CC BY
27
Д. В. ПАШКОВ2, М. В. ПОКРОВСКИЙ12, И. М. КОЛЕСНИК1, Е. Б. АРТЮШКОВА2, З. И. ЦОКОЛАЕВА3, А. Ю. ОРЛОВА2
ОЦЕНКА НЕОАНГИОГЕННОГО ЭФФЕКТА L-АРГИНИНА
И ЕГО СОЧЕТАНИЯ С ПЛАЗМИДАМИ ГЕНА VEGF ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ
1Кафедра фармакологии Курского государственного медицинского университета, Россия, 305041, г. Курск, ул. К Маркса, 3;
2Научно-исследователъский институт экологической медицины Курского государственного медицинского университета, Россия, 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3;
3Российский кардиологический научно-производственный комплекс им. А. Л. Мясникова, Россия, 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а
Экспериментальная работа проведена на 24 крысах-самцах линии Wistar. Кровообращение в конечностях оценивалось методами лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и иммуногистохимической визуализации сосудов в срезах мышц голени. Моделирование ишемии задней конечности осуществляли путем иссечения бедренной артерии. Лечение проводили при помощи внутримышечных инъекций раствора плазмиды с геном VEGF и внутрибрюшинного введения L-аргинина в дозе 200 мг/кг. В контрольной группе вводили 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Результаты оценивали на 14-е сутки. В группах, получавших L-аргинин и VEGF, отмечено увеличение числа сосудов по сравнению с группой плацебо, а уровень перфузии был достоверно выше только у животных, получавших L-аргинин.
Ключевые слова: хроническая ишемия, неоангиогенез, L-аргинин, VEGF.
D. V. PASHKOV2, M. V. POKROVSKIY12, I. M. KOLESNIK1, E. B. ARTYUSHKOVA2, Z. I. TSOKOLAEVA 13, A. U. ORLOVA2
THE VALUATION OF ANGIOGENIC EFFICACY OF THE L-ARGININE AND IT'S COMBINATION WITH VEGF FOR TENTATIVE LIMB ISCHEMIA
1The pharmacological department of the Kursk state medical university, Russia, 305041, Kursk, K. Marx street, 31; 2Scientific research institute of ecological medicine, Russia, 305041, Kursk, K. Marx street, 32;
3Russian cardiologic scientifically-production complex after A. L. Myasnikov, Russia, 121552, Moscow, 3-rd Cherepkovskaya street, 15a
The tentative research was made in 24 rats, Wistar line. The microcirculation level was evaluated in Laser-Doppler flowmetry method and by immunohystochemical visualization of the vessels in the muscles. The chronic ischemia was modeling by cutting out of the femoral artery. The intramuscular introduction of VEGF and intraperitoneal introduction of L-arginine 200 mg/kg were used for treatment. The isotonic solution of NaCl was used in control group. The results were valued in 14-th day. The vessels number increased in groups treated by VEGF and L-arginine. It was statistical difference in microcirculation level between control group and group that was treated by L-arginine.
Key words: chronic ischemia, neoangiogenesis, L-arginine, VEGF.
Введение сосудов в ишемизированных тканях [9]. Основным фак-
Распространенность хронических облитерирующих тором, использующимся сегодня, остается VEGF [10,
заболеваний артерий нижних конечностей составляет 11]. Механизм ангиогенного эффекта VEGF (vascular
более 20% от всех видов сердечно-сосудистой патоло- endothelial grow factor) обусловлен его способностью
гии, что соответствует 2-3% от всей численности на- селективно стимулировать миграцию и пролиферацию
селения и 35-50% от численности лиц старше 60 лет. эндотелиальных клеток, экспрессию в них активато-
По данным Г. Р. Галстян (2006), распространенность ров плазминогена, увеличивать сосудистую проница-
данной патологии составляет 9-10% среди лиц старше емость, вызывать вазодилатацию, привлекать моно-
50 лет [2]. Особенностью этих заболеваний является циты и стимулировать мобилизацию прогениторных
тенденция к неуклонному прогрессированию процесса, клеток из костного мозга [11]. Основным регулятором
высокой степени инвалидизации, ампутациям и ле- экспрессии VEGF является гипоксия [7]. Увеличение
тальности. Частота развития тяжелой ишемии, по дан- образования оксида азота в ишемизированных тканях
ным различных авторов, составляет от 20% до 70%. также приводит к стимуляции ангиогенеза [1]. В наших
Одним из новых методов лечения ишемических последних работах описана возможность коррекции
состояний является терапевтический ангиогенез, кото- хронической ишемии конечности у крыс при помощи
рый основан на применении различных факторов роста донатора NO - L-аргинина [1].
Характеристика групп животных
Группы n Характеристика Методы исследования
Интактная 6 Здоровые животные Флоуметрический Морфологический
Плацебо 6 Моделирование ишемии + 0,9%-ный раствор ЫаС! в/м на 5-е сут. Флоуметрический Морфологический
VEGF 6 Моделирование ишемии + VЕGF на 5-е сут. в/м Флоуметрический Морфологический
L-аргинин 6 Моделирование ишемии + 1_-аргинин 200 мг/кг на 2-е сут. Флоуметрический Морфологический
Целью настоящего исследования явились оценка неоангиогенного эффекта L-аргинина и сравнение его с эффектом VEGF при экспериментальной ишемии конечности у крыс.
Материалы и методы
Экспериментальная работа выполнена на 24 крысах-самцах линии Wistar средней массой тела 230-250 г. Животные были разделены на 4 группы по 6 крыс в каждой. Характеристика групп представлена в таблице.
Моделирование ишемии задней конечности крыс проводили в асептических условиях под наркозом (эта-минал натрия 35 мг/кг внутрибрюшинно), путем удаления бедренной артерии на всем ее протяжении от паховой связи до бифуркации на a. poplitea и a. saphenus.
Оценку кровообращения в конечности осуществляли методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) на 14-е сутки после операции моделирования ишемии. ЛДФ проводили при помощи аппарата Biopac System (USA) и датчика (точечного) TSD-144. Под наркозом на латеральной поверхности голени иссекали участок кожи, обнажали наружную группу мышц. Запись уровня микроциркуляции осуществляли в пяти точках, соответствующих середине длине m. tibialis anterior, точках, отстоящих от первой на 3-5 мм выше, ниже, латеральнее и медиальнее. Обработка данных осуществлялась программой Acq 38. Величины уровня микроциркуляции в различных группах оценивали в качестве абсолютных показателей, а также рассчитывали относительную величину уровня микроциркуляции в оперированной конечности путем соотнесения с результатами ЛДФ на противоположной стороне.
Плазмиды гена VEGF, любезно предоставленные сотрудником РКНПК им. А. Л. Мясникова к. б. н. З. И. Цоколаевой, вводили на 5-е сутки после операции. Процедуру осуществляли под наркозом. Инъекцию раствора плазмиды в стерильном фосфатно-солевом буфере вводили путем транскутанной внутримышечной инъекции в m. tibialis anterior. Раствор объемом 250 мкл с содержанием плазмидной ДНК 250 мкг вводили в пять точек (по 50 мкл в каждую точку). Точками для введения служили середина длины мышцы, точки, отстоящие от первой на 3-5 мм (в зависимости от величины животного) выше, ниже, латеральнее и медиальнее от первой. Введение физиологического раствора в группе плацебо-контроля осуществляли аналогично (пять инъекций по 50 мкл под наркозом) на 5-е сутки после операции моделирования ишемии конечности.
L-аргинин («Ajinomoto Со. INC.», Japan) вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора в дозе 200 мг/кг на 2-е сутки после операции моделирования ишемии конечности.
Иммуногистохимическая визуализация сосудов осуществлялась на срезах мышц голени крысы монокло-нальными антителами к CD 31 (BD). Подсчет сосудов на окрашенных гистологических срезах мышц крысы осуществляли на микроскопе Zeiss Axiovert 200M при увеличении х20. На 5 срезах, сделанных на разных уровнях мышцы, обсчитывали по 5 полей зрения. Данные для каждого животного усредняли.
Результаты флоуметрического и иммуногистохими-ческого исследований статистически обработаны при помощи программного пакета Microsoft Office XP.
Результаты исследования
Кровоток в мышцах голени здоровых крыс составлял 373,12+11,46 п. е., а среднее количество сосудов в мышцах - 862,17+67,93 в поле зрения (п/з). В группе с моделированием ишемии конечностей, получавшей 0,9%-ный раствор хлорида натрия (плацебо-контроль), перфузия мышц кровью достоверно снижалась в среднем до 242,42+10,51 п. е. (р<0,001) по сравнению с ее уровнем в конечностях у интактных животных (рис. 1), а число сосудов уменьшалось почти вдвое, составляя 493,50+49,7 в п/з (p<0,01) (рис. 2).
В группе, получавшей инъекции плазмиды с геном VEGF, уровень перфузии составил 237,69+7,77 п. е., что не отличается от значений в контрольной группе (рис. 1). Относительные величины уровня перфузии (процент от уровня в интактной контралатеральной конечности) в этих группах также не различались (63,24% и 62,55% соответственно, p>0,5). Иная картина наблюдалась при анализе плотности сосудов. В группе, получавшей генную терапию VEGF, среднее количество сосудов в поле зрения было увеличено более чем в два раза по сравнению с контролем и составило 1203,67+193,28 сосудов в п/з (p<0,01) (рис. 2).
В группе, получавшей L-аргинин, уровень микроциркуляции на 14-е сутки составил 271,84,13+10,94 п. е., или 69,76% по отношению к здоровой конечности (рис. 1), а плотность сосудов - 830,14+110,99 в п/з (рис. 2), что достоверно превышало эти показатели в группе плацебо (p<0,05).
Морфологическая картина в мышцах животных опытных и контрольных групп после иммуногистохими-ческого окрашивания представлена на рисунке 3.
400
350
е.
п. 300
в
и
и ц 2.50
я
ул к 200
р
и
ц 150
о
кр
ик 100
м
ь
н 50
е
в
о р 0
>
СП
о о см
271,84'#
242,42*
237,69*
Интактные Плацебо Ь-аргинин Группы животных
УБОР
I I-
о си
в и
^ о
н
и
^
и
ч
си г
>5
ы н
т
у
го
н и
^ о
н
го ю
у
Рис. 1. Результаты флоуметрии на 14-е сутки
Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой интактных животных; # - статистически значимые различия по сравнению с группой плацебо.
я и н
е р
3 е л о п в в о
ч у
с о с о л с и
4
е е н
ч
е р
о
1400
1200
1000
800
600
400
200
1203,67*#
862,17 781,38*#
4ЫЗ,йи'
Интактные Плацебо Ь-аргинин Группы животных
УБОР
Рис. 2. Результаты подсчета количества сосудов в поле зрения на 14-е сутки
Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой интактных животных; # - статистически значимые различия по сравнению с группой плацебо.
Обсуждение
Стимуляция коллатерального кровообращения у больных с отсутствием воспринимающего сосудистого русла и тяжелыми сопутствующими заболеваниями является основным и единственно возможным методом лечения хронической ишемии конечностей.
В механизме ангиогенеза ключевая роль принадлежит пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка N0 с помощью эндотелиальной N0-синтетазы (eN0S) из 1_-аргинина. В данной работе описаны возможности улучшения кровоснабжения ишемизированных участков конечностей при помощи активаторов неоангиогенеза - УБвР и
Ь-аргинина, а также проведен сравнительный анализ эффективности указанных веществ.
Результаты флоуметрического и иммуногистохими-ческого исследований однозначно свидетельствуют о том, что выбранная модель экспериментальной ишемии позволяет адекватно воспроизвести экспериментальную ишемию у крыс. Отмечается достоверное снижение перфузии и плотности сосудов в ишемизированных мышцах голени крысы. После операции моделирования ишемии конечности у животных наблюдались акральные некрозы, артериальные трофические язвы, гангрена, ишеми-ческий отек конечности и болевой синдром.
Достоверные различия по уровню перфузии между группой плацебо и группой, получавшей Ь-аргинин,
0
Рис. 3. Срезы мышц с позитивным окрашиванием к CD31 на 14-е сутки эксперимента
Примечание: А - группа интактных животных; В - группа плацебо;
С - группа животных, получавших УБОБ;
D - группа животных, получавших 1_-аргинин (х20; окраска диаминобензидином).
совпадают с литературными данными о стимулирующем влиянии L-аргинина на активность кровообращения в микроциркуляторном русле [6]. При проведении ЛДФ в группе, получавшей L-аргинин, на 30-е сутки величина уровня микроциркуляции составляет 394,00+24,22 п. е., или 91,67% по отношению к кон-тралатеральной конечности. То есть можно говорить о почти полном восстановлении микроциркуляции под влиянием лечения, в то время как в контрольной группе данный показатель составляет 62,5%. Эти результаты совпадают с теми, которые мы наблюдали в предыдущих опытах, когда L-аргинин способствовал восстановлению кровообращения в конечности [1]. Подобный фармакологический эффект L-арги-нина объясняется наличием у него свойств донора оксида азота: под влиянием эндотелиальной NO-син-тазы из него образуется монооксид азота, который оказывает вазодилатирующее и эндотелиопротек-
тивное действие, что создает оптимальные условия для неоангиогенеза [8]. Стимуляция неоангиогенеза наблюдалась как при введении плазмиды с УБОБ, так и при введении L-аргинина. Однако увеличение перфузии конечности было незначительным в группе с введением L-аргинина и вообще отсутствовало на 14-е сутки в группе с введением УБвБ. Возможно, эти противоречия могут быть обусловлены тем, что большинство новообразованных сосудов временно не являются функционирующими. Ранее мы наблюдали значимый эффект L-аргинина, который регистрируется лишь к 28-м суткам наблюдения [3]. Также отмечен значимый неоангиогенный эффект УБОБ, который выражается в увеличении числа сосудов в поле зрения по сравнению с контрольной группой и группой плацебо.
Полученные данные позволяют объективно говорить о том, что L-аргинин при системном введении
способен активировать неоангиогенез и улучшать 4. Brevetti L. S. et al. Overexpression of endothelial nitric oxide
перфузию ишемизированных мышц. Отсутствие у synthase increases skeletal muscle blood flow and oxygenation in
L-аргинина побочных эффектов и значимое антиише- severe rat hind limb ischemia / L. S. Brevetti, D. S. Chang, G. L. Tang
мическое действие делают целесообразным приме- et al. // J Vasc. Surg. - 2003. - Vol. 38. - P. 820-826. нение препарата у пациентов с хронической ишемией 5. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and
конечностей и диктуют необходимость дальнейших clinical progress // Endocr. Rev. - 2004. - Vol. 25 (4). - P. 581-611. экспериментальных и клинических испытаний. Дейс- 6. Huk I. et al. L-Arginine Treatment Alters the Kinetics of Nitric
твующим началом при введении L-аргинина, очевидно, Oxide and Superoxide Release and Reduces Ischemia/Reperfusion Injury
является его метаболит - монооксид азота. in Skeletal Muscle // Circulation. - 1997. - Vol. 96. - P. 667-675.
7. Liu L., Simon M. C. Regulation of transcription and translation
ЛИТЕРАТУРА by hypoxia // Cancer Biol. Ther. - 2004. - Vol. 3 (6). - P. 492-497.
1. Артюшкова Е. Б., Пашков Д. В., Суковатых Б. С. и др. Воз- 8. Mendoza M. G. et al. Nitric oxide-dependent neovascularization можности фармакологической коррекции хронической ишемии role in the lower extremity disease / M. G. Mendoza, H. V. Robles, конечности в эксперименте // Кубанский научный медицинский E. Romo et al. // Curr Pharm Des. - 2007. - Vol. 13 (35). - P. 3591-3596. вестник. - 2007. - № 1-2. - С. 19-22. 9. Rissanen T. T. Current status of cardiovascular gene therapy /
2. Галстян Г. Е. Алгоритм диагностики и лечения заболева- T. T. Rissanen, S. Yla-Herttuala // Mol. Ther. - 2007. - Vol. 15. - P. 1233-1247. ний артерий нижних конечностей // Consilium-Medicum. - 2006. - 10. Tirziu D. Angiogenesis in the human heart: Gene and cell therapy / Т. 8. № 12. - С. 34-38. D. Tirziu, M. Simons // Angiogenesis. - 2005. - Vol. 8. - P. 241-251.
3. Суковатых Б. С. Экспериментальное и клиническое 11. Yla-Herttuala S. Vascular endothelial growth factors: biology
обоснование применения реваскуляризирующей остеомиоплас- and current status of clinical application in cardiovascular medicine /
тики для лечения критической ишемии нижних конечностей / S. Yla-Herttuala, T. T. Rissanen, I. Vajanto // JMCC. - 2007. -
Б. С. Суковатых, Л. Н. Беликов, А. Н. Щербаков, К. С. Магомедали- Vol. 49. - P. 1015-1026. ева, Д. В. Пашков, В. В. Князев // Вестн. хир. им. Грекова. - 2006. -
№ 4. - С. 24-26. Поступила 08.05.2009
Т. О. СЕРКИНА1, Г. А. ПЕНЖОЯН1, Ю. М. ПЕРОВ2
ОЦЕНКА РЕГУЛЯТОРНО-АДАПТИВНОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЖЕНЩИНЫ В НОРМАЛЬНЫЙ ПОСЛЕРОДОВОЙ ПЕРИОД ПО ПАРАМЕТРАМ СЕРДЕЧНО-ДЫХАТЕЛЬНОГО СИНХРОНИЗМА
1Кафедра акушерства и гинекологии Кубанского медицинского института, городская больница № 2, Россия, 350012, г. Краснодар, ул. Красных партизан, 6/2;
2кафедра нормальной физиологии Кубанского государственного медицинского университета, Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. Тел. 8-918-464-73-49
Во время послеродового периода по сравнению с предродовым периодом регуляторно-адаптивный статус, определяемый по параметрам сердечно-дыхательного синхронизма, был снижен. На это указывали уменьшение в послеродовом периоде ширины диапазона синхронизации на 27,9% по отношению к таковой при беременности перед родами и увеличение длительности развития сердечно-дыхательного синхронизма на минимальной границе диапазона синхронизации на 11,1% по отношению к таковой у беременных перед родами.
Ключевые слова: регуляторно-адаптивный статус, сердечно-дыхательный синхронизм, послеродовой период.
T. O. SERKINA1, G. A. PENZHOJAN1, Yu. M. PEROV2
EVALUATION OF THE REGULATORY AND ADAPTIVE STATE OF WOMAN'S ORGANISM IN NORMAL POSTNATAL PERIOD ACCORDING TO THE CARDIORESPIRATORY SYNCHRONSM PARAMETERS
Obstetrics and Gynecology Department of Kuban State Medical University, Municipal Hospital № 2, Russia, 350012, Krasnodar, Krasnykh partisan St., 6/2; 2Normal Physiology Department of Kuban State Medical University, Russia, 350063, Krasnodar, Sedin, 4
During postnatal period in comparison with the prenatal period the regulatory and adaptive state, determined by cardiorespiratory synchronism parameters was decreased. It was indicated by decrease in the postnatal period the synchronization range width by 27,9% in comparison with the same in pregnancy before delivery, and increase of duration of the cardiorespiratory synchronism development at minimum limit of synchronization range by 11,1% in comparison with the same in pregnant women before delivery.
Key words: regulatory and adaptive state, cardiorespiratory synchronism, postnatal period.
