CC BY
28
УДК 616.24-002-085.37:612-092.9
Л.С. Бузолева1, А.В. Костюшко2, Н.М. Кондрашова2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
ОЦЕНКА КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ У МЫШЕЙ
Ключевые слова: экспериментальная пневмония, иммуномодуляторы, у-интерферон, интерлейкин-10.
Изучено влияние иммуномодуляторов природного происхождения — лейкинферона и тинростима — на фагоцитарную активность, кислородзависимые механизмы бактери-цидности и локальную продукцию оппозитных цитокинов при экспериментальной стафилококковой и синегнойной пневмонии. Установлено, что собственный эффект лейкинферона выражался в стимуляции кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитов, тогда как тинростим оказывал иммуномодулирующее действие на показатели врожденного иммунитета. Лейкинферон вызывал увеличение уровня у-интерферона, тинростим более выраженно усиливал выработку интерлейкина-10. Праймирующий эффект препаратов in vitro более выражен в модели стафилококковой пневмонии, при этом лейкинферон и тинростим аналогично действовали in vivo на исследуемые показатели. При синегнойной же пневмонии более выраженным противовоспалительным эффектом обладал тинростим.
Изучению патогенеза и проблеме лечения пневмоний уделяется большое внимание как у нас в стране, так и за рубежом [1, 3, 8]. Несмотря на успехи эти-отропной терапии и существенный рост числа антибактериальных препаратов, сохраняется тенденция к увеличению смертности от этого заболевания [10]. Спектр возбудителей нозокомиальной пневмонии характеризуется значительным разнообразием, что затрудняет планирование эмпирической терапии до получения данных микробиологического исследования [1]. Это связано с тем, что, как правило, нозокомиальная пневмония развивается на фоне тяжелой патологии, сопровождающейся серьезными метаболическими, циркуляторными нарушениями и иммунодефицитом [1, 3, 5, 9]. К факторам, усугубляющим проблему, относятся длительное пребывание больного в стационаре и предшествующее применение антибиотиков (с лечебной или профилактической целью). Однако этиология нозокомиальной пневмонии устанавливается менее чем в 50% случаев, что создает трудности в определении тактики целенаправленной антибактериальной терапии [3, 10]. Поэтому благоприятный исход заболевания часто зависит от адекватности патогенетической терапии.
В патогенезе пневмоний существенная роль отводится иммунологической реактивности организма [6]. Иммунопатогенетические механизмы развития пневмоний обусловливают необходимость применения эффективных иммуномодуляторов [4, 5, 7]. В то же время данных о преимущественном назначении
Костюшко Анна Валерьевна — канд. мед. наук, доцент кафедры патологической физиологии ВГМУ; тел.: 8 (4232) 45-07-00; e-mail: [email protected].
того или иного иммунотропного средства в зависимости от этиологического варианта пневмонии недостаточно, что и послужило основанием для изучения влияния иммуномодуляторов природного происхождения — лейкинферона и тинростима — на некоторые показатели врожденного иммунитета при экспериментальной пневмонии.
Материал и методы. Эксперименты выполнены на белых нелинейных мышах массой 18—20 г, находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. В каждой серии экспериментов участвовало по 5 мышей. В исследованиях были использованы патогенные штаммы Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, выделенные из бронхоальвеолярной жидкости больных нозокомиальной пневмонией. Экспериментальную модель получали, интраназаль-но заражая мышей 0,05 мл смыва (на 0,85% растворе NaCl) суточной культуры микроорганизмов в дозе, соответствующей LD50 (1х103 м.т./мл для P. aeruginosa и 1х103 м.т./мл для S. aureus), которую устанавливали по оптическому стандарту мутности (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Развитие пневмонии было подтверждено высевом бактерий из ткани легких. Комплексный препарат цитокинов — лейкинферон — вводили животным пятикратно 1 раз в сутки внутримышечно (по 0,1 мл в дозе 1300 МЕ) и ингаляционно (по 1300 МЕ в 5 мл физраствора). Тинростим, состоящий из комплекса пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, вводили по аналогичной схеме — 0,39 мг/сут. и 0,39 мг в 5 мл физраствора соответственно. Дозы были рассчитаны по формуле пересчета равноэффективных доз фармакологических препаратов для лабораторных животных и человека [2]. Контроль № 1 составили интактные животные, контроль № 2 — мыши, которым в течение 5 дней вводился лейкинферон, контроль № 3 — мыши, которым в течение 5 дней вводился тинростим. Группы «опыт» были сформированы следующим образом: № 1 — заражение мышей культурой S. aureus, № 2 — заражение мышей культурой S. aureus и введение лейкинферона по схеме, № 3 — заражение мышей культурой S. aureus и введение тинростима по схеме, № 4 — заражение мышей культурой P. aeruginosa, № 5 — заражение мышей культурой P. aeruginosa и введение лейкинферона по схеме, № 6 — заражение мышей культурой P. aeruginosa и введение тинростима по схеме. Забор материала для
Таблица
Влияние лейкинферона и тинростима на иммунологические показатели у мышей при экспериментальной пневмонии (М±m).
Группа Показатель
фагоцитарный показатель, % фагоцитарное число HCT-тест, усл. ед.
спонтанный стимулированный лей-кинфероном стимулированный тин-ростимом
Контроль № 1 Интактные мыши б9,4±0,2З 7,3+0,02 0,28+0,07 0,43+0,02 0,31+0,04
Контроль № 2 Лейкинферон 7З,8±0,33 8,2+0,021 0,б3+0,091 0,82+0,04! 0,79+0,031
Контроль № 3 Тинростим 70,4+0,18 7,2+0,032 0,3б+0,0З1, 2 0,55+0,011, 2 0,43+0,072
Опыт № 1 S. aureus 3З,2±0,191 0,51+0,051 0,92+0,081 0,78+0,021
Опыт № 2 S. aureus + лейкинферон б2,7+0,133 З,2+0,041 0,б0+0,041, 3 0,б3+0,031, 3 0,б1+0,041’ 3
Опыт № 3 S. aureus + тинростим 4З,3±0,121, з З,4+0,081 0^4+0,031, З 0,Зб+0,021, 4 0,55+0,021■ 4
Опыт № 4 P. aeruginosa 43,7+0,^ 4,8+0,031 0,37+0,031 0,52+0,02! 0,51+0,011
Опыт № 5 P. aeruginosa + лейкинферон З,4+0,031 0,44+0,021 0,44+0,0Зб 0,42+0,03б
Опыт № 6 P. aeruginosa + тинростим 44,2+0,1б1 5,1+0,051 0,40+0,031 0,42+0,017 0,39+0,0З7
1 Различие с контролем № 1 статистически значимо. 5 Различие с опытом № 2 статистически значимо.
2 Различие с контролем № 2 статистически значимо. 6 Различие с опытами № 4 и 6 статистически значимо.
3 Различие с опытом № 1 статистически значимо. 7 Различие с опытами № 4 и 5 статистически значимо.
4 Различие с опытами № 1 и 2 статистически значимо.
исследования осуществлялся на 7-е сутки эксперимента. Выведение животных из опыта выполнялось с использованием эфирного наркоза. Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали в тесте поглощения частиц полистирольного латекса («Реакомплекс», г. Чита), изучение внутриклеточного кислородзависи-мого метаболизма фагоцитов проводили с использованием теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) спектрофотометрически: оптическую плотность восстановленного диформазана измеряли при длине волны 540 нм. Продукцию цитокинов — у-интерферона (ИФНу) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) исследовали по их уровню в супернатанте гомогенизата легочной ткани иммуноферментным методом с использованием реактивов производства R&D system Inc. Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью пакета SPSS (v16.0) с использованием W-критерия Вилкоксона и U-критерия Манна-Уитни с проверкой нормальности распределения по методу Колмогорова-Смирнова. Критическое значение уровня значимости W-критерия принималось равным 0,062, U-критерия — 0,032: третий уровень достоверности (p<0,05) для численности групп ^=5 и n2=5.
Результаты исследования. Праймирование клеток незараженных мышей лейкинфероном приводило к увеличению интенсивности кислородзависимых механизмов бактерицидности (индекс стимуляции — 1,54±0,01, р<0,05), обработка клеток тинростимом не давала значимых результатов (индекс стимуляции — 1,1±0,03, р>0,05). Влияние лейкинферона и тинростима на функциональную активность фагоцитирующих клеток здоровых животных в сериях проведенных экспериментов нельзя оценить как однозначно стимулирующее. При оценке фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа не выявлено достоверных различий по сравнению с группой интактных мышей, за исключением показателей поглотительной способности фагоцитов под влиянием
лейкинферона в контроле № 2: фагоцитарное число увеличилось на 0,9, р<0,05 (табл.).
Спонтанная способность фагоцитов генерировать активные формы кислорода в этой группе под влиянием лейкинферона увеличилась более чем в два раза при сравнении с группой интактных мышей. Прай-мирование клеток in vitro лейкинфероном приводило к еще большему увеличению продукции нейтрофиль-ными гранулоцитами активных форм кислорода (индекс стимуляции — 1,3±0,01), как и праймирование тинростимом (индекс стимуляции — 1,25±0,04).
Оценка данных в контроле № 3 (введение тин-ростима здоровым животным) дала следующие результаты: показатели фагоцитоза остались практически на уровне интактных мышей, значения спонтанного НСТ-теста увеличились, индекс стимуляции в НСТ-тесте с лейкинфероном был равен 1,53±0,01, в НСТ-тесте с тинростимом — 1,19±0,02.
При экспериментальной пневмонии происходило достоверное снижение функциональной активности и поглотительной способности фагоцитирующих клеток. При этом фагоцитарный показатель при заражении мышей S. aureus (опыт № 1) на 7-е сутки эксперимента был ниже, чем при заражении P. aeruginosa (опыт № 4), тогда как количество поглощенных частиц латекса фагоцитом не зависело от этиологии экспериментальной пневмонии. В ходе исследования выявлено, что P. aeruginosa оказывал менее выраженное влияние на активацию гексозомонофосфатного шунта, чем S. aureus. Так, показатели спонтанного НСТ-теста при стафилококковой пневмонии увеличивались на 0,23 усл. ед., а при пневмонии, вызванной P. aeruginosa, — на 0,09 усл. ед. по сравнению с группой интактных мышей (контроль № 1). В условиях in vitro клетки мышей с пневмонией в обеих группах сравнения достаточно активно генерировали кислородный взрыв под воздействием лейкинферона и менее выраженно — под воздействием тинростима (табл.).
Рис. Уровни ИФНу и ИЛ-10 в супернатанте легочной ткани при пневмонии у мышей на фоне введения иммуномодуляторов.
Серия экспериментов с введением иммуномодуляторов при одновременном заражении животных дала следующие результаты. На фоне действия лей-кинферона у мышей, зараженных S. aureus, фагоцитарная способность нейтрофилов увеличилась на 27,5%, однако их поглотительная способность через 7 суток после заражения осталась практически неизменной. Показатель спонтанного НСТ-теста у мышей данной опытной группы достоверно не увеличился, дополнительная обработка клеток лейкинфероном и тинростимом также не приводила к увеличению кис-лородзависимой микробицидной способности фагоцитов. Эффект тинростима при стафилококковой пневмонии выражался в увеличении фагоцитарного показателя на 10,1%. Однако показатели спонтанного НСТ-теста были практически на уровне таковых у нелеченной группы мышей, зараженных S. aureus, и фагоциты почти не реагировали на стимуляцию иммуномодуляторами in vitro (табл.).
Введение лейкинферона при одновременном инфицировании P. aeruginosa (опыт № 5) приводило к незначительному увеличению значений спонтанного НСТ-теста (на 0,07 усл. ед.). При использовании тинростима в этой серии экспериментов (опыт № 6) спонтанный НСТ-тест увеличивался на 0,03 усл. ед. Анализ показателей стимулированного теста в группе мышей с пневмонией, вызванной P. aeruginosa, показал, что in vitro на 7-е сутки эксперимента клетки не были способны к дополнительной генерации активных форм кислорода ни под воздействием лейкинфе-рона, ни под воздействием тинростима (табл.). Это свидетельствовало об истощении резервных возможностей фагоцитов в данных опытных группах.
Исследование цитокинов в супернатанте гомоге-низата легочной ткани выявило незначительное превалирование содержания цитокинов Т-хелперного 2-го типа над цитокинами Т-хелперного 1-го типа у
здоровых животных (ИЛ-10 — 85,03+5,08, ИФНу — 74,33+6,7 пг/мл). Снижение провоспалительной активности цитокинов было зарегистрировано в группах мышей, получавших тинростим: уровень ИФНу в этой серии экспериментов составил 47,94+2,35 пг/мл. Согласно результатам исследований, лей-кинферон оказывал значительное стимулирующее воздействие на локальную продукцию легочными иммуноцитами ИФНу, уровень которого поднимался до 147,9+19,61 пг/мл, что достоверно отличалось от показателей в других исследуемых группах. Противовоспалительный эффект тинростима был значительно выше, чем у лейкинферона, и составил 313,68±11,93 пг/мл против 132,05+5,62 пг/мл соответственно, р<0,05 (рис.).
При заражении мышей S. aureus локальные уровни ИФНу и ИЛ-10 изменялись недостоверно. Развитие пневмонии, ассоциированной с P. aeruginosa, сопровождалось достоверным уменьшением содержания ИФНу на 33,6 пг/мл и увеличением содержания ИЛ-10 на 54,5 пг/мл.
При исследовании локального цитокинового профиля на 7-е сутки после заражения мышей S. aureus и введения лейкинферона (опыт № 2) было зарегистрировано достоверное увеличение уровней как ИФНу (134,13±5,45 пг/мл), так и ИЛ-10 (241,73±11,45 пг/мл). Стимулирующий эффект был значительно выше у мышей с синегнойной пневмонией: уровень ИФНу увеличился на 99,08 пг/мл по сравнению с показателями опыта № 4 и равнялся 139,78 + 14,4 пг/мл. Уровень ИЛ-10, напротив, при введении лейкинферона мышам с пневмонией, вызванной P. aeruginosa, недостоверно снизился — с 139,49+23,10 до 112,14+10,29 пг/мл (рис).
Сравнительная характеристика действия тин-ростима на локальную выработку цитокинов показала, что при стафилококковой пневмонии тин-ростим увеличивает продукцию ИФНу на 90,6 пг/ мл, практически не оказывая влияния на продукцию ИФНу при синегнойной пневмонии. Таким образом, собственный эффект тинростима у здоровых мышей, выражающийся в снижении содержания ИФНу, проявился неожиданно высоким увеличением продукции ИФНу на фоне стафилококковой пневмонии, что превосходило аналогичный эффект лейкинферона (рис.). Противовоспалительное действие тинростима было стабильно высоким как при исследовании собственного эффекта препарата, так и при действии в группах животных с пневмонией (рис.). Так, уровень ИЛ-10 под влиянием тинрости-ма у мышей с пневмонией, вызванной S. aureus, увеличился на 221,9 пг/мл, а при пневмонии, ассоциированной с P. aeruginosa, — на 93,77 пг/мл.
Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного иммунологического исследования свидетельствуют о том, что собственный эффект лейкин-ферона выражается в стимуляции кислородзависи-мых механизмов бактерицидности фагоцитирующих
клеток, в то время как тинростим оказывает иммуномодулирующий эффект на показатели врожденного иммунитета у здоровых животных. Лейкинферон вызывает увеличение уровня провоспалительного цито-кина ИФНу, тинростим более выраженно усиливает выработку ИЛ-10.
Активация факторов врожденного и адаптивного иммунитета имеет свои отличия в зависимости от этиологии воспаления в легких. Эксперимент дает возможность оценить собственный эффект бактерий на развитие пневмонии. Так, в модели экспериментальной стафилококковой пневмонии показатели спонтанного НСТ-теста были статистически значимо выше, чем при экспериментальной синегнойной пневмонии. Праймирующий эффект исследованных иммунотропных препаратов на клетки больных мышей in vitro был выше в модели стафилококковой, чем синегнойной пневмонии. У экспериментальных животных с пневмонией, вызванной S. aureus, активация микробицидной активности in vitro под воздействием лейкинферона была выше, чем при воздействии тинростима. Аналогичные результаты получены и в опытах заражения мышей P. aeruginosa: индекс стимуляции лейкинфероном был выше, чем индекс стимуляции тинростимом. S. aureus не вызывал выраженных изменений в продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками легких на 7-е сутки эксперимента. При экспериментальной пневмонии, вызванной P. aeruginosa, локальный уровень ИЛ-10 в легких преобладал, что указывает на развитие Т-хел-перного иммунного ответа 2-го типа.
Исследование иммуномодулирующего действия препаратов in vivo на фоне бактериальной пневмонии позволило констатировать, что при развитии воспаления, вызванного S. aureus, уровень ИФНу увеличивался под воздействием обоих иммуномодуляторов. При пневмонии, вызванной P. aeruginosa, уровень ИФНу увеличивал только лейкинферон. Противоспалительный эффект в виде роста уровня ИЛ-10 при синегнойной пневмонии был зафиксирован только в отношении тинростима. При введении лейкинферона на фоне пневмонии, ассоциированной с P. aeruginosa, происходило снижение уровня ИЛ-10, то есть при экспериментальной пневмонии, вызванной P. aeruginosa, лейкинферон менял тип Т-хелперного иммунного ответа со 2-го на 1-й тип, что, возможно, оказывало влияние на стимуляцию иммуноцитов, удлиняло фазу действия провоспали-тельных медиаторов и увеличивало рекрутирование новых клеток в очаг воспаления.
Таким образом, при экспериментальной стафилококковой пневмонии выявлено аналогичное действие лейкинферона и тинростима на показатели фагоцитарной активности и оппозитных цитокинов, тогда как при синегнойной пневмонии тинростим обладал более выраженным противовоспалительным эффектом.
Литература
1. Белобородов В.Б. Проблемы профилактики и эмпирической антибактериальной терапии нозокомиальной пневмонии, связанной с проведением искусственной вентиляции легких. // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. Т.4, № 4. С.108—113.
2. Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. Челябинск: Изд-во ЧГПУ, 2000. 168 с.
3. Домникова Н.П., Сидорова Л.Д., Непомнящих Г.И. Внутрибольничные пневмонии: патоморфогенез, особенности клиники и терапии, критерии прогноза. М.: Изд-во РАМН, 2003. 288 с.
4. Кузнецов В.П., Маркелова Е.В., Силич Е.В., Беляев Д.Л. Динамика цитокинов и роль иммунокоррекции при нозокомиальной пневмонии. // Российский иммунологический журнал. 2002. Т. 7, № 2. С.Ш-160.
5. Маркелова Е.В. Система цитокинов у больных с острыми повреждениями легких и клинико-иммунологическое обоснование терапии лейкинфероном: дис. ... д-ра мед. наук. Владивосток, 2000. 338 с.
6. Система цитокинов и болезни органов дыхания. / Гельцер Б.И., Просекова Е.В., Маркелова Е.В. и др. Владивосток: Дальнаука, 2005. 256 с.
7. Швыдченко И.Н., Нестеров И.В., Синельникова Е.Ю. Ци-токинсекретирующая функция нейтрофильных грануло-цитов // Иммунология. 2005. № 1. С. 31—33.
8. Holmes M.C., Zhang P., Nelson S. et all. Neutrophil modulation of the pulmonary chemokine response to lipopolysaccaride. // Shock. 2002. Vol. 18. P. 555-560.
9. Manderscheid P.A., Bodkin R.P., Davidson B.A. Bacterial clearance and cytokine profiles in a murine model of postsurgi-cal nosokomial pneumonia. // Clinical and diagnostic laboratory immunology. 2004. Vol.11, 4. P. 742-751.
10. Vinsent J. Nosocomial infections in adult intensive-care units. // Lancet. 2003. Vol. 361. P. 2068-2077.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
ESTIMATING CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL EFFICIENCY OF PLANT IMMUNE-RESPONSE MODULATING AGENTS IN CASE OF EXPERIMENTAL MOUSE PNEUMONIA
L.S. Buzoleva1, A.V. Kostyushko2, N.M. Kondrashova2 1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia), 2 Vladivostok State Medical University (2 Ostryakov Av. Vladivostok 690950 Russia)
Summary — The authors have studied effects produced by plant immune-response modulating agents — leukinferon and tinrostim — on the phagocytic activity, oxygen-dependent mechanisms of bactericidal action and local production of opposite cytokines in case of experimental staphylococcal and pseudomonas pneumonias. As shown, intrinsic leukin-feron effects were produced when stimulating oxygen-dependent mechanisms for the bactericidal activity of phagocytes; tinrostim induced immune response with respect to innate immunity. Leukinferon caused increasing y-interferon; tinrostim more evidently intensified interleukin-10 production. The staphylococcal pneumonia model showed priming effect of the medications in vitro. The leukinferon and tinrostim produced similar effects on the parameters under study in vivo. In case of pseudomonas pneumonia, the most evident anti-inflammatory effects were peculiar to the tinrostim.
Key words: cytokines, experimental pneumonia, immune-response modulating agents.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 58—61.
