Оценка ингибирующей активности штаммов Bacillus subtilis 26 d и Bacillus thuringiensis var . Thuringiensis при прорастании семян Trifolium pratense L . Текст научной статьи по специальности «Искусствоведение»

Экология

УДК 579.2: 58.071: 631: 63332

ОЦЕНКА ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS 26 D И BACILLUS THURINGIENSIS VAR. THURINGIENSIS ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН TRIFOLIUM PRATENSE L.

© 2014 А.Р. Гаджиев

Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, г. Магадан Северо-Восточный государственный университет, г. Магадан

Поступила в редакцию 13.01.2014

Излагаются результаты исследований по оценке ингибирующей активности штаммов Bacillus subtilis 26 D и Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. Использованы параметрические и непараметрические методы анализа. Обосновывается вывод, что энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis существенно угнетает рост и развитие прорастающих семян Trifolium pratense L.. Штамм Bacillus subtilis 26 D не фитотоксичен.

Ключевые слова: фитотоксичность, бактерии, Bac. thuringiensis var. thuringiensis, Bac. subtilis 26 D, семена, всхожесть, Trifolium pratense L, растения.

Спорообразующие бактерии рода Bacillus синтезируют большое количество физиологически активных веществ, среди которых особое значение в изучении отводится стимуляторам и ингибиторам роста и развития растений. Так, эн-дофитный штамм Bac. subtilis 26 D продуцирует вещества, оказывающие сильное ингибирующее действие на прорастающие семена Triticum sp. L., а среди энтомопатогенных культур Bac. thuringiensis, естественных регуляторов численности насекомых, 92% из 143-х изучавшихся шта-мов угнетают рост ее колеоптелей [7; 8].

Цель исследования: оценить фитотоксичность штаммов Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis при прорастании семян Trifolium pratense L.

Trifolium pratense L. широко распространенный вид растений на территории Северного При-охотья. Вид играет огромную роль в образовании растительного покрова: является распространенным медоносом, применяется как декоративная и пастбищная культура, используется для рекультивации нарушенных почв.

Для достижения поставленной цели устанавливалась всхожесть семян Trifolium pratense L. и определялась сырая масса проросших семян в контроле и культуральных средах с бациллами.

Материал и методика исследования. В качестве материала использовались штаммы Bac. subtilis 26 D, Bac. thuringiensis var. thuringiensis и семена Trifolium pratense L. (рис. 1).

Ингибирующая активность штаммов оценивалась путем определения сырой массы проросших семян Trifolium pratense L. и их всхожести. Под

Гаджиев Артем Русланович, научный сотрудник лаборатории геоботаники ИБПСДВО РАН, старший преподаватель кафедры биологии и химии Северо-Восточного государственного университета. E-mail: art1978@bk.ru

всхожестью понимается количество появившихся всходов, выраженное в процентах к количеству высеянных семян [1; 3; 5; 6].

Опыты проводились в 4-х вариантах с 5-ти кратной повторностью. Методика постановки опыта заключалась в следующем. В первом контрольном варианте опыта семена Trifolium pratense L. по 50 шт. в каждой из 5-ти чашек Петри (всего 250 семян) проращивались четверо суток в термостате при t=+25C° на дистиллированной воде (5 мл. на одну чашку Петри). Во втором контрольном варианте семена проращивались на жидкой питательной среде (ПВМБ - протеино-витаминно-минеральный бульон) так же четверо суток в термостате при той же температуре. В третьем и четвертом вариантах в течении двух суток штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis соответственно культивировались в термостате при t=+25C° на жидких питательных средах (ПВМБ, 5 мл. на чашку Петри). После этого в чашки Петри с культуральной жидкостью добавляли семена Trifolium pratense L. по 50 шт. в каждую из 5-ти чашек Петри. Засеянные чашки семенами помещались в термостат с t=+25C° еще на четверо суток для их проращивания.

По истечении указанного времени во всех чашках Петри подсчитывали число проросших семян и измеряли их вес на электронных весах серии "Highland" Adam НСВ 1002. Полученные результаты сравнивали с контролем. Обработка данных производилась с помощью программ"Microsoft Office Excel 2007" и "Statistica 6".

Результаты и их обсуждение. Средние арифметические результаты, полученные во всех вариантах опыта, для установленного уровня значимости Р=0,05 оказались достоверны (все t>tra(. = 2,78) (табл. 1).

1709

а) б)

Рис. 1. 7-ми суточные колонии бактерий на протеино-витаминно-минеральном агаре (ПВМА): а - Bacillus subtilis 26 D; б - Bac. thuringiensis var. thuringiensis

Таблица 1. Всхожесть и сырая масса проросших семян в контрольных и культуральных средах с Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis на 4-ые сутки

Вариант опыта Всхожесть Сырая масса проросших семян

Мх [Мх ±2,78™] Р=0,05, (%) m, (%) t Мх [Мх ±2,78тп]Р=0,05, (г) m, (г) t

1 56,4 [43,9; 68,9] ±4,5 12,5 0,59 [0,46; 0,73] ±0,05 11,8

2 55,2 [46,8; 63,6] ±3,0 18,4 0,55[0,44; 0,67] ±0,04 13,8

3 51,6 [36,5; 66,7] ±5,4 9,6 0,43[0,21; 0,65] ±0,08 5,4

4 48,8 [37,1; 60,5] ±4,2 11,6 0,35 [0,23; 0,46] ±0,04 8,8

Примечание: Мх - средняя арифметическая выборки; m - стандартная ошибка средней; t - достоверность

Всхожесть семян в контрольных средах в первом и во втором вариантах была практически одинаковой: 56,4 + 4,5% и 55,2 + 3,0% соответственно. Разница между вариантами составила 1,2 + 5,4%. Сырая масса проросших семян в первом варианте: 0,59 + 0,05 г и 0,55 + 0,04 г во втором, с разницей 0,04 + 0,06 г или 6,8% (табл. 1, 2).

Вышеприведенные результаты показывают, что жидкая питательная среда в контроле во втором варианте в сравнении с первым для семян не токсична. Так как в опытах с бациллами использовались жидкие питательные среды, то полученные результаты в третьем варианте в дальнейшем сравнивались с контролем во втором варианте.

Всхожесть семян в культуральных средах с Bac. subtilis 26 D в третьем и Bac. thuringiensis var. thuringiensis в четвертом варианте составила 51,6 + 5,4% и 48,8 + 4,2% соответственно (рис. 2).

Разница между вторым контрольным и третьим вариантом составила 3,6 + 6,2%, а между вторым и четвертым - 6,4 + 5,2% (табл. 2). Сырая масса проросших семян в третьем варианте с Bac.

[Мх + 2,78•m] - доверительный интервал для Мх; средней арифметической

subtilis 26 D составила 0,43 + 0,08 г, а в контроле во втором варианте - 0,55 + 0,04 г (рис. 3). Разница между вариантами - 0,12 + 0,09 г (21,8%).

Сырая масса проросших семян в третьем варианте с Bac. thuringiensis var. thuringiensis составила 0,35 + 0,04 г, а в контроле во втором варианте - 0,55 + 0,04 г. Разница между вариантами -0,20 + 0,06 г или 36,4%.

Имеющиеся между вариантами различия проверялись на достоверность статистическими методами анализа с использованием параметрического t - критерия Стьюдента и непараметрического U - критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [1; 2; 4; 9; 10; 11, 12].

При проверке статистических гипотез использовались два понятия: Н0 - это нулевая гипотеза о сходстве или отсутствии различий в вариантах и Н1 - альтернативная гипотеза о имеющихся различиях в вариантах опыта.

Формулировка гипотез. Всхожесть семян: 1) Н0: разница между вариантами недостоверна, если U > U , или Р >0,05, или^ < t ,.

эмп. — кр.7 эмп. 7 7 факт. — таб.

1710

Экология

Рис. 2. Всхожесть семян Trifolium pratenseL. в контроле и с бациллами

Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis не влияют на всхожесть семян Trifolium pratense L.. 2) Н^ разница между вариантами достоверна, если U < U , или

1 7 эмп. — кр.7

Р <0,05, или t, > t ,. Штаммы Bac. subtilis 26

эмп. 7 7 факт. — таб.

D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis влияют на всхожесть семян Trifolium pratense L.

Сырая масса проросших семян: 1) Н0: разница между вариантами недостоверна, если иэмп

> U , или Р >0,05, или t. < t , Штаммы Bac.

кр. эмп. факт. таб.

subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis не ингибируют прорастающие семяна Trifolium pratense L.2) Н1: разница между вариантами достоверна, если U < U , или Р <0,05, или t

Г эмп. — кр. эмп. факт.

> tra6. Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis

Рис. 3. Сырая масса проросших семян Trifolium pratense L. в контроле и с бациллами

var. thuringiensis ингибируют прорастание семян Trifolium pratense L.

Таким образом, в эксперименте можно констатировать достоверные различия между средними арифметическими в вариантах опыта, если U ^ U или Р <0,05, или t, > t, (табл. 2).

эмп. < кр, эмп. факт. таб.

Разница между контрольным вторым и третьим вариантом с Bac. subtilis 26 D по всхожести и сырой массе проросших семян Trifolium pratense L. оказалась не достоверна. Bac. thuringiensis var. thuringiensis также не повлиял на всхожесть, т.е. нулевая гипотеза осталась не опровергнутой (табл. 2).

Альтернативная гипотеза была принята лишь в четвертом варианте по сравнению с кон-

Таблица 2. Оценка достоверности раличий между средними арифметическими в вариантах опыта

Статистические показатели Варианты опыта

Всхожесть Сырая масса проросших семян

1-2 2-3 2-4 1-2 2-3 2-4

U3Mn. (n = 5; n = 5) 12,0 9,5 6,5 7,5 6,0 1,0

Р А эмп. 0,917 0,531 0,210 0,296 0,175 0,016

Суммарный ранг группы 1 28,0 30,5 33,5 32,5 34,0 39,0

Суммарный ранг группы 2 27,0 24,5 21,5 22,5 21,0 16,0

^мп. < Ukp. (ЦШ=4; Р=0,05) нет нет нет нет нет да

Рэмп<0,05 нет нет нет нет нет да

d,(%, г) 1,2 3,6 6,4 0,04 0,12 0,20

md,(%, г) ±5,4 ±6,2 ±5,2 ±0,06 ±0,09 ±0,06

^акт. 0,22 0,58 1,23 0,67 1,33 3,33

^акт. > W. Йгаб = 2,31; Р=0,05) нет нет нет нет нет да

Примечание: и - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (эмпирический и критический); Р - уровень значимости (эмпирический); d - разница между средними арифметическими в вариантах; md - ошибка разности; tфакти ^ - критерий существенности фактический и табличный по Стъюденту, при этом число степеней свободы равно: V = п4+п2 - 2; V = 5+5-2=8; ^ = 2,31.

1711

тролем, на что указывают различия в показателях сырой массе проросших семян Trifolium pratense L..

Выводы: Проведенные исследования позволяют достоверно утверждать, что штамм Bac. subtilis 26 D не фитотоксичен. Продукты его метаболизма не угнетают развитие семян Trifolium pratense L. и не влияют на их всхожесть. Штамм Bac. thuringiensis var. thuringiensis также не влияет на всхожесть семян Trifolium pratense L., однако ингибирует их дальнейший рост и развитие, что свидетельствует о фитотоксичности штамма.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Возняковская Ю.М. Микрофлора растений и урожай. Л.: Колос, 1969. С. 187-222.

2. ГублерЕ.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л.: Медицина, 1973. С. 21-90.

3. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. [под ред. В.И. Билай]. Киев: Наукова думка, 1982. С. 322.

4. Зайцев Г.Н. Математика в экспериментальной бо-

танике. М.: Наука, 1990. С.13-15.

5. Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева А.А., Мануча-рова Н.А. Практикум по биологии почв. М.: МГУ, 2002. С. 88.

6. Казеев К.Ш., Колесников С.И., Вальков В.Ф. Биологическая диагностика и индикация почв: методология и методы исследований. Ростов н/Д: Изд-во РГУ, С.170-172.

7. Лукьянцев М.А. Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus subtilis Cohn. с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Саратов, 2010. С. 11-13.

8. Малхасян А.М. Изучение образования ингибиторов и стимуляторов роста растений разными видами аэробных спорообразующих бактерий: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Ереван, 1973. С.9.

9. Малков П.Ю. Количественный анализ биологических данных. Горно-Алтайск: РИО ГАГУ, 2005. С. 28, 29.

10. Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине [пер. с англ]. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. С. 31.

11. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйш. школа, 1973. С. 83, 84.

12. Vasilyev A. V., KhamidullovaL.R., Podurueva V. V., Solovyov S. G. Investigation of toxicity of waste water of ' AVTOVAZ" company by using biological testing methods // Safety of Technogenic Environment. 2012. № 2. С. 72-75.

EVALUATION OF INHIBITORY ACTIVITY OF THE STRAINS BACILLUS SUBTILIS 26 D AND BACILLUS THURINGIENSIS VAR. THURINGIENSIS DURING GERMINATION

OF SEEDS OF TRIFOLIUM PRATENSE L.

© 2014 A.R. Gadzhiev Institute of Biological Problems of the North, Far-Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, Magadan North-eastern State University, Magadan

The article assesses the inhibitory activity of strains of Bacillus subtilis 26 D and Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. Parametric and nonparametric analyses are used. Entomopathogenic strain of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis significantly inhibits the growth and development of germinating seeds Trifolium pratense L. Strain Bacillus subtilis 26 D is not phytotoxic.

Key words: plant communities, soil, phytotoxicity, bacteria, Bac. thuringiensis var. thuringiensis, Bac. subtilis 26 D, seed, germination, Trifolium pratense L., plants.

Artem Gadzhiyev, Research Fellow, Laboratory of Geobotany, Institute of Biological Problems of the North FEB RAS; Senior Lecturer, Biology and Chemistry Department, North-East State University. E-mail: art1978@bk.ru

1712