Оценка микробиоты кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона с помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оценка микробиоты кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона с помощью метода газовой хромато -масс - спектрометрии

И.В. Красаков1'2, И.В. Литвиненко2, Г.Г. Родионов1, И.И. Шантырь1, Е.В. Светкина1

ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова», Санкт-Петербург, Россия; ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова», Санкт-Петербург, Россия

Представлены результаты сравнительного исследования состава микробиоты кишечника 16 пациентов с 3-й стадией болезни Паркинсона и 94 неврологически здоровых лиц сопоставимого возраста методом газовой хромато-масс-спектрометрии. В пристеночном слое кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона общее количество микробных маркеров увеличено на 43% по сравнению с группой контроля. Увеличение происходит за счет повышения количества условно-патогенной флоры в 2раза и уменьшения в 2раза количества микробных маркеров полезной микрофлоры. Полученные результаты могут рассматриваться как промежуточные и нуждаются в валидации на репрезентативном числе пациентов. Необходимы также оценка взаимосвязи иммунного статуса с изменениями микробиоты и разработка методов коррекции выявленных изменений. Анализ эффективности восстановления качественного и количественного состава микробиоты должен проводиться с применением методов оценки биоэквивалентной дозы леводопы.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, микробиота кишечника, газовая хромато-масс-спектрометрия.

Адрес для корреспонденции: 194044, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2. ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова. E-mail: ikrasakov@gmail.com. Красаков И.В.

Для цитирования: Красаков И.В., Литвиненко И.В., Родионов Г.Г., Шантырь И.И., Светкина Е.В. Оценка микробиоты кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона с помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2018; 12(4): 23-29.

DOI: 10.25692/ACEN.2018.4.3

Evaluation of gut microbiota in Parkinson's disease

using gas chromatography with mass spectrometric detection

Igor V. Krasakov1'2, Igor V. Litvinenko2, Gennadiy G. Rodionov1, Igor I. Shantyr1, Ekaterina V. Svetkina1

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, St. Petersburg, Russia; 2Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia

The paper presents preliminary results of a comparative study assessing the gut microbiota in patients with Parkinson's disease and the control group using the gas chromatography with mass spectrometric detection. Sixteen patients with stage 3 Parkinson's disease and 94 age-matched persons without Parkinson's disease were examined. It was revealed that the total number of microbial markers in parietal intestinal microbiota in patients with Parkinson's disease was increased by 43% compared with the control group. This increase is due to a 2-fold increase in the number of conditional-pathogenic flora, and at the same time there was a 2-fold decrease in the number of microbial markers of useful microflora. The obtained results may be regarded as preliminary and need to be assessed in a large cohort of patients with Parkinson's disease. It is also necessary to assess the relationship between immune status and changes in microbiota, and to develop methods of correction of the revealed changes. Analysis of the efficiency of restoration of qualitative and quantitative composition of microbiota should be carried out using methods for the assessment of bioequivalence levodopa dose.

Keywords: Parkinson's disease, gut microbiota, gas chromatography-mass spectrometry.

For correspondence: 194044, Russia, St. Petersburg, ul. Akad. Lebedeva, 4/2, Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine. E-mail: ikrasakov@gmail.com. Igor V. Krasakov.

For citation: Krasakov I.V., Litvinenko I.V. , Rodionov G.G., Shantyr I.I., Svetkina E.V. [Evaluation of gut microbiota in Parkinson's disease using gas chromatography with mass spectrometric detection]. Annals of clinical and experimental neurology 2018; 12(4): 23-29. (In Russ.)

DOI: 10.25692/ACEN.2018.4.3

Вегетативные расстройства являются неотъемлемой частью клинической картины заболевания у большинства пациентов с болезнью Паркинсона (БП) [1—3]. До 80% пациентов с БП имеют проблемы с желудочно-кишечным трактом [4]: нарушения моторики кишечника, запоры. Патофизиология запора при БП обусловлена дегенерацией энтерической нервной системы, вызванной отложением в ней патологической изоформы белка а-синуклеина [5]. Это сопровождается местным воспалением, оксидативным стрессом и кишечной проницаемостью. Описанные изменения задолго предшествуют двигательным расстройствам при БП, что является основанием для гипотезы о дебюте патофизиологического процесса синуклеинопатии именно с га-строинтестинального тракта [6].

Запор - не единственная проблема желудочно-кишечного тракта, развивающаяся при БП. Все чаще внимание исследователей привлекает состав кишечной микрофлоры/ микробиоты при данном заболевании. Микробиоту кишечника (МБК) не случайно называют «забытым органом». В ее состав входит до 100 трлн бактерий, что в десятки раз больше количества клеток человеческого тела. Полный геном МБК составляют около 3 млн генов, что в 150 раз больше генома человека. Треть МБК является общей для большинства людей, в то время как две трети индивидуальны для каждого человека [7]. До 50-60% состава МБК окончательно не изучено [8]. Существуют гипотезы о возможном влиянии такой большой популяции бактерий и их генома на поведение и физиологию человека; в частности, предложена теория двустороннего взаимодействия системы МБК-ствол мозга [9].

В настоящее время активно изучается проблема взаимосвязи так называемого синдрома тонкокишечного дисбио-за - повышенного заселения тонкой кишки микрофлорой, и БП. Указанный синдром выявляется у четверти пациентов с БП, что значительно превышает его распространенность в популяции. Недавние исследования показали, что в стуле пациентов с БП значительно снижено содержание бактерий семейства Prevotellaceae по сравнению с группой контроля, а также повышен уровень содержания эндотоксина кишечной палочки [10]. Наблюдается достоверное снижение уровня бактерий рода Blautia, Coprococcus, Roseburia в стуле пациентов с БП по сравнению с группой контроля. Кроме того, у пациентов с БП снижение уровня бактерий рода Faecalibacterium сочетается с повышением уровня Ralstonia в слизистой оболочке кишечника [10].

На генетическом уровне в МБК пациентов с БП отмечается существенная дисрегуляция генов, вовлеченных в синтез и секрецию липополисахаридов [11]. Выраженность синдрома тонкокишечного дисбиоза коррелирует с тяжестью двигательных расстройств у пациентов с БП, а его коррекция приводит к снижению выраженности моторных флуктуаций [12]. Более того, выявлена положительная корреляция между числом энтеробактерий и выраженностью постуральной неустойчивости и расстройства ходьбы у пациентов с БП [13]. Приведенные данные позволяют предположить, что на синтез дофамина в головном мозге влияют дофаминпродуцирующие ферменты, чью активность контролирует МБК [14]. Учитывая, что бактерии рода Bacillus, входящие в состав МБК, способны синтезировать дофамин [15], можно считать, что ориентировочно половина содержания уровня дофамина в организме приходится на МБК [16].

Влияние МБК на центральную нервную систему продемонстрировано на примере гнотобиотов, а также приема оральных антибиотиков, пробиотиков [17]. Гнотобиоти-ческие животные (гнотобиоты) - это животные, получаемые после гистерэктомии с целью исключения получения микробиоты матери во время прохождения через родовые пути. Гнотобиоты выращиваются в особых условиях, они полностью свободны от микрофлоры или являются носителями только определенных видов микроорганизмов. Уровень катехоламинов (дофамин, норадреналин и серо-тонин), определяемый в разных отделах головного мозга (лобная кора, стриатум и гиппокамп), у мышей-гнотобио-тов и мышей из группы контроля существенно различается. У стерильных мышей по сравнению с группой контроля значительно выше уровень обмена катехоламинов в стриа-туме [18] и общий уровень дофамина в головном мозге [19]. Данные результаты объясняют повышенную двигательную активность стерильных мышей по сравнению с группой контроля [18]. Синтез ферментов, участвующих в процессе преобразования тирозина в дофамин (тирозингидроксила-за, ДОФА-декарбоксилаза), подвержен влиянию системы МБК-ствол мозга [20]. В связи с этим высока вероятность контроля уровня дофамина в стволе мозга симбиотически-ми бактериями. Более того, уровень мозгового тирозина контролируется именно МБК, т.к. у стерильных мышей отмечается его достоверное снижение по сравнению с группой контроля [19].

У гнотобиотов-мышей отмечается усиление экспрессии гена D1-дофаминового рецептора в гиппокампе и снижение в стриатуме, в отличие от группы контроля. Экспрессия гена фактора роста нервов (NGFI-A), играющего важную роль в нейропластичности, значительно снижена в префронтальной коре и стриатуме именно у стерильных мышей, что отражает снижение синаптической пластичности в стриатуме. Отмечено увеличение экспрессии белков, вовлеченных в синаптогенез (синаптофизин и PSD-95), в стриатуме у стерильных мышей. В то же время различий в лобной коре и гиппокампе между стерильными мышами и группой контроля не выявлено. Проведенное дополнительное исследование [18] показало различие между стерильными мышами и группой контроля в экспрессии еще 23 генов в стриатуме. Полученные результаты подтверждают влияние МБК на работу стриатума, вероятно, играющее важную роль в патогенезе БП.

Среди антибиотиков отдельного внимания заслуживает миноциклин - полусинтетический антибиотик из группы тетрациклинов, который, помимо влияния на МБК, приводит к снижению активности каспазы-1 (интерлейкин-1^-превращающий фермент) и индуцибельной NO-синтетазы, играющих важную роль в апоптозе. Миноциклин блокирует нейродегенерацию нигростриарных дофаминергиче-ских нейронов, а также истощение дофамина в стриатуме и nucleus accumbens при индуцированном 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином паркинсонизме у мышей [21]. In vitro миноциклин обеспечивает нейропротектив-ный эффект тирозингидроксилаза-иммунореактивных нейронов в модели на основе введения ротенона [22]. В опытах с дрозофилами выявлено, что миноциклин обладает противовоспалительным и антиоксидантным действием, оказывая потенциальный дофаминергический эффект [23]. Миноциклин хорошо показал себя как потенциальный препарат для терапии БП во II фазе клинических исследований, в настоящее время планируется проведение III фазы [24]. Он обладает способностью восстанавливать

Микробиота кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона

физиологическую МБК за счет снижения отношения Firmicutes/Bacteroidetes [25]. Принимая во внимание данный факт и учитывая выявленные нейропротективные возможности миноциклина при БП, можно предположить, что симбиотические бактерии кишечника играют важную роль в патогенезе БП. Определенным нейропротективным эффектом при БП обладает также ампициллин. Терапия ампициллином предотвращала двигательные и поведенческие расстройства у мышей, которым был введен антиген стрептококка группы А, приводящий к развитию дисфункции дофаминергической системы [26]. Введение ампициллина способствовало повышению уровня тирозингидрок-силазы, D1- и D2-рецепторов в стриатуме без снижения уровня антигенстрептококка группы А. Поскольку при БП ярко выражена дисфункция центральной дофаминер-гической системы, можно предположить, что ампициллин оказывает свое действие опосредованно за счет влияния на МБК и систему МБК-ствол мозга.

В теории применение пробиотиков в правильных дозах может положительно влиять на синдром тонкокишечного дисбиоза и, предположительно, на центральную нервную систему. В 2011 г. была показана возможность пробиотиче-ской бактерии Bacillus sp. JPJ преобразовывать L-тирозин в леводопу (99,4% преобразования) in vitro [27]. Лакто- и бифидобактерии способны продуцировать антиоксиданты, витамины и биологически активные вещества [28] и, следовательно, ограничивать избыточное количество свободных радикалов, приводя к снижению нейродегенерации. Проведено пилотное исследование, которое показало, что регулярное потребление ферментированного молока, содержащего Lactobacillus casei Shirota, снижает выраженность запора у пациентов с БП [29].

Влияние хронической кишечной инфекции на течение БП наиболее полно изучено на модели Helicobacter pylori, обсе-мененность которой широко распространена у пациентов с БП. Носительство данной бактерии приводит к снижению всасывания леводопы и усилению выраженности моторных флуктуаций [30], а инфицирование H. руЬп - к снижению уровня дофамина в моторных областях головного мозга у мышей [31]. Вероятно, обсемененность H. руЬп непосредственно не участвует в патогенезе БП, а приводит к системному воспалению и аутоиммунному ответу [32]. Эрадикация бактерии, в свою очередь, снижает выраженность кахексии [33], повышает всасывание леводопы и уменьшает инвалидизацию пациентов с БП [34].

Все описанные явления, происходящие при БП на фоне изменения МБК, могут быть объяснены в том числе усилением системного воспаления. У мышей-гнотобиотов, в отличие от мышей с нормальной микрофлорой, повышена проницаемость гематоэнцефалического барьера [35]. Данный факт объясняется снижением синтеза окклюдинов и клау-динов, обеспечивающих работу плотных контактов гемато-энцефалического барьера, которые регулируют барьерную функцию. Вероятно, синтез данных белков обеспечивается работой физиологической МБК. Измененная МБК при БП приводит к активации толл-подобных рецепторов 2 и 4 (TLR2/4), являющихся важным компонентом врожденной иммунной системы, что на фоне повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера приводит к активизации воспалительных процессов в головном мозге [36]. Приведенные факты могут свидетельствовать об общности патогенеза воспалительных и дегенеративных заболеваний нервной системы на примере БП и рассеянного склероза [37].

Таким образом, существуют весомые основания полагать, что качественное или количественное изменение МБК может играть существенную роль в патогенезе БП.

Оценка изменений МБК при БП может помочь в решении практических задач:

• окончательное описание специфики МБК;

• оценка взаимосвязи выраженности расстройств МБК и хронического воспалительного процесса при БП;

• объективная оценка влияния измененной МБК на всасывание леводопы и, как следствие, на степень выраженности двигательных расстройств и моторных флуктуа-ций;

• разработка подходов к коррекции нарушений МБК при БП.

Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и недостатки. Например, существенным недостатком классического бактериологического исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невозможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов в инфекционно-воспалительном процессе, прежде всего связанном с анаэробами. Иммуносерологический метод, используемый в качестве дополнительного к классическому, является непрямым, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации. Известные молекулярно-биологические методы при несомненных преимуществах (прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций) имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [38].

Исходя из вышеизложенного, очевидна необходимость в надежном количественном экспресс-методе диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции. По нашему мнению, таким методом может стать хемодиф-ференциация микроорганизмов с помощью метода газовой хроматографии, совмещенного с масс-спектрометрией (ГХ-МС), основанного на количественном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов).

ГХ-МС позволяет получить уникальную информацию о составе особых мономерных химических компонентов микробной клетки, поступающих в плазму крови и характерных для тех или иных таксонов. Эти компоненты (маркеры) могут быть выделены из других химических составляющих суммарной биомассы биологических объектов и использованы для детектирования микроорганизмов соответствующего рода или вида. Суть анализа состоит в прямом извлечении из подлежащего исследованию образца с помощью химической процедуры высших жирных кислот, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Поскольку хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных - не более 3 ч. Его результатом является количественное определение состава микроорганизмов, присутствующих в биологических жидкостях и тканях.

К настоящему времени состав жирных кислот большинства клинически значимых микроорганизмов хорошо изучен, показана его воспроизводимость, оценена родо- и ви-доспецифичность.

Предлагаемая технология позволяет не только проводить мониторинг этих соединений в образцах, но и рассчитывать численность микроорганизмов того или иного таксона в образце. В этом принципиальное отличие метода, придающее ему качественно новое свойство - возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров для оценки вклада каждого из сотен видов микроорганизмов, присутствующих, например, в фекалиях. В 2010 г. метод ГХ-МС разрешен Росздравнадзором к применению в качестве новой медицинской технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии». Обнаруженные в результате систематических исследований особенности гомеостаза микробных маркеров в крови и адекватность его профиля составу МБК здорового человека обеспечили уникальную возможность мониторировать состояние МБК по анализу крови.

Цель исследования - оценить качественный и количественный состав пристеночной МБК у пациентов с БП и провести сравнение с составом МБК группы контроля с использованием ГХ-МС.

Материалы и методы_

В пилотное исследование были включены 16 пациентов (7 мужчин и 9 женщин; возраст 58-67 лет) с БП 3-й стадии по функциональной шкале Хен-Яра. В группу сравнения вошли 94 пациента (25 мужчин и 69 женщин; возраст 55-65 лет) с различной соматической патологией (отобраны методом сплошной выборки), проходившие стационарное обследование и лечение в ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова и не имевшие неврологических заболеваний.

Количественный состав пристеночной МБК определяли на газовом хроматографе «Agilent 7890» («Agilent Technologies», США) с масс-селективным и пламенно-ионизационным детекторами.

Отобранную у обследуемых кровь в объеме 40 мкл высушивали c добавлением равного по объему количества метанола и подвергали кислому метанолизу в 1 М HCl в метаноле. Метанолиз проводили в 0,4 мл реактива на 10-15 мг сухого остатка в течение 1 ч при 80°С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных ли-пидов микроорганизмов и других клеток жидкости в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. Эти компоненты экстрагировали гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гек-сановый экстракт высушивали, а сухой остаток обрабатывали ^О-бис(триметил-силил)-трифторацетамидом в количестве 20 мкл в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакционной смеси эфиров добавляли 80 мкл гексана.

Для проведения анализа 2 мкл смеси эфиров вводили в инжектор ГХ-МС посредством автоматической системы ввода проб (автосэмплер), которая обеспечивает воспроизводимость времени удерживания хроматографических пиков и повышает точность автоматической обработки данных.

Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фа-

зой HP-5ms длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм, газ-носитель - гелий. Режим анализа - программированный, скорость нагрева термостата колонки - 7°С/мин в диапазоне 135-320°С. Выдержка при начальной температуре - 1,5 мин; температура испарителя - 250°С, интерфейса - 250-300°С. Интервалы и ионы выбирали таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов.

На основании принципов, изложенных в публикации [39], рассчитаны объединенные статистические показатели пристеночной МБК: общее количество клеток, количество маркеров полезной и условно-патогенной микрофлоры, анаэробы, аэробы и их соотношение.

Статистическую обработку полученных результатов (оценка медианы, квартилей и 50% доверительного интервала) проводили с помощью пакета статистических программ «Йа^гса 6.0».

Результаты и обсуждение_

В пристеночном слое кишечника у пациентов с БП общее количество микробных маркеров было увеличено на 43% по сравнению с группой контроля (табл. 1). Различались количественный и качественный состав МБК. У больных БП было больше, чем в контроле, микробных маркеров условно-патогенной микрофлоры: Staphylococcus intermedius - на 61%, Eubacterium lentum (группа А) -в 5,8 раза, Clostridium hystolyticum - в 2,8 раза, Peptostreptococ. Anaerobius - в 3,6 раза, Ruminicoccus - в 3,8 раза, Nocardia и Nocardia asteroides - в 2 раза, Clostridium propionicum и Сем. Enterobacteriaceae (E. coli и пр.), а также микробных маркеров Микр грибы, ситостерол - в 1,7 раза, Микр грибы, кампестерол и микробных маркеров Herpes -в 2,8 раза. В 2 раза снизилось количество микробных маркеров Propionibacterium и ряда других бактерий (Streptococcus, Cl. difficile, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium acnes).

Количество микробных маркеров полезной микрофлоры у пациентов с БП было ниже, чем в группе контроля: Eubac-terium/Cl.coccoides - в 6,3 раза, Bifidobacterium - в 2,5 раза, Propionibacterium/Cl. subterm. - в 1,5 раза, Lactobacillus - на 24% (рис. 1).

Таким образом, у пациентов с БП соотношение полезной и условно-патогенной микрофлоры было практически в 4 раза ниже этого показателя в группе контроля (табл. 2). Количество бактерий-аэробов превалировало по отношению к анаэробам в 2 раза, на что указывает снижение соотношения анаэробы/аэробы в 1,8 раза.

Таким образом, в пристеночном слое кишечника у пациентов с БП общее количество микробных маркеров увеличено на 43% по сравнению с группой контроля. Данное увеличение происходит за счет двукратного повышения количества маркеров условно-патогенной микрофлоры и параллельного снижения вдвое количества микробных маркеров полезной микрофлоры.

Для достоверности эксперимента в группу контроля были включены пациенты старшей возрастной категории, состав МБК которых значительно отличается от условной «нормы». Сравнение с показателями здоровых людей молодого поколения [38] в данном случае некорректно, т.к. различия между группами будут выражены значительно ярче.

Микробиота кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона

Таблица 1. Статистические показатели пристеночной микробиоты кишечника группы контроля и пациентов с БП (количество клеток/г* 105) Table 1. Statistical indicators of near-wall intestinal microbiota in the control group and patients with Parkinson's disease (number of cells/gx105)

Группы и таксоны микроорганизмов / Groups and taxons of microorganisms Контроль / Control (л=94) БП / Parkinson disease (n=16)

медиана/ mediana 50% интервал / 50% DI медиана / mediana 50% интервал / 50% DI

Грамположительные кокки, аэробные или факультативные / Gram-positive coccuses, aerobic or facultative

Streptococcus (оральные / oral forms) 2670 2075-3655 - -

Staphylococcus intermedius 1110 715-1630 1786* 1540-3482

Streptococcus mutans 270 200-350 292 279-344

Анаэробы / Anaerobi

Eubacterium lentum (группа А / group A) 224 130-430 1300* 1238-1709

Eubacterium/Cl. coccoides 5130 2760-9300 817* 662-962

Clostridium hystolyticum 536 270-1070 1520* 1055-2010

Clostridium ramosum 5084 3840-7050 4348 3774-5292

Cl. difficile 130 86-200 - -

Clostridium propionicum - - 11 711 11 119-13 138

Propionibacterium 10 0,1-40 5* 2-31

Propionibacterium/Cl. subterm. 1350 730-2130 911* 897-1809

Propionibacterium jensenii 310 100-850 - -

Propionibacterium acnes 44 0,1-135 - -

Peptostreptococ. anaerobius 1,2 131 0,1-230 475* 56-1498

Lactobacillus 8100 5700-11 860 6167* 5550-7432

Bifidobacterium 2330 1400-050 914* 714-1621

Актиномицеты / Actinobacteria 35 25-40 36 25-52

Actinomyces viscosus 790 510-1190 883 464-1168

Ruminicoccus 1110 710-1340 4208* 3633-4295

Грамположительные палочки аэробные или факультативные / Gram-positive bacilli, aerobic or facultative

Nocardia, 14:1d11 3500 2580-4675 6436* 5797-7003

Nocardia asteroides 1090 546-1600 2237* 2095-2781

Rhodococcus 203 130-265 181 155-203

Corineform CDC-group XX 400 270-523 333 258-630

Грамотрицательные палочки аэробные или факультативные / Gram-negative bacilli, aerobic or facultative

Семейство / Family Enterobacteriaceae (E. coli и пр.) (E. coli and others) 0 0-34 158* 124-207

Грибы, вирусы и пр. / Fungi, viruses, etc.

Микр грибы, ситостерол / Micro-fungi, cytosterol 19 9-40 33* 17-41

Микр грибы, кампестерол / Micro-fungi, campesterol - - 1008 852-1219

Candida 290 100-450 351 297-528

Streptomyces 266 177-407 194 139-529

Herpes 1380 340-3240 3932* 2881-3932

Цитомегаловирус - - 3539 3108-4333

Pseudonocardia 35 20-50 30 27-42

Общее количество клеток / Whole number of cells 36 591 28 87638 540 52 196* 50 525-68 404

Примечание: здесь и в табл. 2 * - р<0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни). Note: here and in the Table 2 * - р<0.05 in comparison with control group (Mann-Whitney test)

70

И Lactobacillus | Eubacterium/Cl. Coccoides | Bifidobacterium Q Propionibacterium/Cl. subterm

Рис. 1. Доля отдельных представителей микроорганизмов в структуре МБК у пациентов группы контроля (А) и у пациентов с БП (В)

Fig. 1. Proportion of particular microorganisms in the structure of intestinal microbiota

Таблица 2. Объединенные статистические показатели пристеночной МБК в группах сравнения (количество клеток/г* 105) Table 2. Combined statistical parameters of near-wall intestinal microbiota in the groups under comparison (number of cells/g*105)

Показатели микрофлоры / Parameters of microflora Контроль / Control (л=94) БП / Parkinson disease (n=16)

медиана/ mediana 50% интервал / 50% DI медиана / mediana 50% интервал / 50% DI

Маркеры полезной микрофлоры / Markers of useful microflora 16 910 13 500-26 800 8667* 7963-11 873

Маркеры условно-патогенной микрофлоры / Markers of opportunistic microflora 17 691 15 300-24 100 36 431* 34 295-46 910

Маркеры полезной микрофлоры/

маркеры условно-патогенной микрофлоры /

Markers of useful microflora/markers of opportunistic microflora

Анаэробы / Anaerobi

Аэробы / Aerobi

Анаэробы/аэробы / Anaerobi/aerobi Общая сумма / Total sum

Полученные результаты являются промежуточными, и для их уточнения необходима оценка МБК у большего числа пациентов с БП. В дальнейшем, после получения достоверных и валидированных данных, большой интерес будет представлять разработка способов коррекции дисбиоза при помощи антибиотиков и метабиотиков, а также оценка динамики изменения иммунного статуса и моторных флуктуаций на

0,96 0,79-1,43 0,25* 0,22-0,27

25 358 19 800-34 200 26 534 26 028-36 494

9243 6300-17 000 17 891* 16 484-20 606

2,74 2,51-3,08 1,56* 1,40-1,67

36 591 26 800-47 800 52 196* 50 525-68 404

этом фоне. Очевидно, что для отражения изменений всасываемости леводопы на фоне коррекции МБК недостаточно оценки только субъективного мнения пациента (дневники Хаузера). В настоящее время нами завершается внедрение методов оценки биоэквивалентности дозы леводопы в плазме, что позволит объективно оценивать влияние коррекции МБК на фармакодинамику и фармакокинетику леводопы.

Список литературы/References

1. Illarioshkin S.N., Levin O.S. (eds.) Rukovodstvo po diagnostike i lecheniyu bolezni Parkinsona [A Guide to the Diagnosis and Treatment of Parkinson's Disease]. Moscow, 2017. 336 p. (In Russ.)

2. Levin O.S., Fedorova N.V. Bolezn'Parkinsona [Parkinson's Disease]. Moscow, 2016. 384 p. (In Russ.)

3. Litvinenko I.V. Bolezn'Parkinsona [Parkinson's Disease]. Moscow, 2006. 216 p. (In Russ.)

4. Ueki A., Otsuka M. Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol 2004; 251(suppl 7): vII8-23. DOI: 10.1007/s00415-004-1706-3. PMID: 15505750.

5. Cersosimo M.G., Benarroch E.E. Pathological correlates of gastrointestinal dysfunction in Parkinson's disease. Neurobiol Dis 2012; 46: 559-564. DOI: 10.1016/j.nbd.2011.10.014. PMID: 22048068.

6. Braak H., de Vos R.A., Bohl J., Del Tredici K. Gastric alpha-synuclein im-munoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett 2006; 396: 67-72. DOI: 10.1016/j.neulet.2005.11.012. PMID: 16330147.

7. Franzosa E.A., Huang K., Meadow J.F. et al. Identifying personal micro-biomes using metagenomic codes. Proc Natl Acad Sci USA 2015; 112: E2930-E2938. DOI: 10.1073/pnas.1423854112. PMID: 25964341.

8. Browne H.P., Forster S.C., Anonye B.O. et al. Culturing of 'unculturable' human microbiota reveals novel taxa and extensive sporulation. Nature 2016; 533: 543-546. DOI: 10.1038/nature17645. PMID: 27144353.

9. Cryan J.F., Dinan T.G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nat Rev Neurosci 2012; 13: 701-712. DOI: 10.1038/nrn3346. PMID: 22968153.

10. Forsyth C.B., Shannon K.M., Kordower J.H. et al. Increased intestinal permeability correlates with sigmoid mucosa alpha-synuclein staining and endo-toxin exposure markers in early Parkinson's disease. PLoS One 2011; 6: e28032. DOI: 10.1371/journal.pone.0028032. PMID: 22145021.

11. Keshavarzian A., Green S.J., Engen P.A. et al. Colonic bacterial composition in Parkinson's disease. Mov Disord 2015; 30: 1351-1360. DOI: 10.1002/ mds.26307. PMID: 26179554.

12. Tan A.H., Mahadeva S., Thalha A.M. et al. Small intestinal bacterial overgrowth in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat Disord 2014; 20: 535-540. DOI: 10.1016/j.parkreldis.2014.02.019. PMID: 24637123.

13. Scheperjans F., Aho V., Pereira P.A. et al. Gut microbiota are related to Parkinson's disease and clinical phenotype. Mov Disord 2015; 30: 350-358. DOI: 10.1002/mds.26069. PMID: 25476529.

14. Thakur A.K., Shakya A., Husain G.M. et al. Gut-microbiota and mental

Микробиота кишечника у пациентов с болезнью Паркинсона

health: current and future perspectives. J Pharmacol Clin Toxicol 2014; 2: 1016.

15. Cryan J.F., Dinan T.G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nat Rev Neurosci 2012; 13: 701-712. DOI: 10.1038/nrn3346. PMID: 22968153.

16. Wall R., Cryan J.F., Ross R.P. et al. Bacterial neuroactive compounds produced by psychobiotics. Adv Exp Med Biol 2014; 817: 221-239. DOI: 10.1007/978-1-4939-0897-4_10. PMID: 24997036.

17. Parashar A., Udayabanu M. Gut microbiota: Implications in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat Disord. 2017; 38: 1-7. DOI: 10.1016/j.parkreld-is.2017.02.002. PMID: 28202372.

18. Diaz Heijtz R., Wang S., Anuar F. et al. Normal gut microbiota modulates brain development and behavior. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 3047-3052. DOI: 10.1073/pnas.1010529108. PMID: 21282636.

19. Matsumoto M., Kibe R., Ooga T. et al. Cerebral low-molecular metabolites influenced by intestinal microbiota: a pilot study. Front Syst Neurosci 2013; 7: 9. DOI: 10.3389/fnsys.2013.00009. PMID: 23630473.

20. Daubner S.C., Le T., Wang S. Tyrosine hydroxylase and regulation of dopamine synthesis. Arch Biochem Biophys 2011; 508: 1-12. DOI: 10.1016/j. abb.2010.12.017. PMID: 21176768.

21. Du Y., Ma Z., Lin S. et al. Minocycline prevents nigrostriatal dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 14 669-14 674. DOI: 10.1073/pnas.251341998. PMID: 11724929.

22. Radad K., Moldzio R., Rausch W.D. Minocycline protects dopaminergic neurons against long-term rotenone toxicity. Can J Neurol Sci 2010; 37: 81-85. DOI: 10.1017/S0317167100009690. PMID: 20169778.

23. Inamdar A.A., Chaudhuri A., O'Donnell J. The protective effect of minocycline in a paraquat-induced Parkinson's disease model in drosophila is modified in altered genetic backgrounds. Parkinsons Dis 2012; 2012: 938528. DOI: 10.1155/2012/938528. PMID: 22900232.

24. NINDS NET-PD Investigators. A randomized, double-blind, futility clinical trial of creatine and minocycline in early Parkinson disease. Neurology 2006; 66: 664-671. DOI: 10.1212/01.wnl.0000201252.57661.e1. PMID: 16481597.

25. Yang T., Santisteban M.M., Rodriguez V. et al. Gut dysbiosis is linked to hypertension. Hypertension 2015; 65: 1331-1340. DOI: 10.1161/HYPERTEN-SIONAHA.115.05315. PMID: 25870193.

26. Lotan D., Cunningham M., Joel D. Antibiotic treatment attenuates behavioral and neurochemical changes induced by exposure of rats to group a streptococcal antigen. PLoS One 2014; 9: e101257. DOI: 10.1371/journal.pone.0101257. PMID: 24979049.

27. Surwase S.N., Jadhav J.P. Bioconversion of L-tyrosine to L-DOPA by a novel bacterium Bacillus sp. JPJ. Amino Acids 2011; 41: 495-506. DOI: 10.1007/ s00726-010-0768-z. PMID: 20963458.

28. LeBlanc J.G., Milani C., de Giori G.S. et al. Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective. Curr Opin Biotechnol2013; 24: 160-168. DOI: 10.1016/j.copbio.2012.08.005. PMID: 22940212.

29. Cassani E., Privitera G., Pezzoli G. et al. Use of probiotics for the treatment of constipation in Parkinson's disease patients. Minerva Gastroenterol Dietol 2011; 57: 117-121. DOI: 10.1038/s41531-018-0042-8. PMID: 21587143.

30. Mridula K.R., Borgohain R., Chandrasekhar Reddy V. et al. Association of Helicobacter pylori with Parkinson's Disease. J Clin Neurol 2017; 13: 181-186. DOI: 10.3988/jcn.2017.13.2.181. PMID: 28406585.

31. Senkovich O.A., Yin J., Ekshyyan V. et al. Helicobacter pylori AlpA and AlpB bind host laminin and influence gastric inflammation in gerbils. Infect Immun 2011; 79: 3106-3116. DOI: 10.1128/IAI.01275-10. PMID: 21576328.

32. Arai H., Furuya T., Mizuno Y., Mochizuki H. Inflammation and infection in Parkinson's disease. Histol Histopathol 2006; 21: 673-678. DOI: 10.14670/HH-21.673. PMID: 16528677.

33. Dobbs R.J., Dobbs S.M., Weller C. et al. Role of chronic infection and inflammation in the gastrointestinal tract in the etiology and pathogenesis of id-iopathic parkinsonism. Part 1: eradication of Helicobacter in the cachexia of idiopathic parkinsonism. Helicobacter 2005; 10: 267-275. DOI: 10.1111/j.1523-5378.2005.00331.x. PMID: 16104942.

34. Fiddian-Green R.G. Helicobacter pylori eradication and L-dopa absorption in patients with PD and motor fluctuations. Neurology 2007; 68: 1085. DOI: 10.1212/01.wnl.0000260440.07107.99. PMID: 17389325.

35. Braniste V., Al-Asmakh M., Kowal C. et al. The gut microbiota influences blood-brain barrier permeability in mice. Sci TranslMed2014; 6: 263ra158. DOI: 10.1126/scitranslmed.3009759. PMID: 25411471.

36. Anderson G., Seo M., Berk M. et al. Gut permeability and microbiota in Parkinson's disease: role of depression, tryptophan catabolites, oxidative and ni-trosative stress and melatonergic pathways. Curr Pharm Des 2016; 22: 6142-6151. DOI: 10.2174/1381612822666160906161513. PMID: 27604608.

37. Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. [Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy]. Zhurnal nevrologii ipsikhiatrii imeni S.S. Korsakova 2017; (6) (suppl 2): 3-10. (In Russ.) DOI: 10.17116/jnevro2017117623-10.

38. Rodionov G.G., Shantyr I.I., Svetkina E.V. et al. [Evaluation of the wall intestinal microbiota of healthy people by gas chromatography - mass spectrometry method]. Translyatsionnaya meditsina 2017; 4(6): 34-42. (In Russ.) DOI: 10.18705/2311-4495-2017-4-6-34-42.

39. Budnikov G.K. (ed.) Problemy analiticheskoy khimii [Problems of Analytical Chemistry]. Moscow, 2010; 11: 293-368. (In Russ.)

Поступила/Received 26.06.2018 Принята в печать/Accepted31.08.2018

Со списком литературы на русском языке можно ознакомиться на сайте журнала.

Информация об авторах: Красаков Игорь Вячеславович - к.м.н., рук. центра экстрапирамидных заболеваний ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова, асс. каф. нервных болезней ВМедА им. С.М. Кирова;

Литвиненко Игорь Вячеславович - д.м.н., проф., нач. каф. нервных болезней ФГБВОУ ВО ВМедА им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия;

Родионов Геннадий Георгиевич - д.м.н., доц., зав. НИЛ токсикологии и лекарственного мониторинга ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова, Санкт-Петербург, Россия;

Шантырь Игорь Игнатьевич - д.м.н., проф., зав. НИО биоиндикации ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова, Санкт-Петербург, Россия;

Светкина Екатерина Владимировна - н.с. НИЛ токсикологии и лекарственного мониторинга ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова, Санкт-Петербург, Россия

Information about the authors: Igor V. Krasakov, PhD (Med.), Head of Center of extrapyramidal disorders, Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine; assistant, Department of nervous diseases, Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia; Igor V. Litvinenko, D. Sci. (Med.), Prof., Head of Department of nervous diseases, Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia;

Gennadiy G. Rodionov, D. Sci. (Med.), Ass. Prof., Head of Laboratory of toxicology and drug monitoring, Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, St. Petersburg, Russia;

Igor I. Shantyr', D. Sci. (Med.), Prof., Head of Laboratory of bioindication, Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, St. Petersburg, Russia;

Ekaterina V. Svetkina, researcher, Laboratory of toxicology and drug monitoring, Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, St. Petersburg, Russia