CC BY
66
УДК 57.033 ББК 28.04
ОЦЕНКА КИНЕТИКИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ФГА-СТИМУЛИРОВАННЫХ IN VITRO ЛИМФОЦИТОВ У ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧЕННЫХ ЛЮДЕЙ
А.С. СОКОЛОВА, ФГБОУВО ЧелГУ, г. Челябинск, Россия e-mail: fsokol@mail. ru Ю.Р. АХМАДУЛЛИНА, ФГБОУ ВО ЧелГУ, г. Челябинск, Россия
Аннотация
В статье представлены результаты оценки пролиферативного индекса ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови у людей, которые были подвержены хроническому облучению вследствие проживания на прибрежных территориях р. Теча в период с 1949 - 1956 гг. Установлено, что у облученных лиц пролиферативный индекс был статистически значимо выше, чем в контрольной группе. Также показана отрицательная корреляционная связь между возрастом исследуемых лиц и скоростью пролиферации лимфоцитов in vitro.
Ключевые слова: лимфоциты периферической крови, пролиферативный индекс, ионизирующая радиация, облученные люди.
Актуальность. На сегодняшний день актуальными являются исследования клеточных эффектов хронического радиационного воздействия в отдаленный период наблюдения. Необходимым условием деления,
дифференцировки и функционирования различных клеток организма является поддержание стабильности генетического материала. О нестабильности генома клеток могут свидетельствовать цитогенетические изменения, нарушение экспрессии генов, повышенная частота апоптоза и др. [3, 4, 5]. По скорости пролиферации клеток также можно судить об изменениях в геноме. Так изменение скорости пролиферации ФГА-стимулированных лимфоцитов может быть следствием нарушения работы генов, ответственных за контроль клеточного цикла [6, 8, 9]. В связи с изложенным, целью данного исследования являлась оценка скорости пролиферации ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов
периферической крови у хронически облученных людей путем расчета пролиферативного индекса (ПИ).
Материалы и методы. Для исследования было сформировано 3 группы людей: 1 группа облученных лиц, которую составили жители прибрежных сел реки Течи, подвергшиеся хроническому низкоинтенсивному облучению в 1949-1956 гг. Причиной массового облучения послужило загрязнение реки сточными водами, содержащими радиоактивные отходы производственного объединения "Маяк".
Основными источниками внешнего у-облучения являлись донные отложения и пойменные почвы. Основными источниками внутреннего облучения населения в первые годы являлись 90Sr, 89Sr, 137Cs и другие изотопы, поступившие в организм с речной водой и продуктами местного производства (молоко, рыба, овощи с поливных огородов и т.п.). Основным дозообразующим радионуклидом после проведения защитных мероприятий являлся 90Sr, из-за его способности накапливается и длительное время удерживаться в костной ткани [1, 2]. 2 контрольную группу составили жители Челябинской области, которые не подвергались аварийному облучению и проживали в сходных социо-экономических условиях с группой облученных лиц. 3 группу составили разновозрастные потомки облученного на р. Теча населения. Данная группа была сформирована с целью оценки влияния возрастного фактора на ПИ.
Характеристика обследуемых групп приведена в таблице 1. Для облученных людей представлена средняя накопленная доза на красный костный мозг (ККМ).
Объектом исследования являлись ФГА-стимулированные Т-лимфоциты
периферической крови. Кровь забирали у пациентов (доноров) из вены в объеме 6 мл.
ФГА (фитогеммагглютинин) является бласттрансформирующим агентом, который in vitro стимулирует к делению Т-лимфоциты периферической крови.
Таблица 1
Характеристика исследуемых групп_
Группа N Возраст, лет (min - max) Пол, % Доза на ККМ, Гр (min - max)
мужчины женщины
Облученные люди 27 71,2±0,9 (63-80) 33,3 66,7 1,8±0,3 (0,1-4,7)
Контроль 9 73,2±2,5 (60-84) 45,5 55,5 0
Потомки 18 49,0±2,6 (24-64) 38,9 61,1 0
Примечание: N - количество человек в группе
Для приготовления клеточной суспензии использовалась цельная венозная кровь с гепарином, которую помещали в культуральную среду, содержащую 3 мл среды RPMI, на 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки крови и 50 мкл ФГА. Инкубация проходила при температуре 37°С. Через 48 часов от начала инкубации в пробы добавляли 70 мкл рабочего раствора цитохалазина Б в DMSO. Рабочий раствор цитохалазина готовился заранее: 1мг цитохалазина Б растворили в 0,3 мл DMSO. В момент опыта этот раствор разводился в 10 раз средой. Пробы помещали в термостат. Через 24 часа после этого клетки фиксировали с помощью этанола и уксусной кислоты. Затем готовили препараты и окрашивали их красителем по Романовскому-Гимза [1].
Далее с помощью световой микроскопии, осуществляли подсчет клеток с различным числом ядер (от 1 до 6) на 1000 посчитанных клеток.
Число ядер в клетках свидетельствует о скорости пролиферации лимфоцитов in vitro. Основную часть пролиферативного пула на момент фиксации культуры составляли двуядерные клетки, которые прошли один митоз за время культивирования. Однако нередко встречались одноядерные лимфоциты (замедленно пролиферирующие) и полиядерные клетки (с тремя и более ядрами), прошедшие несколько циклов деления, что говорит об их ускоренной пролиферации. Более того, наличие лимфоцитов с нечетным количеством ядер -результат асимметричного деления, то есть явления, при котором на митогенный сигнал реагируют не все ядра. По литературным данным ассиметричное деление является признаком нестабильности генома [6]. Для расчета ПИ была использована следующая формула:
(1 * %М1) + (2 * %М2) + (3 * %М3)
ПИ =
100
где Ml - частота клеток с замедленной пролиферацией (одноядерные лимфоциты), M2 -частота клеток с нормальной пролиферацией (двуядерные лимфоциты), Mз - частота
ускоренно делящихся клеток (сумма 3-, 4- и 5-ядерных лимфоцитов).
Распределение индивидуумов во всех исследуемых группах по пролиферативному индексу, частоте одно-, двух-, трех-, пятиядерных и ускоренно делящимся клеткам являлось нормальным, поэтому для описания исследуемых показателей использовали среднее (S) и стандартную ошибку среднего (SE). Для сравнения всех перечисленных показателей между исследуемыми группами использовался t-критерий Стьюдента. Связь между накопленной дозой на ККМ и ПИ определяли с помощью корреляции по Пирсону. Тем же способом определяли связь между возрастом и ПИ. Для статистической обработки полученных данных использовали программные пакеты Excel 2010, SPSS Statistics 21, SigmaPlot 12,5.
Результаты и обсуждение. При сравнении частоты одноядерных лимфоцитов в группе облученных лиц и в контрольной группе были выявлены статистически значимые различия: 26,0±2,2% против 42,3±5,8% соответственно, при р=0,035 (табл. 2).
Средний уровень одноядерных клеток у потомков составил 21,4±2,2%, что статистически не отличается от показателя в группе облученных людей.
В группе облученных лиц средний уровень двуядерных лимфоцитов составил 60,0±2,1%, в контроле данный показатель равен 50,1±4,2%. В группе потомков средний уровень двуядерных клеток составил 60,6±2,0% (46,1-75,7%). Статистически значимых различий по этому показателю выявлено не было.
В группе облученных людей было выявлено, что средний уровень ускоренно делящихся клеток выше, чем в контрольной группе: 14,2±1,5% против 7,5±2,1% соответственно, при р=0,012. У потомков средний уровень ускоренно делящихся клеток составил 18,0±3,0% (2,641,6%), что статистически не отличается от группы облученных лиц.
При изучении уровня лимфоцитов с асимметричным количеством ядер было отмечено, что у облученных лиц повышена
частота лимфоцитов с тремя ядрами относительно контрольной группы, р = 0,026. Так у облученных людей средняя частота клеток с тремя ядрами составила 6,3±0,8%, а в контрольной группе этот показатель достигал уровня 3,1±1,0%.
Таблица 2
Средние частоты клеток с разным количеством ядер, S±SE (min - max), %.
Пролиферативный индекс у облученных лиц составил 1,90±0,03 (1,39-2,13), что статистически значимо выше (р=0,02), чем в контрольной группе: 1,70±0,08 (1,43-2,09). В группе потомков средний показатель пролиферативного индекса составил 2,00±0,05 (1,69-2,35%) что статистически не отличается от группы облученных людей (табл. 3).
Таким образом в группе облученных людей наблюдалась достоверно повышенная частота ускоренно пролиферирующих лимфоцитов (р=0,012) и пониженная частота замедленно пролиферирующих клеток (р=0,035) по сравнению с контролем. Кроме этого у
облученных лиц была отмечена повышенная частота асимметрично делящихся
(трехъядерных) клеток.
Асимметричное деление и ускоренная пролиферация могут свидетельствовать о несвязной работе белков, обеспечивающих деление. Все эти факторы можно отнести к результатам отдаленных последствий хронического воздействия ионизирующего излучения [10]. Аналогичные результаты были получены в работе [Маркиной Т.Н. 2011], в которой пролиферативная активность лимфоцитов оценивалась по уровню экспрессии гена белка Кь67. В данном исследовании было выявлено, что в группе облученных на р. Теча лиц статистически достоверно увеличено число пролиферирующих лимфоцитов в
периферической крови [7].
Продолжительность клеточного цикла индивидуальна для каждой клетки, но в целом зависит от возраста донора, его образа жизни, индивидуальных физиологических
особенностей [6].
Нами была проанализирована зависимость ПИ от дозы облучения ККМ - статистически значимых корреляций выявлено не было (Р=0,047).
При исследовании влияния возрастного фактора на ПИ была выявлена отрицательная корреляционная связь: чем старше индивидуум, тем ниже показатель ПИ (рис.1). Такая закономерность согласуется с литературными данными. В доступной литературе описано, что у детей наблюдается высокая частота полиядерных клеток, в то время как у пожилых этот показатель снижается. Такие изменения авторы связывают с увеличением продолжительности клеточного цикла с возрастом [6].
г=-0,320 р=0,018
95%
доверительный интервал
Прогнозируемый интервал значений при увеличении выборки
С 20 40 60 90
Возраст, лет
Рис. 1. Корреляционная связь между возрастом и ПИ
Частота клеток Облученные Люди Контроль Потомки
одноядерные клетки 26,0±2,2* (12,8 - 64,4) 42.3±5.8 (10,5 -60,1) 21.4±2.2 (6,4 -35,8)
двуядерные клетки 60,0±2,1 (31,8 - 76,8) 50,1±4.2 (37,1 -70,1) 60,6±2,0 (46,1 -75,7)
полиядерные клетки 14,2±1,5** (3,0 - 36,2) 7,5±2,1 (0,2 -19,4) 18,0±3.0 (2,6 -41,6)
трехъядерные клетки 6,3±0,8*** (1,2 - 19,8) 3,1±1,0 (0,2 - 8,6) 7,8±1,4 (1,1 -19,6)
пятиядерные клетки 0,10±0,03 (0 - 0,80) 0,05±0.03 (0 - 0,2) 0,10±0.04 (0 - 0,5)
Примечание * - статистически значимые различия при сравнении с контрольной группой, при р=0,035; ** -статистически значимые различия при сравнении с контрольной группой, при р=0,012; *** - статистически значимые различия при сравнении с контрольной группой, при р=0,026
Таблица 3
Показатели пролиферативного индекса в исследуемых группах, S±SE (min - max)_
Показатель )блученные 1юди Сонтроль !отомки
Пролиферативный индекс ,90±0,03* 1,39 - 2,13) ,70±0,08 1,43 - ( ,09) 2 !,00±0,05 1,69 -,35)
Примечание * - статистически значимые различия при сравнении с контрольной группой, при р=0,02
Выводы 1. В группе облученных
людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча (средняя доза на ККМ составила 1,8±0,3 Гр), было отмечено статистически значимое увеличение пролиферативного индекса стимулированных лимфоцитов периферической крови по сравнению с показателем в контрольной группе. При этом в группе облученных лиц частота замедленно пролиферирующих лимфоцитов была статистически значимо ниже, а частота
ускоренно пролиферирующих клеток была статистически значимо выше по сравнению с группой контроля.
2. Не выявлено зависимости пролиферативного индекса от суммарной дозы облучения в исследуемом диапазоне доз от 0,1 до 4,7 Гр на ККМ.
3. Было выявлено, что пролиферативный индекс отрицательно коррелирует с возрастом индивидуумов: чем старше индивидуум, тем ниже его пролиферативный индекс.
Список литературы
1. Ахмадуллина Ю.Р. Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию: дис. канд. биол. наук /Ю.Р. Ахмадуллина. - М., 2014. - 134 с.
2. Дегтева М.О. Реконструкция дозы у населения, облучившегося вследствие сбросов радиоактивных отходов в реку Течу / М.О. Дегтева, В.П. Кожеуров, М.И. Воробьева //Атомная энергия. - 1992. - Т.72. - № 4. - С. 386-389
3. Донов П.Н. Связь полиморфизмов генов цитокинов, оксиадаптивного ответа, клеточного цикла и репарации с хромосомными аберрациями у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча / П.Н. Донов, П.В Уржумов., Е.А. Блинова и др. //Вопросы радиационной безопасности. - 2014. - №3. - С. 61-68
4. Дружинин В.Г. Роль полиморфизма генов репарации в оценке чувствительности генома человека к воздействию сверхнормативных концентраций радона /В.Г. Дружинин //Гигиена и санитария. - 2011. - №5. - С. 26-30
5. Засухина Г.Д. Механизмы устойчивости клеток человека к мутагенам / Г.Д. Засухина // Успехи современной биологии. - 2011. - Т. 131, N 3. - С. 244-259
6. Ингель Ф.И. Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах периферической крови человека, культивируемых в условии цитокинетического блока / Ф.И. Ингель // Экологическая генетика. - 2006. Т. 4, №3. - С. 719
7. Маркина Т.Н. Пролиферативная активность и задержка клеточного цикла лимфоцитов крови человека в отдаленные сроки хронического облучения: автореф. дис. ... канд. биол. наук/ Т.Н. Маркина. -М., 2011. - 154 с.
8. Kirsch-Volders M. Inclusion of micronuclei in non-divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for biomonitoring purposes / M. Kirsch-Volders, M. Fenech // Mutagenesis. - 2000. - P. 51-58
9. Pernot E. Ionizing radiation biomarkers for potential use in epidemiological studies. / E. Pernota, J. Hall, S. Baatout et al. // Elsevier. - 2012. - P. 258-286
10. Rosefort C. Micronuclei induced by aneugens and clastogens in mononucleate and binucleate cells using the cytokinesis block assay / С. Rosefort, E. Fauth, H. Zankl //Mutagenesis. - 2004. - Р. 277-284
EVALUATION OF THE PROLIFERATION KINETICS OF PHA-STIMULATED LYMPHOCYTES OF CHRONICALLY EXPOSED INDIVIDUALS
A.S. SOKOLOVA, ChelSU, Chelyabinsk, Russia e-mail: [email protected] Y.R. AKHMADULLINA, ChelSU, Chelyabinsk, Russia
Abstract
The kinetics of proliferation of PGA-stimulated T- lymphocytes of people who have been exposed to chronic radiation exposure is studied. It was revealed that the irradiated persons proliferative index was significantly higher than the control group. As well reduction of cell division rate with age of the individuals under research was detected.
Keywords: peripheral blood lymphocytes, proliferative index, ionizing radiation, irradiated people.
