CC BY
85ЭФФЕКТИВНОЕ №2 март
животноводство 2018
УДК 636.082:591.463.1
М.А. Клещев, младший научный сотрудник,
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск; В.Л. Петухов, д.б.н., профессор,
Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск; Л. В. Осадчук, д.б.н., профессор,
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск.
оценка морфологических аномалий сперматозоидов у быков производителей
В практике животноводства при оценке качества спермы быков производителей, как правило используются объем эякулята, концентрация сперматозоидов и их подвижность. Однако важную роль в прогнозе фертильности играют морфологические характеристики сперматозоидов, в частности, доля половых клеток с аномальным строением и встречаемость различных типов морфологических аномалий сперматозоидов. В настоящей работе у быков черно-пестрой, симментальской, англер-ской и красной датской пород, содержащихся на племпредприятии ОАО «Барнаульское» (Алтайский край) оценивали спермопродукцию и подвижность сперматозоидов и встречаемость различных морфологических аномалий сперматозоидов. Установлено, что быки разных пород не различались по спермопродукции и подвижности сперматозоидов, импортные быки красной датской, англерской и симментальской пород отличались от быков отечественной черно-пестрой породы повышенной долей аморфных и грушевидных головок сперматозоидов. Повышенная доля этих типов аномалий у быков зарубежной селекции указывает на возможные риски снижения фертильности, поскольку данные морфологические нарушения часто сопровождаются повреждениями ДНК сперматозоидов.
Ведение. В практике современного российского животноводства при оценке пригодности спермы быков к замораживанию определяется только концентрация сперматозоидов в эякуляте, производится балльная оценка подвижности половых клеток и иногда - общий процент морфологически аномальных сперматозоидов [1]. Эти показатели являются важными для прогноза оплодотворяющей способности спермы. Однако исследования на различных видах животных, включая домашних быков, показали необходимость детального изучения морфологического строения сперматозоидов. Морфологически нормальный, функционально компетентный сперматозоид формируется в процессе спермиоге-неза. Спермиогенез представляет собой серию морфологических превращений гаплоидной спер-матиды, в результате чего формируется сперматозоид, состоящий из уплощенной и удлиненной головки, а также средней части и хвоста. В процессе спермиоге-неза происходят изменения на молекулярном уровне, главным из которых является замещение гистонов на протамины и плотная
упаковка ДНК сперматозоидов, что защищает ее от повреждения [2]. В результате нарушения процессов спермиогенеза формируются разнообразные аномалии строения сперматозоидов - аморфная, круглая, грушевидная головка, нарушения строения акросомы, вакуолизированная головка, короткий, изогнутый хвост и многие другие. Разнообразие морфологических аномалий половых клеток можно разделить на типы, в соответствии с различными классификационными системами. При изучении крупного рогатого скота наиболее часто используется классификация Блома [3]. Исследуя под микроскопом (при увеличении х1о0о) мазки эякулята, окрашенные гистологическими красителями (Романовского-Гимзе, наборы красителей □¡А'-Ошск и др.) можно определить встречаемость различных типов аномалий, которая может существенно различаться у разных животных. Считается что повышенное концентрация сперматозоидов в эякуляте с так называемыми мажорными аномалиями (аморфная, грушевидная головка, нарушения строения акросомы, вакуолизированная головка) является маркером субфертильности
животных [4]. Это обусловлено тем, что такие сперматозоиды не способны преодолеть женский репродуктивный тракт из-за нарушенной геометрии головки и сниженной подвижности.
Часто сперма с повышенным количеством сперматозоидов, несущих мажорные морфологические аномалии, обладает сниженной оплодотворяющей способностью [5, 6]. Некоторые исследователи предполагают, что избыточное количество морфологически аномальных форм сперматозоидов является индикатором нарушений упаковки хроматина и целостности ДНК, что при оплодотворении яйцеклетки может приводить к нарушению развития эмбриона. Таким образом, анализ встречаемости различных морфологических аномалий сперматозоидов у быков производителей представляет значительный интерес как в скрининговых исследованиях репродуктивного здоровья, так и при рутинной оценке пригодности спермы к искусственному оплодотворению. Однако в настоящее время этому аспекту качества спермы уделяется относительно мало внимания.
т
Ш
Воспроизводство стада
www.agroyug.ru
Цель исследования - изучить разнообразие морфологических аномалий сперматозоидов у быков производителей пород зарубежной и отечественной селекции в эколого-климатических условиях юга Западной Сибири. Для этого было проведено сравнительное исследование общепринятых показателей качества эякулята (концентрации и доли подвижных сперматозоидов), а также встречаемости морфологически аномальных сперматозоидов и основных типов аномалий строения половых клеток у быков пород зарубежной селекции и отечественной черно-пестрой породы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Было изучено 44 быка производителя в возрасте от 2 до 10 лет, содержащихся в ОАО «Барнаульское» (Алтайский край, г. Барнаул). Животные принадлежали к англерской (п=6), красной датской (п=5), симментальской (п=10) и черно-пестрой (п=23) породам. Быки черно-пестрой породы относились к приобскому (п=20) и ленинградскому (п=3) типам этой породы. При анализе данных ан-глерская и красная датская породы были объединены в группу красных пород (п=11). Животные были закуплены в Германии (ан-глерская порода), Дании (красная датская порода), Австрии (симментальская) и на племенных хозяйствах Алтайского края и Ленинградской области (черно пестрая порода). Отбор проб эякулята производили в соответствии с ГОСТ 20909.1-75. При первичной оценке качества спермы определяли концентрацию сперматозоидов (с использованием камеры Горяева) и их подвижность, используя анализатор фертильности спермы АФС 500-2 (НПФ «Биола», г. Москва). Для исследования морфологии сперматозоидов аликвоту нативного эякулята разводили фосфатным буфером в 10 раз и делали мазок на предметном стекле. Мазки высушивали на воздухе, после чего фиксировали метанолом в течение 2 минут. Фиксированные и высушенные на воздухе мазки окрашивали красителем Гимзы («Биовитрум», Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией производителя. После окраски препарат заключали в канадский
бальзам. Исследовали первые 200 сперматозоидов под световым микроскопом при увеличении х1000 с масляной иммерсией. Морфологически нормальным считался сперматозоид, у которого головка, средняя часть и хвост соответствовали определенным критериям [7]. Остальные сперматозоиды относили к аномальным.
По месту расположения аномалии сперматозоид относили к одной из следующих групп - аномалии головки, средней части, хвоста, сочетанные аномалии головки и хвоста, головки и средней части, средней части и хвоста, а также сочетанные аномалии головки, средней части и хвоста (тройные). На основании этих данных рассчитывали индекс тератоспермии (Т71), который представляет собой отношение числа выявленных аномалий к числу дефектных сперматозоидов.
По форме и размеру головки, средней части и хвоста сперматозоид относили к одной из 21 групп в соответствии с классификацией Блома [3]. Рассчитывали долю каждого дефекта от общего числа просчитанных сперматозоидов (частота встречаемости). Аномалии, частота встречаемости которых составляла менее 1 %, считались минорными и данные по ним не представлены. Для всех исследуемых параметров высчитывали среднюю арифметическую и ее ошибку. Данные обрабатывались статистическими методами.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные параметров эякулята у быков производителей представлены в таблице 1. Не установлено межпородных различий по общему объему эякулята, общему количеству сперматозоидов, концентрации сперматозоидов, доле подвижных и доле морфологически аномальных половых клеток. Однако доля аномальных сперматозоидов у быков симментальской породы была выше, чем у быков черно-пестрой породы.
Среди аномалий строения половых клеток обследованных быков преобладали одиночные дефекты головки и хвоста, реже встречались аномалии средней части (табл. 2). Доля сочетанных аномалий, расположенных в разных частях сперматозоида, не превышала 1%.
Таблица 1
Параметры эякулята у исследованных быков разных пород
Показатель Породы
Черно-пестрая Симментальская Красные породы
Общий объем эякулята, мл 12,70± 0,99 11,60± 1,310 11,45± 1,49
Общее количество сперматозоидов, млрд 12,34± 0,93 12,78± 1,61 14,1± 2,38
Концентрация сперматозоидов в эякуляте, млрд/мл 1,01± 0,076 1,1± 0,077 1,2± 0,118
Доля прогрессивно подвижных сперматозоидов, % 80,97± 1,49 77,93± 2,11 75,96± 2,90
Доля аномальных сперматозоидов, % 13,30± 1,33 18,20± 2,29 16,52± 1,18
Среди аномалий головки преобладали аморфные головки, относительно часто встречались так же головки с грушевидной формой и отдельно лежащие головки. Доля других аномалий головки, таких как узкая, коническая, большая, маленькая, вакуолизированная, с аномалиями строения акросом-ной области не превышала одного процента.
Среди дефектов шейки и средней части преобладали изогнутая средняя часть и асимметричное прикрепление жгутика сперматозоида к головке. Доля других аномалий шейки и средней части не превышала одного процента.
Среди аномалий хвоста преобладали сперматозоиды со шпиль-кообразным хвостом, другие аномалии строения хвоста (закрученный и короткий хвост, наличие дистальной цитоплазматической капли) являлись минорными.
При анализе встречаемости аномалий строения сперматозоидов у быков разных пород (табл. 2) установлено, что частота нарушений строения головки сперматозоида у быков симментальской породы была достоверно выше, чем у быков черно-пестрой породы.
Встречаемость грушевидной головки у быков симментальской породы была достоверно выше, чем у быков черно-пестрой породы. Быки группы красных пород характеризовались достоверно более высокой встречаемостью аномалий средней части сперматозоида по сравнению с животными симментальской и черно-пестрой пород. Быки красных пород отличались от быков черно-пестрой породы более высокой встречаемостью сочетанных аномалий средней части и головки,
ЭФФЕКТИВНОЕ №2 март
животноводство 2018
а также тройных аномалий. Кроме того, у быков красных пород аморфная головка сперматозоида встречалась достоверно чаше, чем у быков черно-пестрой породы.
Таким образом, в данной работе представлены результаты исследования основных показателей качества спермы, а также встречаемости различных морфологических аномалий сперматозоидов. Средние значения концентрации сперматозоидов в эякуляте, доли подвижных и морфологически аномальных сперматозоидов у быков всех пород находились в пределах, установленных ГОСТ 23745-79 для свежей спермы, которая пригодна для криокон-сервации. Основные показатели качества спермы (концентрация и подвижность сперматозоидов) у быков, импортированных из Западной Европы, не отличались от таковых у быков приобского типа черно-пестрой породы, которая разводится на территории Западной Сибири уже несколько десятилетий. Это может свидетельствовать о хорошей адаптации импортных быков к условиям содержания.
В результате детального изучения строения сперматозоидов было установлено, что быки симментальской и красных пород отличаются от животных черно-пестрой породы повышенной встречаемостью отдельных аномалий головки. Быки группы красных пород характеризовались повышенной встречаемостью аморфной головки, а животные симментальской породы - грушевидной головки. В соответствии с классификацией Блома [3] аморфная и грушевидная головка относятся к группе мажорных аномалий. Как указывалось, повышенное содержание таких сперматозоидов в эякуляте может быть связано с увеличением уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и снижением фертильности животных [4].
Таблица 2
Встречаемость (в %) различных типов морфологических аномалий сперматозоидов у быков производителей разных пород
Показатель Породы
Черно-пестрая Симментальская Красные породы
Типы морфологических дефектов по месту расположения.
Головка 4,98±0,56 8,30±0,86** 6,32±0,73
Средняя часть 2,45±0,35 1,95±0,47» 3,73±0,51*
Хвост 5,38±0,93 7,10±1,31 5,52±0,82
Сочетанные аномалии головки и средней части 0,08±0,04 0,35±0,17 0,36±0,09**
Сочетанные аномалии головки и хвоста 0,28±0,08 0,35±0,17 0,32±0,18
Сочетанные аномалии средней части и хоста 0,11±0,05 0,00 0,00
Сочетанные аномалии головки, средней части и хвоста (тройные) 0,05±0,03 0,15± 0,10 0,27±0,08**
Индекс тератоспермии (Л\) 1,05±0,01 1,05±0,02 1,07±0,02
Типы морфологических аномалий по ( орме и размеру.
Аморфная головка 2,12±0,28 3,35±0,66 3,36±0,46*
Грушевидная головка 1,50±0,40 3,35±0,79* 1,57±0,57
Отдельно лежащая головка 1,58±0,35 2,90±1,16 1,89±0,59
Склоненная головка 1,42±0,39 1,05±0,28 2,07±0,50
Ассиметричное прикрепление хвоста 1,34±0,23 1,05±0,50 2,09±0,57
Шпилькообразный хвост 4,10±0,82 5,00±0,83 3,89± 0,74
Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что несмотря на нормальные значения концентрации и подвижности сперматозоидов, сперма быков пород зарубежной селекции, содержащихся в климатических условиях Западной Сибири, может иметь сниженную оплодотворяющую способность из-за возможного повреждения ДНК половых клеток в процессе спермиогенеза.
Некоторыми исследователями установлена взаимосвязь между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и фертильностью у сельскохозяйственных животных, поэтому определение данного показателя начинает все чаще использоваться при оценке качества эякулята быков во многих странах [8-10]. Полученные нами данные указывают на необходимость изучения не только морфологии сперматозоидов, как индикатора возможных повреждений ДНК и потенциальной фертильности, а также определения уровня фрагментации ДНК половых клеток при оценке качества эякулята быков производителей. В настоящее время этому уделяется недостаточно внимания, вероятно ввиду трудоемкости и дороговизны данных методов. Однако можно надеяться, что развитие технологий компьютерной морфометрии в будущем позволит преодолеть эти затруднения и внедрить детальный анализ морфологического строения сперматозоидов и оценку целостности ДНК сперматозоидов в практику животноводства.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №15-16-30003).
Примечание к таблице 2.
** - достоверность отличий симментальской породы и группы красных пород от черно-пестрой породы (р<0,01).
* - достоверность отличий симментальской породы и группы красных пород от черно-пестрой породы (р<0,05).
#- достоверность отличий симментальской породы от группы красных пород (р<0,05).
Литература:
1. Амерханов Х. А., Абилов А. И., Ескин Г. В. и др. Альбом по искусственному осеменению крупного рогатого скота. М.: «Росинформагротех», 2011. - 172 с.
2. Boer P., de Vires M., Ramos L. A mutation study of sperm head shape and motility in the mouse: lessons for the clinic // Andrology. 2015. № 3. P. 174-202.
3. Reproduction in cattle / P. Ball, A.R. Peters. - Oxford: Blackwell Publishing Ltd, 2004. P. 35.
4. Enciso M., Cisale H., Johnston S.D. et al. Major morphological sperm abnormalities in the bull are related to sperm DNA damage.//Theriogenology. 2011. Vol. 76, № 1. P. 23-32.
5. Saacke R.G. Sperm morphology: Its relevance to compensable and uncompensable traits in semen//Theriogenology. 2008. Vol. 70, № 3. P. 473-478.
6. Thundathil J., Meyer R., Palasz A.T. et al. Effect of the knobbed acrosome defect in bovine sperm on IVF and embryo production // Theriogenology. 2000. Vol. 54, N 6. P. 921-934.
7. Bovine reproduction / edition by R. M. Hopper. - Oxford: Wiley-Blackwell, 2014. 816 p.
8. Karoui S., Díaz C., González-Marín C. et al. Is sperm DNA fragmentation a good marker for field AI bull fertility? // J. Anim. Sci. 2012. Vol. 90, № 6. P. 2437-2449.
9. Serafini R., Romano J. E., Varner D. D. et al. Sperm DNA assays and their relationship to sperm motility and morphology in bulls (Bos taurus) // Anim. Reprod. Sci. 2015. Vol. 159. P. 77-86.
10. Evenson D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility//Anim. Reprod. Sci. 2016. Vol. 169. P. 56-75.
