CC BY
33
БИО
/РЕПАРАТЫ
ОЦЕНКА НОВОЙ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ «АМПЛИСЕНС ROTAVIRUS/ NOROVIRUS/ASTROVIRUS-FEP» С ГИБРИДИЗАШЮННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»
1Жираковсная Е. А, Ликунов А. Ю* Воднев С Ач 3Дроздов И. Г„ 2Индикова И. Н„2Горбунов М. А* 'Игнатьев Г. 17iинунова Н. В.
1 — ФГУН ГНЦ ВВ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцове, Новосибирская область;
2 — Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, Москва
В статье приводятся результаты медицинских испытаний чувствительности, специфичности и воспроизводимости новой ПЦР тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-ЯЕР» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке», разработанной в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадора. Результаты испытаний свидетельствуют о высокой чувствительности9 специфичности и воспроизводимости разработанной тест-системы. Ключевые слова: ПЦР-тест~система, эффективность, гибридизационно-флуоресцентная детекция, ОКИ
Острые кишечные инфекции (ОКИ) вирусной этиологии имеют широкое распространение, обуславливая подавляющую часть этиологически нерасшифрованных заболеваний этой группы [1, 2, 15, 17, 21]. По литературным данным значительную долю (до 60%) больных вирусными гастроэнтеритами составляют дети в возрасте до 5 лет [2, 5, 15, 18]. Возбудители ОКИ локализуются, главным образом, в кишечнике [1, 3]. Ведущий путь передачи инфекции — контактно-бытовой, пищевой или водный [1, 12, 19].
Вирусные кишечные инфекции имеют полиморфную клиническую картину, которая не только делает невозможным клиническую дифференцировку между ними, но и не позволяет исключать бактериальную этиологию заболевания [1]. При изучении этиологии и клинических особенностей течения ОКИ у детей в г. Москве, проведенных в 2002-2003 гг., вирусные агенты были выявлены у 1122 и 1848 детей (60,7%) [4]. При этом у значительного числа пациентов с вирусными диареями наблюдалась симптоматика колита (21,5%), в стуле обнаруживались примеси слизи (42-65% от числа обследованных) и даже крови (5-11%) [4]. Подобная симптоматика диареи может привести к необоснованному назначению антибактериальных средств пациентам с вирусными ОКИ.
Особенно велика роль вирусных агентов при развитии вспышек ОКИ. По данным зарубежных авторов, до 90% вспышек ОКИ небактериальной этиологии имеет норовирусную природу [11, 13, 14]. Такие эпидемиологические особенности норовирусной инфекции объясняются низкой инфицирующей дозой возбудителя, вы-
сокой устойчивостью в окружающей среде, в том числе и в хлорированной воде [13]. Также нельзя исключать возможность инфекции смешанной этиологии, вызванной не одним, а сразу несколькими вирусами [4, 15, 16]. Решение диагностических и эпидемиологических аспектов проблемы вирусных кишечных инфекций во многом определяется возможностями используемых методических подходов. Для детекции ротавирусов группы А в России зарегистрирована тест-система «Рота-анализ» производства ЗАО «Био-иммуноген» (Москва). ВОЗ для детекции ротавирусно-го антигена рекомендует тест-систему IDEIA Rotavirus производства DakoCytomation (Великобритания). Существенным недостатком ИФА тест-систем является недостаточная аналитическая чувствительность для работы с обьектами окружающей среды. Для диагностики норо- и астровирусных инфекций наряду с методом ОТ-ПЦР используется ИФА, позволяющий выявлять вирусные антигены в фекалиях [10, 15]. Однако такие ИФА тест-системы производятся только за рубежом, и при их высокой стоимости (до 750 $ за 96 тестов (IDEIA Norovirus, IDEIA Astrovirus) являются коммерчески недоступными на территории РФ. В России отсутствуют зарегистрированные диагностические тест-системы для выявления данных вирусов.
Цель настоящей работы — изучение диагностической эффективности новой ПЦР тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке», разработанной в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадора.
€
Чюнь 2008 г.
Оценка чувствительности Тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» Результаты детекции препаратами сравнения
Таблица 1
№ Количество
Результаты детекции набором «АмплиСенс" Rotavinis/Norovinis/Astrovinis-FEP»
п\п образцов Рота А - ИФА «IDEIA Rotavirus» Норо 2 - ПЦР Астро - ПЦР Рота А Норо 2 Астро
1 21 21 0 0 21 0 0
2 20 0 20 0 0 19 0
3 21 0 0 21 0 1 19
4 7 7 7 0 7 7 0
5 3 0 3 3 0 3 3
6 3 3 3 3 2 3 3
Материалы и методы комплекта реагентов ■ «Рибо-сорб» из образцов была
Материалом исследования служили образцы фекалий детей раннего возраста с диагнозом «острая кишечная инфекция» и без данного диагноза, находившихся на стационарном лечении в инфекционном и соматическом отделениях МУЗ «Детская городская клиническая больница № 3» г. Новосибирска. Диагноз ОКИ ставился на основании клинической картины и данных лабораторных исследований. Образцы фекалий собирали в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры в объеме 2-3 мл при поступлении пациентов в отделение стационара и хранили при -70 °С. Все собранные образцы были тестированы на наличие ро-тавирусов группы А, норовирусов 2-го генотипа, астро-вирусов, а также на наличие Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp. и энтеропатогенных Escherichia coli.
Для детекции ротавирусов использовали ИФА тест-систему для выявления антигена ротавирусов группы А IDEIA Rotavirus. Кроме того, положительные образцы были генотипированы методом ОТ-ПЦР с набором генотип-специфических праймеров [7-9]. Выявление в образцах норо- и астровирусов проводили методом ОТ-ПЦР с набором диагностических праймеров [4].
Присутствие в образцах Salmonella spp. или Shigella spp. и энтеропатогенных Escherichia coli определяли стандартным посевом на дизентерийную группу и саль-монеллез с использованием сред Плоскирева, Левина, висмут-сульфит агара и Эндо-агара (МУ №04-23/3 от 17.12.84).
Испытуемый набор реагентов «АмплиСенс® Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» состоял из трех комплектов реагентов:
• «Рибо-сорб» вариант 50 — для выделения РНК из клинического материала;
• «Реверта-L» вариант 50 — для проведения реакции обратной транскрипции;
• «АмплиСенс» вариант FEP — для ПЦР-амплифика-ции и дифференциации кДНК ротавирусов группы А (Rotavirus А), норовирусов 2-го генотипа (Norovirus 2 генотип) и астровирусов (Astrovirus) с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке». Исследование образцов с помощью тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» проводилось в соответствии с инструкциями по применению в период срока годности. С помощью
выделена РНК. С помощью комплекта реагентов «РЕВЕРТА-1_» с использованием РНК в качестве матрицы, были получены образцы кДНК. Далее с помощью соответствующих комплектов реагентов «АмплиСенс-вариант РЕР» проводили ПЦР-ампли-фикацию. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин» (ДНК-Технология, Россия).
При проведении испытаний набора реагентов «АмплиСенс® Ро1ау1ги5/Мо^ги8/А81гоу1ги8-РЕР>> все исследуемые образцы были зашифрованы. После завершения испытаний образцы были дешифрованы и проанализированы.
Результаты и обсуждение_
Перед началом испытаний были сформированы две группы образцов фекалий. Основная группа состояла из 90 образцов, полученных от больных с диагнозом ОКИ. Из них:
• 21 образец, в которых были выявлены ИФА тест-системой IDEIA Rotavirus только ротавирусы группы А. Генотипирование методом ОТ-ПЦР показало, что было 10 образцов с ротавирусами генотипа G1P [8], 4 образца с генотипом G3P [8], 3 образца — G2P [4], 2 образца — G9P [8] и по одному образцу с генотипами G3P [9] и G4P [8];
• 20 образцов, в которых были выявлены только норо-вирусы 2-го генотипа с помощью метода ОТ-ПЦР;
• 21 образец, в которых были выявлены только астро-вирусы методом ОТ-ПЦР;
• 7 образцов содержали одновременно ротавирусы и норовирусы 2-го генотипа;
• 3 образца, в которых были выявлены одновременно норовирусы 2-го генотипа и астровирусы;
• 3 образца, в которых были выявлены одновременно ротавирусы, норовирусы 2-го генотипа и астровирусы.
В 15 образцах указанные выше вирусы выявлены не были, однако они содержали Campylobacter spp., Salmonella spp. или Shigella spp. и энтеропатогенные Escherichia coli.; 5 образцов с Campylobacter spp.; 5 образцов, в которых были выявлены только Salmonella
Э
.ПРЕПАРАТЫ
spp; 5 образцов, в которых были выявлены только Shigella spp. и энтеропатогенные Escherichia coli.
Контрольную группу составили 30 образцов фекалий, полученных от детей раннего возраста, госпитализированных в соматическое отделение МУЗ ДГКБ № 3 и не имевших клинических симптомов ОКИ. Предварительный анализ не выявил в этих образцах вышеперечисленных вирусных и/или бактериальных патогенов.
Чувствительность тест-системы оценивалась по числу совпадений положительных результатов (в %) при тестировании образцов опытной группы с помощью испытуемой тест-системы и препаратов сравнения. Из результатов, представленных в табл. 1, видно, что чувствительность испытуемой тест-системы составила 100%, 95% и 90,5% при детекции ротавирусов, норови-русов 2-го генотипа и астровирусов, соответственно, в образцах содержащих один патоген. Следует отметить, что в исследуемую группу вошли образцы с шестью различными генотипами ротавируса группы А, и все они были успешно выявлены тест-системой «Ампли-Сенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP».
Показательно, что тест-система «АмплиСенс Яо1а^ги8/Могоу1ги8/А81гсмги8-РЕР» продемонстрировала высокую чувствительность (96,6%) при детекции ротавирусов группы А, норовирусов 2-го генотипа и астровирусов в образцах, в которых препаратами сравнения было выявлено несколько вирусов (табл. 1). В 28 случаях из 29 все патогены были успешно определены.
Специфичность тест-системы оценивали по числу совпадений отрицательных результатов (в %) при тестировании образцов контрольной группы с помощью испытуемой тест-системы и препаратов сравнения (табл. 2).
Оценка специфичности испытуемой тест-системы показала, что в большинстве случаев почти все результаты, которые были отрицательными при использовании препаратов сравнения, были отрицательными и при использовании испытуемой тест-системы. Исключение составили 2 образца, в которых тест-система «АмплиСенс Ро1а71ги8/Мого^ги8/А51гсмги8-РЕР» выявила норовирусы 2-го генотипа, которые не были обнаружены с помощью препарата сравнения.
Оценка специфичности тест-системы «АмплиСенс Яо1а^1ги8/Ыого^1ги8/Аз1го^1ги8-РЕР» Результаты детекции препаратами сравнения и бактериальными методами
Таблица 2
№ п/п
Результаты детекции набором «АмплиСенс Rotavirus/Norovinis/ Astrovirus-FEP»
Рота А Норо 2 Астро Shigella spp. Sa,™°pnel,a CamPy'°pbacter Рота А Норо 2 Астро
1 «—» «—» «—» «—» «—» «—»
2 «—» «—» «—» «—»
3 «—» «—» «—» «—»
4 «—» «—» «—»
5 «—» «—» «—»
6 «—» «—» «—» «—»
7 «—» «—» «—» «—»
8 «—» «—» «—»
9 «—» «—» «—» «—»
10 «—» «—» «—» «—»
11 «—» «—» «—»
12 «—» «—» «+» «—»
13 «—» «—» «—» «—»
14 «—» «—» «—» «—»
15 «—» «—» «—» «—»
16 «—» «—» «+» «—» «—»
17 «—» «—» «+» «—» «—»
18 «—» «—» «+» «—» «—»
19 «—» «—» «—» «—»
20 «—» «—» «—» «—»
21 «—» «—» «—» «+» «—» «—»
22 «—» «—» «—» «—»
23 «—» «—» «—» «—»
24 «—» «+» «—» «—»
25 «—» «—» «+» «—» «—»
26 «—» «—» «—»> «—» «—»
27 «—» «—» «—» «—»
28 «—» «—» «—» «—» «—»
29 «—» «—» «—» «—»
30 «—» «—» «—» «—»
Специфичность, %
100
93,3
100
€
£ Июнь 2008 г.
Кроме того, при исследовании специфичности к образцам контрольной группы были присоединены образцы из основной группы, в которых предварительные исследования не выявили присутствие ротавирусов группы А, норовирусов 2-го генотипа и астровирусов, но были выявлены Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp. и энтеропатогенные Escherichia coli (табл. 2). Результаты показали, что специфичность тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» при исследовании этих образцов составила 100%.
В ходе проведения испытаний оценивали воспроизводимость испытуемого комплекта реагентов «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» на клиническом материале — 5 образцов, давших положительный результат на ротавирусы группы А, 5 образцов, давших положительный результат на норовирусы 2-го генотипа, 5 образцов, давших положительный результат на астро-вирусы и 10 образцов, давших отрицательный результат, были исследованы 3-кратно в различных опытах для определения варьирования результатов. Во всех случаях были получены идентичные результаты: исследуемая тест-система выявила все отрицательные и положительные пробы. Воспроизводимость составила 100%.
Таким образом, результаты изучения новой ПЦР тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» свидетельствуют о ее высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости. Данные, полученные с помощью этой тест-системы при детекции ротавирусов группы А, полностью совпали с показателями коммерческой тест-системы IDEIA Rotavirus, рекомендованной к применению ВОЗ. Это позволяет прогнозировать диагностическую достоверность результатов при использовании исследуемой тест-системы для выявления и дифференциации РНК ротавирусов группы А, норовирусов 2-го генотипа и астровирусов.
Литература
1. Богомолов Б. П. Инфекционные болезни: неотложная диагностика, лечение, профилактика.//М: Нью-диамед. — 2007. — 653 с.
2. КаджаеваЭ. П., Горелов А.В., Усенко Д. В. и др.// Инфекционные болезни. — 2006. — № 2. — С. 34-36
3. Львов Д. К.//Вопросы вирусологии. — 1997. — № 6. — С. 244-248.
4. Подколзин А. Т, Мухина А. А, Шипулин Г. А и др.// Инфекционные болезни. — 2004. — № 4. — С. 85-91.
5. Учайкин В. Ф., Новокшонов А. А., Мазанкова Л. Н., Соколова Н. В. Острые кишечные инфекции у детей. Пособие для врачей.//М., 2003. — 34 с.
6. Colomba С., Saporito L., Giammanco G. М. et al.// Emerg. Infect. Dis. — 2007. — V. 13. — № 9. — P. 1389-1391.
7. DasB. K., Gentsch J. R., Cicirello H. G. etal.//J. Clin. Microbiol. — 1994. - V. 32. — № 7. — P. 1820-1822.
8. Gentsch J. R., Glass R. I., Woods P. et al.//J. Clin. Microbiol. — 1992. —V. 30. — № 6. — P. 1365-1373.
9. Gouvea V., Glass R. I., Woods P. et al.//J. Clin. Microbiol. — 1990. — V. 28. — № 2. - P. 276-282.
10. Gray J. J., Kohli E., Ruggeri F. M. etal.//Clin. Vaccine Immunol. — 2007. —V. 14. — № 10. — P. 1349-1355.
11. Fankhauser R. L., Monroe S. S., Noel J.S. et al.// J. Infect. Dis. — 2002. — V. 186. — P. 1 -7.
12. deWitM. A., KoopmansM. P., van Duynhoven Y. T.// Emerg. Infect. Dis. — 2003. — V. 9. — № 12. — P. 1563-1570.
13. Kapikian A. Z., M. K. Estes, R. M. Chanock. Norwalk group of viruses. In B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley (ed.). Fields virology, 3rd ed. Raven Press, New York, N.Y. 1996: 783-810.
14. Lopman B. A., Reacher M. H., Van Duijnhoven Y. et al.// Emerg. Infect. Dis. — 2003. — V. 9. — № 1. — P. 90-96.
15. Nguyen T. A., Yagyu F., Okame M. et al.//J. Med. Virol. — 2007. — V. 79. — № 5. — P. 582-590.
16. Oh D. Y., Gaedicke G., Schreier E.//J. Med. Virol. —
2003. — V. 71. — № 1. — P. 82-93.
17. Okitsu-Negishi S., Nguyen T. A., Phan T. G. et al.// Pediatr. Int. — 2004. — V. 46. — № 2. — P. 245-252.
18. Olesen В., Neimann J., Bottiger B. et al.//J. Clin. Microbiol. — 2005. — V. 43. — № 8. — P. 36-41.
19. Rzezutka A., Cook N.//FEMS Microbiol. Rev. —
2004. —V. 28. - № 4. - P. 441-453.
20. Sumi A., Kobayashi N., Ohtomo N.//Microbiol. Immunol. — 2005. — V. 49. — № 8. — P. 745-756.
21. Wilhelmi I., Roman E., Sanchez-Fauquier A.//Clin Microbiol Infect. — 2003. — V. 9. — № 4. — p. 247-262.
Э
