Научная статья на тему 'Оценка качества и устойчивости к криоконсервации эмбрионов коз в зависимости от стадии развития'

Оценка качества и устойчивости к криоконсервации эмбрионов коз в зависимости от стадии развития Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
797
112
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОЗА / ЭМБРИОН / СТАДИЯ РАЗВИТИЯ / КАЧЕСТВО / УСТОЙЧИВОСТЬ / КРИОКОНСЕРВАЦИЯ / GOAT / EMBRYO / STAGE OF DEVELOPMENT / RESISTANCE / CRYOCONSERVATION

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Аксенова Полина Владимировна, Айбазов Али-магомет Муссаевич, Сеитов Марат Султанович

Одним из эффективных приёмов биотехнологии воспроизводства, направленных на сохранение генофонда высокоценных животных, является метод криоконсервации гамет. Криоконсервация – это технология, которая позволяет сохранить в специальных низкотемпературных условиях сперматозоиды, яйцеклетки и эмбрионы, а следовательно, генофонд высокоценных животных. В статье представлены результаты экспериментов по сравнению двух методов криоконсервации: контролируемой медленной криоконсервации (после эквилибрирования эмбрионов в глицериновых растворах разной концентрации) и ускоренной криоконсервации (в режиме: от +4 до -5°С со скоростью 4°С/мин, от -5 до -110°С со скоростью 25°С/мин, от -110 до -140°С со скоростью 35°С/мин). Исследования проводили на опытной станции Ставропольской НИИЖК Россельхозакадемии. В качестве среды для культивирования использовали собственную среду для криоконсервации эмбрионов коз. Для замораживания отбирали оплодотворённые ооциты, эмбрионы на стадии двух, четырёх и более бластомер, а также эмбрионы, достигшие стадии морулы. Определяли устойчивость эмбрионов к криоконсервации в зависимости от их стадии развития. В основу оценки качества эмбрионов коз была положена общепринятая классификация эмбрионов по качеству: размер и симметричность пронуклеусов, число, количество, равность и распределение нуклеолей, включения цитоплазмы; степень фрагментации, форму и относительные размеры бластомеров. Были установлены дополнительные критерии оценки качества эмбрионов коз, доказана принципиальная возможность обратимого анабиоза гамет коз после криоконсервации при сверхнизких температурах (-196°С) и определены оптимальные параметры режима криоконсервации. Наилучшая устойчивость к криоконсервации была отмечена у ооцитов и 2–4 бластомерных эмбрионов, а также у морул.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Аксенова Полина Владимировна, Айбазов Али-магомет Муссаевич, Сеитов Марат Султанович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ASSESSMENT OF GOAT EMBRYONS QUALITY AND RESISTANCE TO CRYOCONSERVATION AS DEPENDENT ON THE STAGE OF THEIR DEVELOPMENT

One of effective methods of reproduction biotechnology directed to maintenance of the highly valuable animals is the method of gametes cryoconservation. This is a technology which allows the embryos, ovules and spermatozoids, and hence, the genofund of valuable animals, to be preserved under special low temperature conditions. The results of experiments purposed to compare the two methods of cryoconservation – the controlled slow one (after equilibration of embryos in glycerin solutions of different concentration) and that of a more speedy cryoconservation (in the regime: from +4 to -5°C with the speed of 4°C/min, from -5 to -110°C with the speed of 25°C/min, from -110 to 140°C with the speed of 35°C/min) are presented in the article. The studies were conducted on the experimental station of the Stavropol Research Institute, RAAS. The natural cryoconservation nutrient medium was used as the medium for the goats’ embryos cultivation. The fertilized oocytes, embryos at the stage of two, four and more blastomeres, as well as embryos having reached the morula stage were selected to be freezed. The resistance of embryos to cryoconservation as dependent on the stage of their development was determined. As the basis for the quality of goats’ embryos estimation the common classification of embryos by their quality was used: the size and symmetry of pronuclei, number, quantity, equality and distribution of nucleols, inclusion of cytoplasm; the degree of fragmentation, the shape and relative sizes of blastomeres. Additional criteria for the quality of goats’ embryos assessment have been established, the principle possibility of reversible anabiosis of goat gamets after cryoconservation at extremely low temperatures (-196°C) has been proved and the optimal parameters of the cryoconservation regime have been determined. The highest resistance to cryoconservation was observed in the oocytes and in the 2–4 blastomer embryos as well as in moruls.

Текст научной работы на тему «Оценка качества и устойчивости к криоконсервации эмбрионов коз в зависимости от стадии развития»

Оценка качества и устойчивости к криоконсервации эмбрионов коз в зависимости от стадии развития

П.В. Аксёнова, к.б.н, Северо-Кавказский зональный НИВИ РАСХН; А-М.М. Айбазов, д.с.-х.н., профессор, Ставропольский НИИЖК РАСХН; М.С. Сеитов, д.б.н., профессор, Оренбургский ГАУ

Эффективность трансплантации зависит от комплекса факторов, в том числе в значительной степени от корректной оценки качества извлечённых эмбрионов. Критерии объективной оценки жизнеспособности эмбрионов ещё недостаточно разработаны [6]. В существующих методах оценки эмбрионов (в основном это касается эмбрионов человека, мышей и кроликов) большое значение придаётся морфологической дифференциации.

Одним из эффективных приёмов биотехнологии воспроизводства, направленных на сохранение генофонда высокоценных животных, является метод криоконсервации гамет. Технология замораживания спермиев различных животных достаточно хорошо разработана и успешно применяется в науке и практике животноводства, в том числе и в

международных экспериментах, созданы криобанки спермы [1—3]. Что касается криоконсервации эмбрионов, то этот метод не нашёл широкого применения в Россиии из-за низкой выживаемости и приживляемости дефростированных зигот.

Преимущество криохранилища (банка) эмбрионов перед банком половых клеток заключается в том, что эмбрион представляет собой особь, пусть и состоящую из небольшого количества клеток. После размораживания его достаточно пересадить самкам-реципиентам, чтобы родилось потомство. За рубежом криоконсервация эмбрионов применяется уже несколько десятилетий (в основном в скотоводстве), однако до сих пор ещё нельзя однозначно трактовать её как собственно технологию, слишком вариабельны результаты и велик процент брака [7]. В России предпринимались попытки криоконсервировать эмбрионы крупного рогатого скота, однако они не нашли широкого применения.

Впервые попытки замораживания эмбрионов у коз были предприняты нами в 2011 г. [4]. При работе

с определённым видом животных вдобавок к общепринятым методам криоконсервации зародышей и гамет появляется необходимость разрабатывать целый пакет репродуктивных технологий, наиболее подходящий именно для этого вида.

Объекты и методика исследования. Исследования проводили на опытной станции Ставропольского НИИЖК Россельхозакадемии. В конце полового сезона, в декабре, были отобраны козы — доноры и реципиенты. У коз-доноров индуцировали полиовуляцию по оригинальной схеме: для синхронизации полового цикла в качестве пролон-гаторов лютеиновой фазы использовали ушные импланты «Крестар» (действующее вещество норгестамет); для её прерывания и стимуляции оогенеза — «Фоллигон» в дозе 500 ед. и «Оваген» в общей дозе 8 мл. Синхронность овулирования созревших фолликулов обеспечивали применением «Хорулона» — 300 ед.

В качестве среды для культивирования использовали собственную среду для криоконсервации эмбрионов коз [5]. Отмывку оттаянных ооцитов/ эмбрионов после криопротектора и их дальнейшее культивирование осуществляли в той же среде. В качестве криопротектора применяли глицерин.

Для замораживания отбирали оплодотворённые ооциты, эмбрионы на стадии двух, четырёх и более бластомер, а также эмбрионы, достигшие стадии морулы. После эквилибрации гаметы помещали в пайеты (соломинки) для замораживания спермы. Соломинки после фасовки в них гамет запаивали ультразвуком, используя для этого линию по криоконсервации IMV (Франция). Оттаивание пайет проводили в водяной бане при 40°С.

Результаты исследования. В первом эксперименте сравнили два метода криоконсервации:

— контролируемой медленной криоконсервации (после эквилибрирования эмбрионов в глицериновых растворах разной концентрации);

— ускоренной криоконсервации (в режиме: от +4 до -5°С со скоростью 4°С/мин, от -5 до -110°С

со скоростью 25°С/мин, от -110 до -140°С со скоростью 35°С/мин).

Результаты эксперимента отражены в таблице 1.

В результате замораживания первым способом 8 из 10 ооцитов и 5 из 10 эмбрионов после деф-ростации подверглись необратимой деструкции.

При ускоренном замораживании в предложенном нами режиме из 7 ооцитов и 6 эмбрионов необратимой деструкции подверглись 2 ооцита. Остальные ооциты и эмбрионы в течение 4—6 ч. после оттаивания восстановили свою форму и объём, однако при дальнейшем культивировании погибали в течение 1—2 суток.

В следующем эксперименте определяли устойчивость эмбрионов к криоконсервации в зависимости от их стадии развития. С учётом предыдущего опыта применили ускоренный метод криоконсервации.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

По таблице видно, что восстановление формы и размера происходило у 100% ооцитов, в то время как все 6-8-бластомерные зародыши погибли. Через 48 час. культивирования лишь 60% ооцитов и 50% 2—4-бластомерных эмбрионов остались жизнеспособными.

В эксперименте отмечен интересный факт, требующий своего объяснения, — эмбрионы на стадии морулы снова приобретали способность переносить глубокое замораживание.

В основу оценки качества эмбрионов коз была положена общепринятая классификация эмбрионов по качеству:

1-й день развития. Оценивается наличие признаков оплодотворения и качество зигот. Наличие в яйцеклетке 2 пронуклеусов (Р^ и 2 полярных тел (РВ) указывает на нормальное развитие процесса оплодотворения. Отмечают: размер и симметричность пронуклеусов, число, количество, рав-ность и распределение нуклеолей, включения цитоплазмы.

1. Результаты криоконсервации эмбрионов коз при медленном и ускоренном режимах

Время культивирования после дефростации Медленная криконсервация Ускоренная криконсервация

оплодотв. ооциты (n=10) 2-4-бласт. эмбрионы (n= 10) оплодотв. ооциты (n=7) 2-4-бласт. эмбрионы (n=6)

Восстановление формы и размера, шт/% 2/20 5/50 5/71,4 6/100

Через 24 ч., шт/% 0/0 0/0 2/28,5 1/16,7

Через 48 ч., шт/% 0/0 0/0 0/0 0/0

2. Результаты криоконсервации эмбрионов разного возраста

Время культивирования после дефростации Стадия развития и выживаемость эмбрионов

оплодотв. ооциты (n=5) 2-бласт. эмбрионы (n=4) 4-бласт. эмбрионы (n=4) 6-8-бласт. эмбрионы (n=2) морулы (n=3)

Восстановление формы и размера, шт/% 5/100 3/75 3/75 0/0 2/66,6

Через 24 ч., шт/% 5/100 3/75 2/50 - 1/33,3

Через 48 ч., шт/% 3/60 2/50 2/50 - 1/33,3

Режим №1 Режим №2

Рис. - Различные фазовые режимы микроскопии

Режим №3

2-й день развития. На 2-е сутки после слияния генетического материала сперматозоида и яйцеклетки происходит первое дробление. Отмечают степень фрагментации, форму и относительные размеры бластомеров:

тип А — эмбрион отличного качества без ану-клеарных (безъядерных) фрагментов (4А);

тип В — эмбрион хорошего качества с содержанием ануклеарных фрагментов до 20% (4В);

тип С — эмбрион удовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов от 21 до 50% (4С);

тип D — эмбрион неудовлетворительного качества с содержанием ануклеарных фрагментов более 50% ^).

3-й день развития. Эмбрион состоит из 6—8 бластомеров.

4-й день развития. Эмбрион состоит из 10—14 бластомеров, межклеточные контакты уплотняются и поверхность эмбриона сглаживается (процесс компактизации) — стадия морулы.

Наряду с общепринятой классификацией эмбрионов по качеству нами предлагается:

1) учитывать видовые особенности эмбрионов коз/оплодотворённой яйцеклетки до слияния пронуклеусов;

2) новый способ микроскопии эмбриона/оплодотворённой яйцеклетки до слияния пронуклеусов;

3) функциональную диагностику жизнеспособности эмбриона/ оплодотворённой яйцеклетки до слияния пронуклеусов.

В процессе экспериментов были установлены следующие видовые особенности в морфологии эмбрионов коз:

— яйцеклетка и ранний эмбрион покрыты обильным слоем внутриклеточного жира. Для объективной оценки и работы с клетками необходимо их обязательное центрифугирование;

— мужской и женский пронуклеусы в оплодотворённой яйцеклетке козы одного размера, ядрышки при световой микроскопии, как правило, не различимы.

Для того чтобы удостовериться в жизнеспособности эмбрионов, рекомендуем трёхрежимное микроскопическое обследование при различных фазовых режимах микроскопа (рис.).

Режим № 1 позволяет увидеть эмбрион в проходящем свете. При этом различимы бластомеры, оолемма и жировые капли под оолеммой. Режим № 2 — тёмный фон при зелёном светофильтре -скрывает мембраны. Здесь хорошо видны плотность и однородность клеточной массы, вакуолизация (если есть), различные дефекты бластомер. Режим № 3 показывает целостность и дефекты клеточных мембран.

Заключительным этапом исследования критериев оценки качества эмбрионов мы рекомендуем культивирование эмбриона/оплодотворённой яйцеклетки в инкубаторе в 5% СО2 в течение 1 суток при 39°С. Если эмбрион продолжает развитие, он считается пригодным для криоконсервации.

Таким образом, в результате экспериментов были установлены дополнительные критерии оценки качества эмбрионов коз, доказана принципиальная возможность обратимого анабиоза гамет коз после криоконсервации при сверхнизких температурах (-196°С) и определены оптимальные параметры режима криоконсервации. Наилучшая устойчивость к криоконсервации была отмечена у ооцитов и 2-4 бластомерных эмбрионов, а также у морул.

Литература

1. Айбазов М.М., Аксенова П.В., Ашурбегов К.К. и др. К вопросу о сохранении генофонда и биологической полноценности криоконсервированной спермы // Животноводство и кормопроизводство: сб. науч. тр. Вып. 4. Ставрополь: СНИИЖК, Россельхозакадемия, 2011. С. 24-29.

2. Аксенова П.В. Научные основы интенсификации воспроизводства коз: автореф. дисс. ... докт. биол. наук. Новочеркасск: СКЗНИВИ, 2012. 51 с.

3. Малмаков Н.И., Сейтпан К., Хамзин К.П. и др. Результаты ягнения после внутриматочного осеменения овец замороженной-оттаянной спермой, импортированной из Новой Зеландии и США // Сборник научных трудов СНИИЖК. Ставрополь, 2012. Вып. 5. С. 59-62.

4. Отчёт о НИР. ГНУ СНИИЖК Россельхозакадемии. Ставрополь, 2011. 12 с.

5. Патент на изобретение «Среда для культивирования до-имплантационных эмбрионов коз in vitro» / П.В. Аксёнова, А-М.М. Айбазов (РФ). № 2396344. Заявка 2008152992. Приоритет 31 августа 2008 г. Зарегистрировано в Госреестре изобретений РФ 10 августа 2010 г. 2 с.

6. M. Ludwig, S. Al-Hasani, R. Feiberbaum e.a. Newer aspects of cryopreservation of oocytes and еmbryos in assisted reproduction and future perspectives / Ludwig M., Al-Hasani S., Feiberbaum R., Diedrich K. // Hum Reprod. 1999, 1. P. 162-85.

7. Stecher, P. Vaderzwalmen, I. Riedler, N. Zech, H. Zech / Vitrification of human embryos on height stage of development // Institute fur Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, Austria.-1999. V. 11. N l. P. 104.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.