CC BY
52
УДК 617.7
Галимова Л.Ф., Курчатова Н.Н., Степанов М.В., Юсупова Р.Ш., Усманова А.Ф.
ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России, г.Уфа
Е-mail: morphoplant@mail.ru
ОЦЕНКА ОБЩЕГО ИММУННОГО СТАТУСА ПАЦИЕНТОВ С ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ СУБАТРОФИЕЙ ГЛАЗА
В данной работе приведены результаты иммунологического обследования пациентов с по-сттравматической субатрофией глазного яблока. Выявлены наиболее характерные особенности иммунного статуса этого контингента больных, выражающиеся в повышении количества имму-нокомпетентных клеток, приводящих к запуску аутоагрессивных изменений в организме.
Ключевые слова: посттравматическая субатрофия, увеит, энуклеация, иммунная система, лимфоциты, активационные рецепторы, цитотоксичность, аутоантителообразование, моноклональные антитела, свободно-радикальные процессы.
Актуальность
По данным Министерства здравоохранения РФ (1999 г.) ежегодно в России выполняется порядка 7,5-8 тысяч энуклеаций глаз, из которых до 80,6% приходится на посттравмати-ческую субатрофию [3]. Между тем энуклеация глаза для больных, особенно женщин и детей, является тяжелой психической травмой; функциональные же результаты протезирования при анофтальме уступают таковым при протезировании субатрофичных глаз [2,1,4].
Как известно, одним из ведущих патогенетических механизмов субатрофии является вялотекущий воспалительный процесс иммунного гене-за в травмированном глазу. Повреждение гемато-офтальмического барьера приводит к развитию аутоиммунного воспалительного процесса, связанного с запуском клеточного и гуморального ответа на ткани глаза. Главная роль в патогенезе формирования аутоагрессии принадлежит накоплению пула сенсибилизированных лимфоцитов по отношению к тканеспецифическим антигенам глаза (роговицы, хрусталика и сетчатки) и, как следствие, развитие цитотоксических клеточных реакций и гуморального ответа в результате синтеза антигенспецифических антител. Хирургическое вмешательство, как повторная травма, может явиться фактором рецидива иммунного воспаления, в самом тяжелом случае приводящего к развитию симпатической офтальмии. Поэтому оперативное лечение последствий травмы органа зрения необходимо проводить в периоде ремиссии на наиболее благоприятном иммунологическом фоне, исключающем наличие цитотоксичес-ких процессов в организме и при отсутствии гуморальных реакций. В этой связи представляется важным не только определение гуморального и клеточного ответа к тканеспецифическим анти-
генам глаза, но и оценка общих параметров иммунного статуса пациента для исключения риска развития аутоиммунного процесса.
Цель исследования
Изучение особенностей иммунного статуса пациентов с диагнозом посттравматической субатрофии глазного яблока.
Материалы и методы
Исследования проводились 26 пациентам с посттравматической субатрофией глазного яблока, у которых увеит протекал, преимущественно, в хронической вялотекущей форме. Возраст пациентов составил от 5 до 61 года, из которых до 40 лет было 21 пациент, детей - 3. Сроки после травмы составили от 3 до 24 лет. Развитию субатрофии глаза предшествовали проникающие ранения: корнеосклеральной локализации у 12 пациентов, склеральной - у 8, роговичной - у 6. Полностью зрение отсутствовало у 15 пациентов, у 7 определялась неправильная светопроек-ция и у 3 - правильная светопроекция.
Взятие крови осуществляли строго натощак из локтевой вены в строго стерильных условиях. Для иммунологического исследования отбиралось 4 мл крови в пробирку VACUETTE-K3EDTA для постановки общеклинического анализа крови и иммунофенотипирования лимфоцитов, 10 мл в пробирку VACUETTE-Lithium Heparin для постановки реакции фагоцитоза, НСТ-теста, оценки бласттрансформации лимфоцитов и в пробирку VACUETTE-Serum Clot Activator для определения количества сывороточных иммуноглобулинов, антигенспецифических антител, острофазных белков и цитокинов.
Общеклинические методы исследования проводились с использованием гематологичес-
кого анализатора AcTDiff2 (Beckman Coulter, США).
Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили с использованием панели моноклональных антител фирмы BeckmanCoulter и Caltag (США). Результаты учитывались на однолазерном проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Клеточный ответ на митогены и тканеспецифические антигены глаза проводилась в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) по методу, описанному Gaines H. et al., 1996 [11]. Учет реакции также проводился на проточном цитофлуориметре через 3 суток культивирования клеток с митогенами. Наличие клеточного ответа учитывали по индексу стимуляции - отношению количества пролиферирующих лимфоцитов в исследуемых образцах к количеству клеток в контрольных культурах.
Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по способности клеток поглощать частицы латекса (диаметр частицы 1,49 мкм).
Определение общей окислительно-восстановительной активности нейтрофилов проводили в тесте восстановления нитросинего тет-разолия (НСТ-тест). Кислородный взрыв оценивали в покоящихся нейтрофилах и в клетках, активированных зимозаном.
Уровни содержания сывороточных IgG, IgA и IgM определяли иммунохимическим методом с помощью биохимического анализатора SYNCHRON CX 5 PRO (Beckman Coulter).
Количественное содержание общего ИЛ-6 определяли в анализаторе A^ECS 2 (Beckman Coulter).
В качестве методов статистической обработки результатов были применены стандартные методы параметрической и непараметрической статистики с использованием программы STATISTICA 6.0. [8].
Результаты и обсуждение
В ходе проведенного обследования было выявлено, что общеклинические показатели анализа крови пациентов (количество лейкоцитов, параметры лейкоцитарной формулы, показатель СОЭ) не выходят за рамки общепринятых нормативов, принятых для России и Республики Башкортостан. Поэтому наибольший интерес для исследования представляло изучение показателей субпопуляционной структуры лимфоцитов, отражающей особенности иммунной системы для данной патологии. В данной работе оценивалось количество основных субпопуляций лимфоцитов, так и экспрессия мембранных активационных маркёров на этих клетках. Результаты расценивались нами как предварительные и сравнивались с нормативными иммунологическими показателями, принятыми для здоровых людей Поволжского и Уральского региона России, а также внутри-лабораторными нормами ВЦГПХ (табл.1).
Как видно из таблицы, количество основных субпопуляций лимфоцитов (Т- и В-лимфоци-
Таблица 1. Показатели иммунофенотипирования лимфоцитов у пациентов с посттравматической субатрофией глазного яблока
Показатель Нормативные показатели, % Показатели у пациентов, M±SD, %
CD3+CD16-(T-nHi^oqHTbi) 53-82 72,4±6,52
CD3 +CD4+(T-хелперы) 35-55 39,9±9,23
CD3+CD8+(HHTOTOKCH4ecKHe T-лимфоциты) 18-35 29,8±6,9
Соотношение CD4+/CD8+(HPK) 1,4-2,3 1,45
CD 19+(В-лимфоциты) 6-21 10,4±3,88
CD3-CD16+CD5 6+(Ж-клетки) 9-23 15,2±5,1
CD3-CD8+(активирoванные NK) 1,5-6 6,8±2,83
CD3+CD16+(TNK-клетки) 0-10 20,0±8,9
СD4+CD25+(Pецептoр ИЛ-2 на T-лимфоцитах) 7-17 10,8±4,91
CD25+(cyMMapHbrn) 13-25 15,1±6,81
CD4+HLA-DR+(aктивирoвaнные T-лимфоциты) 1-5 3,3±1,96
HLA-DR+(cyммaрный) 6-22 21,2±8,02
CD38+8+ 1-15 21,1±8,17
CD5+19+ Не более 1/3 от числа В-Лф 3,9±2,26
ты) не выходило за пределы нормативных показателей. Соотношение количества активных Т-хелперов к содержанию числа цитотоксических лимфоцитов (CD/-4+/CD8+, иммунорегулятор-ный коэффициент) не было нарушено. Признаков гиперэкспрессии активационных рецепторов, CD25+ и НLA-DR+ (основной маркёр гистосовместимости II класса, показатель антиген-презентативного процесса) также не отмечалось. Активация Т-клеточного звена иммунитета, описанная рядом исследователей [10,5] характерна для развития острых увеальных процессов. Исследуемая нами группа включала в себя пациентов, имеющих длительный «стаж» заболевания (до 24 лет), патологический процесс у них перешел в вялотекущую форму.
Количество натуральных киллеров CD3-CD16+CD56+ также не выходило за пределы нормальных значений, однако обращает на себя внимание, что отмечалось увеличение популяции клеток с фенотипом CD3-CD8+, характерным для NK в их активированном состоянии. Активация NK является одним из основных признаков развития аутоагрессии [9]. Наиболее выраженной особенностью для исследуемой группы явилось высокое количество CD3-пози-тивных клеток (Т-лимфоциты) с одновременной рецепцией СD16+, являющегося «профессиональным» маркёром натурального киллера. В последние годы многими исследователями этой уникальной группе клеток уделяется большое внимание в плане оценки риска развития аутоиммунных заболеваний [12].
Также важным фактором развития аутоагрессии в организме является активация популяции цитотоксических лимфоцитов CD8+, несущая на мембранах рецептор CD38+ [7]. В нашей группе обследуемых этот показатель также превышал нормативные значения.
Что касается экспрессии рецептора CD5+ на В-лимфоцитах, являющимся показателем аутоантителообразования - в данной группе обследуемых был получен большой разброс данных. Необходимо отметить, что оценка этого показателя является очень важной для каждого конкретного клинического случая и должна проводиться в сочетании с анализом других иммунологических показателей.
Анализ митогенного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные стимуляторы (РНА, ConA и PWM) не выявил отличий от показателей здо-
ровых людей. Этот вид исследования считается важным в рамках исключения иммунодефицит-ных состояний [13] и, возможно, не является показательным для пациентов с посттравматичес-кой субатрофией глаза.
Оценка функциональных показателей нейт-рофильного звена является обязательным требованием для оценки неспецифического звена иммунитета. Нарушения фагоцитоза и формирования свободно-радикальных процессов в этих клетках являются причинами развития многих иммунопатологических состояний. В частности усиление эффекта кислородного взрыва в этих клетках может осуществлять цитотоксическое действие на клетки и ткани организма, что является одной из причин развития аутоиммунного процесса [6]. В обследуемой группе показатели фагоцитарной активности нейтрофилов соответствовали нормальным значениям. Однако, оценка оксидатив-ных показателей в этих клетках, оцениваемая в НСТ-тесте, выявила их высокую вариабельность. Разброс данных составил от 1 до 26% (при норме 1 - 9%). Этот факт также свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к назначению оперативного вмешательства, проведению предоперационного лечения.
Также высокий коэффициент вариабельности ^У=67,8) был получен для определения показателя воспалительного процесса в сыворотке крови - уровня ИЛ-6. Разброс данных составил от 0,51 до 9,19 Пкг/мл (норма 1 - 4,5 Пкг/мл). Содержание сывороточных иммуноглобулинов IgG, ^А и ^М в обследуемой группе соответствовало нормальным значениям.
Заключение
Таким образом, исходя из вышеизложенных особенностей иммунного статуса пациентов с по-сттравматической субатрофией глаза, а именно, увеличением количества лимфоцитов цитотокси-ческого ряда, повышенной экспрессией активационных рецепторов на этих клетках, усилением свободно-радикальных процессов в нейтрофилах, -следует строго индивидуально подходить к хирургическому лечению этих пациентов, учитывать иммунологические факторы риска возникновения симпатической офтальмии. Результаты послеоперационных исследований иммунного статуса и методы иммуннокоррекции у пациентов с пост-травматической субатрофией глаза будут опубликованы в последующих работах.
11.02.2013
Список литературы:
1. Вериго Е.Н. Патогенез, клиника, профилактика и лечение посттравматической субатрофии глаза.- Авторефер. дис...докт. мед.наук.-М.,1986.-46с.
2. Галимова Л.Ф., Мулдашев Э.Р., Муслимов С.А., Сибиряк С.В., Рыжов В.А. Косметические результаты хирургического лечения посттравматической субатрофии глазного яблока с применением биоматериалов Аллоплант и с последующим протезированием// Вестник офтальмологии. - 2000.- Т. 116. - N 6. - С. 28-31
3. Давыдов Д.В. Медико-биологичекие аспекты комплексного использования биоматериалов у пациентов с анофтальмом.// Автореф. дисс. .доктора мед. наук.- М.-2000-46с.
4. Друянова Ю.С., Вериго Е.Н., Беглярбекян Е.Н. О протезировании субатрофичных и атрофичных глаз//Вестн.офталь-мологии.-1981.-Ы4.-С.62-64
5. Ермакова Н.А. Общие представления о патогенезе увеитов//Российский медицинский журнал.-2003. -№4. -С.141
6. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. Санкт-Петербург, «Интермедика», 2002. - 600 с.
7. Луговская С.А. Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. М., 2005. - 166с.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. - 312с.
9. Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Цитометрический анализ в клинической иммунологии. Екатеринбург, 2011. -221с.
10. Chan C.C., Mochizuki M., Palestine J. Kinetics of T-lymhpocyte susets in the eyes of Levis rats with experimental autoimmune uveits. // Cell immunology - 1985. - Vol. 96. - P. 430 - 434
11. Gaines H, Anddersson L, Biberfeld G. A new method measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry//J. Immun. Methods, 1996, 195, P.63-72
12. Mercer J.C., Ragin M.J., August A., Natural killer T cells: rapid responders controlling immunity and disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005,37: 1337-1343.
13. Stites D.P. Clinical laboratory methods for delection of cellular immunity // Basic and clinical immunology / Ed. Stites D.P., Terr A.I., Parslow T.G. - Norwalk, Connecticut: Appleton and Lange, 1994.
Сведения об авторах:
Галимова Лилия Фуатовна, кандидат медицинских наук, офтальмохирург высшей категории,
заведующая хирургическим отделением №2 Курчатова Нэлли Наилевна, кандидат биологических наук, заведующая клинико-иммунологической
лабораторией Степанов Михаил Владимирович, биолог КДЛ Юсупова Рина Шаидовна, кандидат биологических наук, врач-лаборант Усманова Алина Фларитовна, врач
UDC 617.7
Galimova L.F., Kurchatova N.N., Stepanov M.V., Yusupova R.Sh., Usmanova A.F.
E-mail: morphoplant@mail.ru
EVALUATION OF THE GENERAL IMMUNE STATUS AT PATIENTS WITH POST-TRAUMATIC EYE SUBATROPHY
In this report there are represented the results of the immunological examination of patients suffering from post-traumatic eyeball subatrophy. There were revealed the most characteristic peculiarities of the immune status of the patients such as increase of the number of immuno-component cells resulting in the start of the auto-aggressive changes in the organism.
Key words: post-traumatic subatrophy, uveitis, enucleation, immune system, lymphocytes, activation receptors, cytotoxicity, autoantibody formation, monoclonal antibodies, free-radical processes.
Bibliography:
1. Verigo E.N. Pathogenesis, clinic, prophylaxis and treatment of the eyeball post-traumatic subatrophy. - Author’s abstract ... doc. of medical sciences. - M. 1986. - 46p.
2. Galimova L.F., Muldashev E.R., Muslimov S.A., Sibiryak S.V., Ryzhov V.A. Cosmetic results of the surgical treatment of the eyeball post-traumatic subatrophy with the use of alloplant biomaterials and subsequent prosthetics // Journal of ophthalmology. - 2000. - V.116. - N. 6. - P. 28-31.
3. Davydov D.V. Medical and biological aspects of the alloplant biomaterial complex usage in anophthalmic patients // Author’s abstract ... doc. of medical sciences. - M. 2000. - 46 p.
4. Druyanova Yu.S., Verigo E.N., Beglyarbekyan E.N. Prosthetics of subatrophic and atrophic eyes // Journal of ophthalmology. - 1981. - N. 4. -P.62-64.
5. Ermakova N.A. General concepts about uveitis pathogenesis. // Russian medical journal. - 2003. - N.4. - P. 141.
6. Karpishchenko A.I. Medical laboratory technologies. Saint-Petersburg, «Intermedica», 2002. - 600 p.
7. Lugovskaya S.A., Pochtar M.E., Tupytsin N.N. Immunophenotyping in hemoblastosis diagnostics. M., 2005. - 166 p.
8. Rebrova O.Yu. Statystical analyses of medical data. Use of the Statistica applied programmes. M.: MediaSpera, 2002. - 312 p.
9. Khaidukov S.V., Zurochka A.V., Chereshnev V.A. Cytometric analyses in clinical immunology. Ekaterinburg, 2011 - 221 p.
10. Chan C.C., Mochizuki M., Palestine J. Kinetics of T-lymhpocyte susets in the eyes of Levis rats with experimental autoimmune uveitis. // Cell immunology - 1985. - Vol. 96. - P. 430 - 434.
11. Gaines H, Anddersson L, Biberfeld G. A new method measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry//J. Immun. Methods, 1996, 195: 63-72.
12. Mercer J.C., Ragin M.J., August A., Natural killer T cells: rapid responders controlling immunity and disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005,37: 1337-1343.
13. Stites D.P. Clinical laboratory methods for detection of cellular immunity // Basic and clinical immunology / Ed. Stites D.P., Terr A.I., Parslow TG. - Norwalk, Connecticut: Appleton and Lange, 1994.
