, леченных РЬХ01107 в максимальной дозе 9 мг/кг, была достоверно ниже, чем в остальных группах зараженных животных (р<0,003), в то время как в группе животных, леченных ворико-назолом, выживаемость оказалась значительно выше (р<0,01).
При посеве легких, отобранных у подавляющего большинства (96%) мышей из групп зараженных животных, погибших в ходе эксперимента, выделен А. fumigatus в количестве от 104 до 102 КОЕ/г. Нагрузка гриба в ткани легких во всех группах уменьшалась с течением времени после заражения. При посеве легких мышей, выживших к концу эксперимента (14 день после заражения), в группах животных, леченных
Рис. 2. Доля выживших животных с отрицательным высевом из легких мышей, зараженных A. fumigatus и леченных различными дозами PLX01107 и препаратом сравнения.
* - статистически значимое отличие от группы контроля без лечения
В группе мышей, леченных PLX01107 в дозе 9 мг/кг, A. fumigatus был выделен из легких всех исследованных мышей (0% животных с отрицательным высевом, p<0,05), поэтому данные по этой группе не представлены на рисунке.
В экспериментах на инфицированных животных PLX01107 не проявил противогрибковой активности. Показатели выживаемости мышей с отрицательным высевом возбудителя были сравнимы с контрольными (без терапии), в отличие от леченных вориконазолом.
Таким образом, следует констатировать отсутствие противогрибковой активности PLX01107 при экспериментальном аспергилезе легких. Это существенно ограничивает его дальнейшую разработку в качестве противогрибкового средства при инвазивном аспер-гиллезе и требует тщательной проверки в экспериментах in vivo противогрибковой активности, выявленной in vitro в отношении других возбудителей [5].
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
4.
GurovaK., RydkinaE., Wade W. Carbazole compounds and method ofusing same. Патент на изобретение PCT/RU2013/000683. Васильева Н.В., Климко Н.Н., ЦинзерлингВ.А. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации// Вестник СЗГМУ им. И.И. Мечникова. - 2010. - Т. 2. №4. - С. 5-18.
Denning D.W., Pleuvry A., Cole D.C. Global burden of chronic pulmonary aspergillosis as a sequel to pulmonary tuberculosis// Bull World Health Organ. - 2011. -Vol. 89, №12. - P. 864-72.
Еремина Н.В., Жанатаев А.К., Чайка З.В. и др. Скрининг противогрибковой активности карбазол-замещенных соединений и оценка генотоксичности молекул-лидеров// Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, №3. - С. 42-47.
Еремина Н.В. Казей В.И., Чурин А.А. и др. Пилотные исследования эффективности и острой токсичности двух лекарственных композиций инновационного препарата CBL0100 для лечения микозов //Проблемы медицинской
0
0
8
11
15
микологии. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 23-28.
6. Государственная Фврмакопея Российской Федерации (XII издание). Часть 1. - М: Изд-во «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. - 704 с.
7. Salas Valentina, F. Javier Pastor, Enrique Calvo, et al. Evaluation of the In vitro activity of voriconazole as predictive of in vivo outcome in a murine Aspergillus fumigatus infection model// Antimicrob. Agents Chemother. - 2013. - Vol. 57, №3. - P. 14041408.
8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. - М.: Гриф и К, 2012.
9. Васильева Н.В., Богомолова Т.С., Степанова А.А. и др. Особенности моделирования аспергиллеза легких у мышей в зависимости от вирулентности штаммов Aspergillus fumigatus// Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №2. - С. 50-51.
10. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.
Поступила в редакцию журнала 13.12.2016
Рецензент: Н.Н. Климко
