Оценка капсулирования и высвобождения белка из микрочастиц, содержащих фукоидан в условиях введения ПАВ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 615.322

DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-3-92-98

ОЦЕНКА КАПСУЛИРОВАНИЯ И ВЫСВОБОЖДЕНИЯ БЕЛКА ИЗ МИКРОЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ ФУКОИДАН В УСЛОВИЯХ ВВЕДЕНИЯ ПАВ

© В.Е. Супрунчук, Е.В. Денисова, С.Ф. Андрусенко, Т.П. Бондарь

Северо-Кавказский федеральный университет,

355009, Российская Федерация, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1

Исследована возможность формирования микрочастиц с применением высокосульфатированного полисахарида, выделенного из бурых водорослей - фукоидана и белка - бычьего сывороточного альбумина в условия введения акрилатной эмульсии с применением неионогенного поверхностно активного вещества. Формирование полисахарид/белковых конъюгатов осуществлялось за счет сил электростатического взаимодействия между биополимерами при их различном соотношении в кислой среде (рН 4,5), после чего вводили неионногеный кремнийорганический эмульгатор ПЭГ-12 диметикон. В качестве носителя таких частиц был использован гель на основе акрилатной эмульсии. Микрочастицы показали высокую стабильность, эффективность загрузки и степень инкапсуляции. Выявлена зависимость данных показателей от количественного соотношения используемых биополимеров. Исследование размера частиц показало, что диаметр частиц не превышает 330 нм. Самые низкие показатели диаметра были установлены при применении малоконцентрированного раствора фукоидана. Определено, что наибольшей инкапсулирующей способностью обладали частицы с соотношением белок/полисахарид 1:1,5 со средним размером 285 нм. Ключевые слова: бычий сывороточный альбумин (БСА), фукоидан, фукоидан/БСА конъюгаты, эмульгатор ПЭГ-12 диметикон, оценка капсулирования.

Формат цитирования. Супрунчук В.Е., Денисова Е.В., Андрусенко С.Ф., Бондарь Т.П. Оценка капсулирования и высвобождения белка из микрочастиц, содержащих фукоидан в условиях введения ПАВ // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8, N 3. C. 92-98. DOI: 10.21285/2227-29252018-8-3-92-98

ASSESSMENT OF PROTEIN ENCAPSULATION AND ISOLATION FROM MICROPARTICLES CONTAINING FUCOIDAN UNDER THE ACTION OF SURFACTANTS

© V.E. Suprunchuk, E.V. Denisova, S.F. Andrusenko, T.P. Bondar

North Caucasian Federal University,

1, Pushkin St., 355009, Stavropol, Russian Federation

In this work, we investigate the process of microparticle formation using highly-sulphated polysaccharides isolated from brown algae (Fucoidan) and protein (bovine serum albumin) under the action of acrylate emulsion and non-ionic surfactants. Polysaccharide/protein conjugates were formed as a result of electrostatic interaction between the biopolymers at their different ratios in an acidic medium (pH 4,5). Subsequently, the non-ionic silicone emulsifier PEG-12 Dimethicone was added. A gel based on acrylate emulsion was used as the carrier of such particles. The microparticles obtained are shown to exhibit high levels of stability, load efficiency and encapsulation. A dependence between these parameters and the quantitative ratio of the biopolymers used is established. It is shown that the particle size does not exceed 330 nm. The lowest particle size values were achieved under the action of a low-concentrated Fucoidan solution. It is determined that particles with a 1:1,5 ratio of protein/polysaccharide and an average size of 285 nm show the greatest encapsulating ability. Keywords: bovine serum albumin (BSA), fucoidan, fucoidan/BSA conjugates, PEG-12 emulsifier dimitikon, assessment of encapsulation

For citation: Suprunchuk V.E., Denisova E.V., Andrusenko S.F., Bondar T.P. Assessment of protein encapsulation and isolation from micro-particles containing fucoidan under the action of surfactants. Izvestiya Vuzov.

Prikladnaya Khimiya. [Proceedings of Universitets. Applied Chemistry and Biotechnology. 2018, vol. 8, no. 3, pp. 92-98. (in Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-3-92-98

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы все большее внимание уделяется проблеме создания микро- и нано-частиц с использованием природных полимеров, применяемых для доставки БАВ. Интерес к природным полимерам обусловлен тем, что они не токсичны, не вызывают аллергических реакций, продукты их распада не накапливаются в организме и могут выводится из него или участвовать в дальнейшем метаболизме. Биополимеры эффективно взаимодействуют с клетками, что способствует повышению продуктивности их действия. Кроме того, полиэлектролиты природного происхождения обладают реакционно-способными функциональными группами, легко вступающими в химические реакции.

Особый интерес представляет фукоидан, являющийся высокосульфатированным, водорастворимым, обычно разветвленным гетеропо-лисахаридом, где основным моносахаридным остатком выступает L-фукоза [1], и имеющий широкий спектр биологической активности.

БСА/фукоидановые конъюгаты могут быть сформированы, во-первых, путем электростатического взаимодействие между отрицательно заряженным полисахаридом и положительно заряженным белком. Полнота образования комплексов, их растворимость зависит от рН, ионной силы среды, соотношения белок/полисахарид [2]. Известны системы доставки БАВ, основанные на применении фосфолипидов, определяемых как липосомы. Однако, как известно, сами фосфоли-пиды быстро окисляются, а формирование липо-сом требует значительных затрат энергии [3, 4].

Применение же синтетических эмульгаторов для создания различных систем доставки позволит снизить эти показатели. Зачастую используют такие поверхностно-активные вещества как Азол-129 (алкилдиметилбензиламмо-ний хлорид), цетиловый спирт [5], 12-акрил-окси-9-октадеценова кислота и т.д. Кемала с соавторами [6] при формировании синтетических микрочастиц в качестве эмульгатора использовали поливиниловый спирт, что позволило получить стабильные во времени частицы

со средним диаметром 70 мкм.

В работе [2] установлено, что димети-консшитые эмульгаторы безопасны в применении, не вызывают генотоксичность, раздражение и сенсибилизацию. Макромолекулы ПАВ в физиологических условиях химически инертны [7] и имеют гидрофобную и гидрофильную часть. Микрочастицы, полученные с применением ПЭГ-12 диметикона, могут иметь несколько слоев, обладают хорошей воспроизводимостью и стабильностью в отношении полярных растворителей.

Синтетические полимеры являются весьма полезными в биомедицинском приложении благодаря их механическим характеристикам [1].

Цель работы - формирование и исследование микрочастиц с использованием природного полимера на основе неионогенного ПАВ эмульгатора ПЭГ-12 диметикона, применимых для иммобилизации белка. В качестве носителя для полученных микрочастиц был сформирован гель на основе акрилатной эмульсии, пространственная структура которого позволяет удерживать микрочастицы во взвешенном состоянии, сохраняя их целостность. Гелеоб-разователь совместим с широким рядом активных фармацевтических субстанций, достаточно удобен в использовании в виду своей эмульгированной формы, позволяющей быстро получать прозрачный гель.

Таким образом, в данной работе первоначально определялась возможность формирования частиц на основе фукоидана. Осуществлялось определение степени загрузки и эффективности инкапсуляции белка на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и включение полученных частиц в структуру прозрачного геля.

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приготовление БСА/фукоидановых конъ-югатов осуществлялось при перемешивании на магнитной мешалке (500 об/мин) раствора 1,5% полисахарида в 1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,4 с постепенным внесением раствора БСА (1 мг/мл) в различном стехиометри-ческом соотношении (табл. 1).

Таблица 1 Table 1

Состав и код микрочастиц

Composition and code of microparticles

Код Концентрация компонентов Размер (нм)

Фукоидан (%) БСА (мг/мл)

A1 0,5 1 190 ± 2,4

A2 1,0 1 298 ± 1,2

A3 1,5 1 275 ± 0,8

A4 2,0 1 242 ± 1,1

А5 2,5 1 330 ± 1,3

После внесения необходимого количества БСА осуществлялось понижение рН системы с помощью 0,1 н. HCl до 4,5. Высушенные образцы коньюгатов диспергировали в воде и при постоянном перемешивании вносили ПЭГ-12 димети-кон при комнатной температуре. Перемешивание осуществляли в течение 15 мин, обрабатывали ультразвуком (40 кГц, 60 мин), промывали.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ) и степень загрузки (СЗ) полученных частиц определяли спектрофотометрически по методу Бредфор-да при длине волны 595 нм. Эффективность инкапсуляции определяли по отношению значения массы белка в микрочастицах к массе исходного белка, а степень загрузки - к массе микрочастиц по следующим формулам (1, 2) [8]:

_ всего белка—высвобожденного белка

всего белка

всего белка—высвобожденного белка

СЗ% =

масса микрочастиц

100% (2)

Для определения выпуска белка in vitro использовали фосфатно-солевой буфер с различным значением рН (7,0; 7,4 и 9,1) [12]. Определение белка так же осуществляли спек-

трофотометрически по методу Бредфорда при длине волны 595 нм. Степень высвобождения определяли по формуле (3) [9]:

Выпуск _ колличество выпущенного белка белка % всего белка

100% (3)

Включение частиц в гель осуществляли путем внесения акрилатной эмульсии при перемешивании и повышении рН системы до 8,8. Для установки степень набухания (СН) образцы гелей выдерживали в ФСБ рН 7,4, извлекали, избыток буфера удаляли фильтровальной бумагой, взвешивали. Расчет осуществляли по формуле (4):

СН = • 100

Wwet

(4)

Затем образцы центрифугировали (3500*д, 10 мин), предварительно на дно пробирок помещали фильтровальную бумагу. Пробы взвешивали Измерения проводили трижды. Степень удержания воды (УВ) определяли по формуле (5) [10]:

УВ = HW-^ry . 100 Wrfry

(5)

Рис. 1. Этапы формирования микрочастиц Fig. 1. Stages of formation of microparticles

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

БСА/фукоидановые микрочастицы были получены путем электростатического взаимодействия положительно заряженного белка и отрицательно заряженного полисахарида, эмульгированием в присутствии ПЭГ-12 с последующим включением в гелевую структуру с помощью акрилатной эмульсии (рис. 1).

Полисахарид является слабым полиэлектролитом и степень его диссоциации сильно зависит от рН среды. Известно, что раствор фукоидана имеет максимальный отрицательный заряд при рН 7, поэтому готовили раствор полисахарида с соответствующим рН. В работе [2] установлено, что самосборка белка и полисахарида с образованием комплекса БСА/фукоидан осуществляется при рН 4,5. Обработка ультразвуком осуществлялась для уменьшения размера полученных частиц и сведению к минимуму их агрегации.

Эффективность инкапсулирования и степень загрузки частицами находится в зависимости от концентрации фукоидана (рис.2). Самые высокие показатели эффективности загрузки и

инкапсулирующей способности наблюдались для А3 (с соотношением белок/полисахарид 1:1,5), поэтому именно эта система была использована для дальнейшего исследования. Наибольшей загрузочной способностью обладает образец А5.

Для определения влияния рН на высвобождение белка были использованы частицы с соотношением БСА/фукоидан (1:1,5) и проведены измерения при рН в диапазоне 7 < рН < 9,1. Из рис.2 видно, что выпуск БСА происходит постепенно в течение первых 24-х часов, при всех значениях рН (рис. 3). Таким образом, наблюдается медленное контролируемое высвобождение БСА, несмотря на то, что при повышении рН происходит депротонирование аминогрупп белка и сульфогрупп фукоидана, и ослабление электростатического взаимодействия между биополимерами. Ядро частицы разрушается и осуществляется выпуск белка.

рН контролируемый выпуск зависит от релаксации полимера оболочки частиц и диффузионных процессов [11], способности полимера оболочки к набуханию.

в

60 50

40

30

с ,и нос ииц

я

тк ялу

ек ус ф па

ф нка 20 Э ни

10

а

40

35

% 30

и

к з 25

зу

р

г а 20

з

ь н 15

е

п е 10

т

С 5

0

А1

А2

A3 а

А4

А5

I I I

А1

А2

А3

b

А4

А5

Рис.2. Капсулирующая способность микрочастиц при изменении концентрации фукоидана: а - эффективность инкапсуляции; b - степень загрузки

Fig. 2. Encapsulating ability of the microparticles during the change of fucoidan concentration:

a - encapsulation efficiency; b - level of loading

0

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-— — У

••• рН 7 — рН 7,4 -рН 9,1

-1-1-1-1-1-1-1-1

2 4 6 8 10 12 24 48

Рис.3. Высвобождение белка из микрочастиц Fig. 3. The release of protein from microparticles

40 35 30 25 20 15 10 5 0

Степень набухания

Степень удержания воды

А1

А2

А3

А4

А5

Рис. 4. Влияние концентрации полисахарида на степень поглощения и удержания воды Fig. 4. Effect of polysaccharide concentration on the degree of water absorption and retention

Способность к набуханию и удержанию воды определяли в растворе ФСБ. Поглощение воды определяли путем погружения о б-разцов гелей в 1М ФСБ (рис. 4). В результате установлено, что с увеличением концентрации полисахарида происходит увеличение количества гидрофильных групп в системе, в результате чего осуществляется эффективное взаимодействие с растворителем, за счет сольватации функциональных групп, возможно поэтому степень набухания растет, увеличивается площадь поверхности, что способствует улучшению клеточной адгезии. Повышение концентрации полисахарида приводит к понижению влагоудерживающей способно-

сти, что возможно связано с присутствием несвязанных молекул воды, которые легко удаляются.

ВЫВОДЫ

Микрочастицы показали высокую стабильность и большой потенциал для регулируемой доставки БАВ, так как имели высокую эффективность загрузки и степень инкапсуляции. Определено, что наибольшей инкапсулирующей способностью обладали частицы с соотношением белок/полисахарид 1:1,5. Таким образом, изученные микроструктурные объекты могут быть интересны для косметической и фармацевтической промышленности.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Anitha A., Deepagan V.G., Divya Rani V.V., Menon D., Nair S.V., Jayakumar R. Preparation, characterization, in vitro drug release and biological studies of curcumin loaded dextran sul-phate-chitosan nanoparticles // Carbohydrate Polymers. 2011. T. 84, N 3. C. 1158-1164.https://doi.org/ 10.1016/j.carbpol.2011.01.005

2. Kim D. Y., Shin W. S. Unique characteristics of self-assembly of bovine serum albumin and fucoidan, an anionic sulfated polysaccha-ride, under various aqueous environments // Food Hydrocolloids. 2015. T. 44. C. 471-477.

3. Jain S., Jain V., Mahajan S. C. Lipid Based Vesicular Drug Delivery Systems // Advances in Pharmaceutics. 2014. T. 2014. 12 p. http://dx.doi.org/10.1155/2014/574673

4. Botova O.I., Gritskova I.A., Grinfel'd E.A., Lobanova N.A., Shitov R.O. The influence of the nature and concentration of the emulsifier on the degree of dispersion and the stability of artificial latex with positively charged particles // International Polymer Science and Technology. 2016. T. 43, N. 4. C. P. 7-10.

5. Kemala T., Budianto E., Soegiyono B. Preparation and characterization of microspheres based on blend of poly (lactic acid) and poly (e-cap-rolactone) with poly (vinyl alcohol) as emulsifier // Arabian Journal of Chemistry. 2012. T. 5, N 1. C. 103-108.

6. Becker L.C., Bergfeld W.F., Belsito D.V., Hill R.A., Klaassen C.D., Liebler D.C., Marks J.G., Shank R.C., Slaga T.J., Snyder P.W., Andersen F.A., Gill L.J. Safety Assessment of Synthetic Fluorphlogopite as Used in Cosmetics // International journal of toxicology. 2015. T. 34. C. 43-52. http://dx.doi.org/10.1177/1091581815613513

7. Dutta P. K., Rinki K., Dutta J. Chitosan: A promising biomaterial for tissue engineering scaffolds // Chitosan for Biomaterials Ii. Heidelberg: Springer Berlin, 2011. C. 45-79.

8. Pinheiro A. C. et al. Chitosan/fucoidan multilayer nanocapsules as a vehicle for controlled release of bioactive compounds // Carbohydrate polymers. 2015. T. 115. C. 1-9.

9. Sowjanya J. A. et al. Biocomposite scaffolds containing chitosan/alginate/nano-silica for bone tissue engineering // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013. T. 109. C. 294-300.

10.Venkatesan J., Bhatnagar I., Kim S. K. Chitosan-alginate biocomposite containing fu-coidan for bone tissue engineering // Marine drugs. 2014. T. 12, N 1. C. 300-316.

11.Prestes P.S. et al. Particle size and morphological characterization of cosmetic emulsified systems by Optical Coherence Tomography (OCT) // Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016. T. 52, N 2. C. 273-280.

REFERENCES

1. Anitha A., Deepagan V.G., Divya Rani V.V., Menon D., Nair S.V., Jayakumar R. Preparation, characterization, in vitro drug release and biological studies of curcumin loaded dextran sul-phate-chitosan nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 2011, vol. 84, no. 3, pp. 1158-1164. doi.org/

10.1016/j.carbpol.2011.01.005

2. Kim D. Y., Shin W. S. Unique characteristics of self-assembly of bovine serum albumin and fucoidan, an anionic sulfated polysaccharide, under various aqueous environments. Food Hydrocolloids. 2015, vol. 44, pp. 471 -477.

3. Jain S., Jain V., Mahajan S. C. Lipid Based Vesicular Drug Delivery Systems. Advances in Pharmaceutics. 2014, vol. 2014, 12 p. dx.doi.org/10.1155/2014/574673

4. Botova O.I., Gritskova I.A., Grinfel'd E.A., Lobanova N.A., Shitov R.O. The influence of the nature and concentration of the emulsifier on the degree of dispersion and the stability of artificial latex with positively charged particles. International Polymer Science and Technology. 2016, vol. 43, no. 4, pp. 7-10.

5. Kemala T., Budianto E., Soegiyono B. Preparation and characterization of micro-spheres based on blend of poly (lactic acid) and poly (e-caprolactone) with poly (vinyl alcohol) as emulsifier. Arabian Journal of Chemistry. 2012, vol. 5, no. 1, pp. 103-108.

6. Becker L.C., Bergfeld W.F., Belsito D.V., Hill R.A., Klaassen C.D., Liebler D.C., Marks J.G., Shank R.C., Slaga T.J., Snyder P.W., Andersen F.A., Gill L.J. Safety Assessment of Synthetic Fluorphlogopite as Used in Cosmetics. International Journal of Toxicology. 2015, vol. 34, pp. 43-52. dx.doi.org/10.1177/1091581815613513

7. Dutta P. K., Rinki K., Dutta J. Chitosan: A promising biomaterial for tissue engineering scaffolds. Chitosan for Biomaterials Ii. Heidelberg: Springer Berlin, 2011, pp. 45-79.

8. Pinheiro A. C. et al. Chitosan/fucoidan multilayer nanocapsules as a vehicle for controlled release of bioactive compounds. Carbohydrate polymers. 2015, vol. 115, pp. 1-9.

9. Sowjanya J. A. [et al.] Biocomposite scaffolds containing chitosan/alginate/nano-silica for bone tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013, vol. 109, pp. 294-300.

10. Venkatesan J., Bhatnagar I., Kim S. K. Chitosan-alginate biocomposite containing fu-coidan for bone tissue engineering. Marine Drugs. 2014, vol. 12, no. 1, pp. 300-316.

11. Prestes P.S. [et al.] Particle size and morphological characterization of cosmetic emulsified systems by Optical Coherence Tomography (OCT). Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016, vol. 52, no. 2, pp. 273-280.

Критерии авторства

Супрунчук В.Е., Денисова Е.В., Андрусенко С.Ф., Бондарь Т.П. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Супрунчук В.Е., Денисова Е.В., Андрусенко С.Ф., Бондарь Т.П. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Contribution

Suprunchuk V.E., Denisova E.V., Andrusenko S.F., Bondar T.P. carried out the ex-perimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Suprunchuk V.E., Denisova E.V., Andrusenko S.F., Bondar T.P. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Виктория Е. Супрунчук

Северо-Кавказский федеральный университет

Аспирант, ассистент кафедры медицинской биохимии,клинической лабораторной диагностики и фармации vikasuprunchuk@gmail.com

Евгения В. Денисова

Северо-Кавказский федеральный университет

К.б.н., доцент, и.о. заведующего кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации den_ev@mail.ru

Светлана Ф. Андрусенко

Северо-Кавказский федеральный университет

К.б.н., доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации svet1677@yandex.ru

Поступила 21.09.2017

Conflict of interests

The authors declares no conflict of interests regarding the publication of this article.

AUTHORS' INDEX Affiliation

Viktoria E. Suprunchuk

North Caucasian Federal University Postgraduate Student, Assistant Department of Medical Biochemistry, Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy vikasuprunchuk@gmail.com

Evgeniya V. Denisova

North Caucasian Federal University Ph.D. (Biology), Associate Professor, Head of Department of Medical Biochemistry, Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy den_ev@mail.ru

Svetlana F. Andrusenko

North Caucasian Federal University

Ph.D. (Biology), Associate Professor,

Head of Department of Medical Biochemistry,

Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy

svetl 677@yandex.ru

Received 21.09.2017