CC BY
139
ГЕМАТОЛОГИЯ
ГЕМАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616.633.963.42-039.31-076.5-073.175
Наумова Е.В.1, Плеханова О.С.1, Луговская С.А.1, Почтарь М.Е.1, Бугров И.Ю.1
ОЦЕНКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПНГ-КЛОНА НА РЕТИКУЛОЦИТАХ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
1Кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Минздрава России, 123995, Москва
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) — редкое клональное заболевание, при котором происходит соматическая мутация гена PIG-A на уровне стволовой гемопоэтической клетки. В результате этого возникает нарушение синтеза гликозилфосфатидилиннозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию многочисленных молекул на мембране клеток крови, которые защищают клетки крови от воздействия комплемента. Международным обществом клинической цитометрии (2010) предложены методические рекомендации выявления ПНГ-клона среди эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов. Нами предложена методика оценки ПНГ-клона в ретикулоцитарной популяции крови с использованием метода проточной цитофлюориметрии. Проанализированы 160 образцов крови пациентов с клиническими признаками ПНГ и анемии. Использовали два способа гейтирования ретикулоцитов — с помощью моноклональных антител к CD71 (рецептор к трансферрину) и реагента BD ReticCount™.
Получена высокая корреляция между размером ретикулоцитарного ПНГ-клона, оцененного с помощью CD71, и размером гранулоцитарного и моноцитарного ПНГ-клона. Разработанная панель (CD71/CD235a/CD59) может использоваться для скрининга и мониторинга ПНГ.
Ключевые слова: проточная цитометрия; ПНГ; ретикулоциты; тиазол оранжевый; CD71. E.V. Naumova, O.S. Plekhanova, S.A. Lugovskaya, M.E. Potchtar, I.Yu. Bugrov
THE EVALUATION AND COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF DETECTION OF CLONE OF PAROXYSMAL Щ NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA ON RETICULOCYTES USING THE TECHNIQUE OF FLOW CYTOMETRY ф
The Russian medical academy of post-graduate education of Minzdrav of Russia, 123995 Moscow, Russia The paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is a rare clonal disease characterized by .somatic mutation of gene PIG-A at the level of stem hematopoietic cell. This process results in disorder of synthesis of glycosil phosphatidyl innozitol (GPI) anchor fixing numerous molecules on membrane of blood cells which protect blood cells from impact of complement. The international society of clinical cytometry (2010) proposed the guidelines of detection of clone of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria among erythrocytes, granulocytes and monocytes. The original technique is proposed to evaluate the clone of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in reticulocyte population of blood using method offlow cytofluorometry. The sampling of 160 samples of blood of patients with clinical symptoms of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and anemia was analyzed. Two modes of gatedrawing were applied - using monoclonal antibodies to CD71 (receptor to transferrin) and reagent BD ReticCount. The high correlation was established between size of reticulocytic clone of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria evaluated by CD71 and size of granulocytic and monocytic clone of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. The developed panel (CD71/CD235a/CD59) can be applied for screening and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
Keywords: flow cytometry; paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; reticulocyte; thiazole orange; CD71.
Введение. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) — редкое приобретенное клональное [1, 2] заболевание, развивающееся в результате экспансии одного или нескольких клонов гемопоэтических стволовых клеток с соматической мутацией PIG-A (phosphatidylinositol glycan-class A) гена, который локализуется на Х-хромосоме [2—4]. Данный генетический дефект приводит к нарушению синтеза гли-козилфосфатидилиннозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию целого ряда молекул на мембране клеток крови [5]. Клинически ПНГ характеризуется хроническим внутрисосудистым комплементопосредованным гемолизом [6—8], рецидивирующими тромбозами, часто с необычными локализациями (печеночные, мезентериальные, нижняя полая, портальная, церебральные вены и др.) [9, 10], развитием
Для корреспонденции: Наумова Елена Владимировна, науч. сотр. Адрес: 123995, Москва, ул. Баррикадная, 2/1 E-mail: e_naum@mail.ru
недостаточности костного мозга, приводящей к панцито-пении, и другими редкими симптомами [10, 11]. Патогенез клинических проявлений заболевания связан с гемолизом эритроцитов в результате атаки системой комплемента через образование мембраноатакующего комплекса (МАК), который в норме инактивируется присутствием на эритроцитах GPI-связанного белка CD59 [12]. Молекула CD59 является основным блокатором постоянной активации системы комплемента и защищает клетки от образования на их поверхности МАК.
Первыми методами диагностики ПНГ были сахарозная проба Хартмана—Дженкинса и кислотный метод Хема (1936 г.), когда в слабом растворе сахарозы или при понижении рН сыворотки происходят активация комплемента и видимый глазом гемолиз эритроцитов [9]. Недостатками этих методов являются невозможность количественной оценки результата и слабая чувствительность [13]. С развитием проточной цитометрии разработан протокол по диагностике ПНГ на основе определения дефицита экспрессии CD55 и CD59 на
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 7, 2014
эритроцитах [14]. В дальнейшем стало очевидно, что оценка содержания эритроцитов с недостаточным уровнем белков CD55 и CD59 не позволяет судить об истинном размере ПНГ-клона, поскольку эритроциты подвергаются гемолизу, кроме того, после переливания крови изменяется соотношение нормальных и ПНГ-позитивных эритроцитов. Более адекватной является оценка наличия ПНГ-клеток в популяции лейкоцитов [15, 16]. Одновременно показано, что определение экспрессии CD55 не позволяет эффективно выявить эритроциты II и III типов (частично лишенные GPI-якоря и полностью лишенные). После создания реагента FLAER (FLuorescence AERolysin) — бактериального белка, который связывается непосредственно с GPI-якорем, выявление ПНГ-клона среди лейкоцитов стало рутинным тестом [17]. Результаты сравнения различных клонов моноклональных антител разных фирм позволили определить наиболее эффективные и создать протокол, который в настоящее время рекомендован Международным обществом клинической цитометрии как основной протокол диагностики ПНГ [11]. На сегодняшний день проточная цитометрия играет ключевую роль в лабораторной диагностике ПНГ. Достаточно часто у больных ПНГ выявляют большой размер клона среди гранулоцитов и моноцитов и минорный клон или его отсутствие среди эритроцитов, что объясняется хроническим, различной степени выраженности гемолизом, проведением трансфузионной терапии, снижением продолжительности жизни эритроцитов. Оценка ретикулоцитов представляет интерес, поскольку они не подвержены гемолизу и могут отражать истинный размер эритроцитарного ПНГ-клона. Для исследования количества ретикулоцитов могут быть использованы такие маркеры, как тиазол оранжевый, окрашивающий РНК в клетке [18], и CD71 (рецептор к трансферрину). Интенсивность экспрессии CD71 на незрелых ретикулоцитах коррелирует с количеством в них РНК [19].
Целью исследования являются разработка метода оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов и сопоставление его с соответствующим размером ПНГ-клона среди эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов у больных ПНГ, апластической анемией (АА), имеющих ПНГ-клон.
Материалы и методы. Материалом для исследования служила периферическая кровь, стабилизированная К2ЭД-ТА. Обследовали 160 пациентов, направленных на исследование ПНГ-клона на основании клинической картины, а также лабораторных данных (анемия, высокое содержание ЛДГ, билирубина, отрицательная прямая проба Кумбса). Из них 88 женщин в возрасте от 15 лет до 71 года и 72 мужчины в возрасте от 19 до 59 лет. У 86 (53,7%) пациентов из 160 обнаружили ПНГ-клон.
Исследования проводили на проточных цитометрах FC500 (Beckman Coulter, ) и BD (Becton Dickenson, США) с применением гейтирующих антител CD235a (FITC) для эритроцитов, CD71 (АРС)/тиазол оранжевый (PE, реагент BD Retic-Count™) для ретикулоцитов, CD15(PE)/CD45(PC-7) для гранулоцитов, CD64(PC-5)/CD45(PC-7) для моноцитов и GPI-связанных белков CD59(PE) для эритроцитов/ ретикулоцитов, FLAER(FITC)/CD24(PC-5)-гранулоцитов и FLAER(FITC)/CD14(PE)-моноцитов.
Оценку размера ПНГ-клона на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах проводили согласно международным рекомендациям [11].
Для оценки ПНГ-клона на ретикулоцитах были модифицированы методики, описанные в литературе [19—22]. Размер ПНГ-клона на ретикулоцитах определяли двумя методами.
Гейтирование и анализ ретикулоцитов с помощью моно-клоналъных антител (МКА) к CD71. Для окраски ретикулоцитов периферическую кровь разводили в 10 раз. В промаркированную пробирку вносили 10 мкл суспензии эритроцитов и МКА к CD235а, CD71 и CD59 согласно инструкции производителя. После инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре проводили отмывание эритроцитов. К образцу добавляли 4 мл PBS (pH 7,3—7,5) в режиме центрифугирования 5 мин с частотой 1500 об/мин. Отмывку повторяли дважды. Готовый образец ресуспендировали, добавляли 750 мкл PBS и анализировали на проточном цитометре.
Для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов, гейтиро-ванных по CD71, применяли трехцветную оценочную панель CD235a (FITC)/CD71 (APC)/CD59(PE).
Рис. 1. Стандартный протокол для оценки ПНГ-клона на эритроцитах (а—г) [11]. Схема проведения анализа ПНГ-клона среди ретикулоцитов, выделенных при помощи CD71 (а, б, д—з).
На представленном на графике ПНГ-клон присутствует среди эритроцитов в размере 0,8% (II + III типы) и среди ретикулоцитов в размере 3,6% (II + III типы). PNH ret (ж, з) — гейт, в котором отображен ПНГ-клон на ретикулоцитах.
26
ГЕМАТОЛОГИЯ
Рис. 2. Проведение анализа ПНГ-клона среди ретикулоцитов, выделенных с помощью тиазол оранжевого (а—г). В данном случае ПНГ-клон присутствует среди эритроцитов в размере 51,9% (II + III типы) (д, е) и среди ретикулоцитов в размере 87,3% (II + III типы) (г, е).
Здесь и на рис. 3: ТО — тиазол оранжевый.
Для каждого образца на скатерограмме FS/SS выбирали область, содержащую зрелые и незрелые эритроциты, исключали дебрис, тромбоциты (низкий FS/SS) и дуплеты клеток (рис. 1, а). Область ретикулоцитов на графике FS/ SS характеризуется высоким FS. Второй этап гейтирования включал выделение эритроцитов и ретикулоцитов с использованием МКА к CD235a (гликофорин A; рис. 1, б). События, вошедшие в гейт CD235а+/FShigh), анализировали на скатерограмме СD71/FS) (рис. 1, д). CD71+-ретикулоциты, предварительно очищенные от дебриса по FS/SS (рис. 1, е), в дальнейшем изучали на предмет наличия GPI-связанного белка CD59 (рис. 1, ж). На рис. 1, г и 1, з изображены статистические параметры в виде количества собранных событий в указанных гейтах, а также процент эритроцитов/ретикуло-цитов в гейтах относительно общего количества популяции эритроцитов и ретикулоцитов. Стоп-гейт (20 000 событий) выставлен по гейту CD71+.
Гейтирование и анализ ретикулоцитов с использованием тиазол оранжевого (ReticCount™, BD). Для окраски ретику-лоцитов периферическую кровь разводили в 10 раз. В промаркированную пробирку вносили 10 мкл суспензии эритроцитов и МКА к CD59 согласно инструкции. После инкубации 20 мин при комнатной температуре к образцу добавляли 500 мкл тиазол-оранжевого (реагент ReticCount). Далее проводили инкубацию с тиазол оранжевым в течение 60 мин в термостате при температуре 37°C . После инкубации клетки отмывали дважды PBS (4 мл) в режиме центрифугирования 5 мин с частотой 1500 об/мин. Готовый образец ресуспендировали, добавляли 750 мкл PBS и анализировали на цитометре.
На рис. 2 выделенную по FS/CC популяцию (STRUCT, рис. 2, а) далее оценивали на наличие РНК-содержащих клеток, окрашенных тиазол оранжевым (рис. 2, б) (в основной массе популяция представлена ретикулоцитами, но в гейт могут попасть также и мелкие по размеру лимфоциты, тельца Жолли и кольца Кебота). Популяция в гейте TO str (см. рис. 2, б) дополнительно очищалась по боковому светорассеиванию
(тиазол оранжевый, SS, рис. 2, в). В выделенной популяции ретикулоцитов определяли экспрессию CD59 и соответственно, наличие или отсутствие ПНГ-клона (рис. 2, г). Параллельно можно оценить ориентировочное значение клона на эритроцитах, выделенных по FS/SS (рис. 2, д).
Результаты и обсуждение. Из 160 пациентов, направленных на исследование ПНГ-клона, у 99 содержание рети-кулоцитов изучали на основании определения экспрессии CD71, у 9 использовали метод c Retic-Count (тиазол оранжевый). У 52 больных проводили параллельное исследование содержания ретикулоцитов обоими методами.
Из 86 пациентов с ПНГ-клоном у 9 исследование уровня ретикулоцитов проводили только при помощи BD ReticCount; у 51 изучали экспрессию CD71; у 26 провели параллельное исследование содержания ретикулоцитов обоими методами. Во всех случаях среди ретикулоцитов выявили ПНГ-клон, сопоставимый с таковым среди гранулоцитов и
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Рет, ТО PeT,CD71
п—........—I—........—I—........—I
Эритроциты Гранулоциты Моноциты
Рис. 3. Медианы значений ПНГ-клона ретикулоцитов при использовании тиазол оранжевого, CD71, а также медиана ПНГ-клона эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов. Рет — ретикулоциты.
Ф
27
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 7, 2014
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Рис. 4. Корреляционная зависимость между содержанием ре-тикулоцитов и лейкоцитов.
Ретикулоциты, гейтированные по CD71, показывают высокий коэффициент корреляции по отношению к гранулоцитам (а) и моноцитам (б). По оси абсцисс — размер (в %) ПНГ-клона среди ретикулоцитарной популяции (CD71). Здесь и на рис. 5 по оси ординат: а — размер (в %) ПНГ-клона среди гранулоцитов; б — размер (в %) ПНГ-клона среди моноцитов.
моноцитов. При отсутствии ПНГ-клона среди лейкоцитов сходные результаты получили и в популяции ретикулоцитов.
ПНГ-клон среди эритроцитов обычно разделяется на три подгруппы: I тип (нормальные клетки); II тип (частичный дефицит CD59); III тип (полный дефицит CD59).
При анализе содержания ретикулоцитов (при выделении любым способом) положительный ПНГ-клон чаще всего может быть оценен только в виде суммарной CD59-дефицитной или негативной популяции (II + III типы).
Медианы значений ПНГ-клонов среди гранулоцитах составляли 93,1 (0,1—99,5%); моноцитов 90,3 (0—99,3%); эритроцитов (II + III типы) 35,6 (0,2—91,4%); ретикулоцитов, выделенных по CD71, 87,6 (3,1—98,3%); ретикулоцитов, выделенных при помощи тиазол оранжевого, 57,4 (0,9—83,2%) (рис. 3).
Как показано на рис. 3, самое низкое значение медианы ПНГ-клона выявили в популяции эритроцитов, что объясняется их повышенным разрушением в сосудистом русле за счет комплементзависимого гемолиза. По сравнению с эритроцитами медиана ПНГ-клона ретикулоцитов, выделенных при использовании тиазол оранжевого, значительно выше. Медиана значений ПНГ-клона ретикулоцитов, выделенных с помощью CD71, больше совпадает с медианой ПНГ-клона моноцитов и гранулоцитов.
В работе провели корреляционный анализ соответствия значений ПНГ-клонов на гранулоцитах, моноцитах и рети-кулоцитах, оцененных с помощью обоих методов (рис. 4, 5).
Заключение. Согласно международному протоколу диагностики ПНГ [11], оценку патологического ПНГ-клона проводят среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов. Однако вследствие комплементопосредованного внутрисосудистого гемолиза и соответственно низкой продолжительности жизни, а также в связи с проведением частых гемотрансфузий истинный размер ПНГ-клона оценить не представляется возможным. В связи с этим мы провели исследование уровня
100 п
90-
80-
70-
60-
50-
40-
30-
20- • .
ю- 'в
0- -Г-
0 10
R =0,7095
20 30 40 50 60 70 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Рис. 5. Корреляционная зависимость между содержанием ре-тикулоцитов и лейкоцитов.
Ретикулоциты, гейтированные по тиазол оранжевому, показывают невысокий коэффициент корреляции по отношению к гранулоцитам (а) и моноцитам (б). По оси абсцисс — размер (в %) ПНГ-клона среди рети-кулоцитарной популяции.
ретикулоцитов как наименее подверженных гемолизу клеток красного ростка. В зарубежной литературе имеются немногочисленные исследования уровня ретикулоцитов [18—24]. Данные по использованию CD71 противоречивы. Так, авторы S. Serke и D. Huhn констатируют факт несостоятельности рецептора к трансферрину как маркера ретикулоцитов [21]. Однако в других источниках предлагается использовать этот маркер как подходящий для диагностики ПНГ [19, 20].
В работе N.J. Tsagarakis и соавт. [23] проведена оценка ПНГ-клона на ретикулоцитах у 15 больных с ПНГ и АА, выделенных с использованием CD71, и сопоставлена со значениями ПНГ-клона на гранулоцитах, выделенных с помощью CD66b/ CD16/CD45 и CD59/CD24/CD45 [22]. Размер ПНГ-клона среди ретикулоцитов и гранулоцитов оказался сопоставим. Полученные нами результаты сопоставимы с данными этих авторов как с использованием CD71, так и Retic-Count [24].
Таким образом, наши данные подтверждают возможность использования ретикулоцитов для оценки ПНГ-клона.
Из двух методов выделения популяции ретикулоцитов наиболее удобным является использование CD71 в качестве гейтирующего маркера. Методика использования реагента BD ReticCount подразумевает длительную инкубацию, а также отмывку проточной системы до и после проведения анализа, что неудобно. Кроме того, помимо РНК, реагент окрашивает и ДНК, поэтому в ретикулоцитарный гейт могут попасть включения эритроцитов, такие как тельца Жолли и кольца Кебота. По прямому ибоковому светорассеиванию в гейте также могут оказаться большие по размеру тромбоциты, лимфоциты, что изменяет процент определяемых клеток.
Таким образом, мы предложили исследовать для оценки ПНГ-клона ретикулоцитарную популяцию с использованием трехцветной комбинации МКА (CD71(APC)/CD235a (FITC)/ CD59(PE)). Такой подход позволяет уменьшить трудозатраты, провести скрининг и более точно оценить размер ПНГ-клона по сравнению с эритроцитами.
Ф
28
Продолжение статьи на стр. 40
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 6, 2014
ЛИТЕРАТУРА
1. Josten K.M., Tooze J.A., Borthwick-Clarke C., Gordon-Smith E.C., Rutherford T.R. Acquired aplastic anemia and paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: studies on clonality. Blood. 1991; 12: 3162—7.
2. Кулагин А.Д., Лисуков В.А., Козлов В.А. Апластическая анемия. Новосибирск: Наука; 2008.
3. Bessler M., Mason P.J., Hillmen P., Miyata T., Yamada N., Takeda J. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene. EMBO J. 1994; 13(1): 110—7.
4. Takeda J., Miyata T., Kazuyoshi Kawagoe, Yoshiyasu Lida, Yuichi Endo, Teizo Fujita et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemo-globinuria. Cell. 1993; 5: 703—11.
5. Ware R.E., Rosse W.F., Hall S.E. Immunophenotypic analysis of re-ticulocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1995; 86(4): 1586—9.
6. Parker C.J. Bone marrow failure syndromes: paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2009; 4: 333—46.
7. Jandl J.H. Physiology of red cells. In: Jandl J.H., ed. Blood: Textbook of Hematology. 1987.
8. Lee G.R., Bithell T.C., Foerster J., Athens J.W., Lukens J.N. Granulocytes-neutrophils. In: Wintrobe's Clinical Hematology. 1993; 9: 223.
9. Latour R.P., Mary J.Y., Salanoubat C., Terriou L., Etienne G., Mohty M. et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: Natural history of disease subcategories. Blood. 2008; 112: 3099—106.
10. Parker C., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R. Diagnosis and management of PNH. Blood. 2005; 12: 3699—709.
11. Borowitz J.M., Craig F.E., DiGiuseppe G.A., Illingworth A.J., Rosse W., Sutherland D.R. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry B. Clin. Cytom. 2010; 78B: 211—30.
12. Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. ASH Education Book. 2008; 1: 116—23.
13. Rosse W.F. Dr Ham's test revisited. Blood. 1991; 78(3): 547—50.
14. Oelschaegel U., Besson I., Arnoulet C., Sainty D., Nowak R., Naumann R. et al. A standardized flow cytometric method for screening paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) measuring CD55 and CD59 expression on erythrocytes and granulocytes. Clin. Lab. Hae-matol. 2001; 23(2): 81—90.
15. Van der Schoot C.E., Huizinga T.W., van't Veer-Korthof E.T. et al. Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane gly-coproteins of leukocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, description of a new diagnostic cytofluorometric assay. Blood. 1990; 76: 1853—9.
16. Hall S.E., Rosse W.F. The use of monoclonal antibodies and flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1996; 87: 5332—40.
17. Sutherland D.R., Kuek N., Azcona-Olivera J., Anderson T. et al. Use of a FLAER-Based WBC assay in the primary screening of PNH clones. Am. J. Clin. Pathol. 2009; 132(4): 564—72.
18. Lee L.G., Chen C.-H., Chiu L.A. Thiazole orange: A new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 1986; 7: 508.
19. Sato S., Kozuma Y., Hasegawa Y., Kojima H., Chiba S., Ninomya H. Enhanced expression of CD71, transferrin receptor, on immature reticulocytes in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Int. J. Lab. Hematol. 2009; 32: е 137—43.
20. Sato S., Hasegawa Y., Nagasawa T., Ninomiya H. Reticulocyte-gated flow cytometric analysis of red blood cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Lab. Hematol. 2006; 12(2): 82—5.
21. Serke S., Huhn D. Identification of CD71 (transfemn receptor) expressing erythrocytes by multiparameter-flow-cytometry (MP-FCM): Correlation to the quantitation of reticulocytes as determined by conventional microscopy and by MP-FCM using a RNA-staining-dye. Br. J. Haematol. 1992; 81: 432.
22. Serke S., Huhn D. Improved specificity of determination of immature erythrocytes (reticulocytes) by multiparameter flow-cytometry and thiazole orange using combined staining with monoclonal antibody (anti-glycophorin-A). Clin. Lab. Hematol. 1993; 15(1): 33—44.
23. Tsagarakis N.J., Paterakis J. A simple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. Cytometry Pt B. 2012; 82B: 259—63.
24. Hochmann B., Rojewski M., Schrezenmeier H. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuira (PNH): higher sensitivity and validity in diagnosis and serial monitoring by flow cytometric analysis of reticulocytes. Ann. Hematol. 2011; 90(8): 887—99.
40
REFERENCES
1. Josten K.M., Tooze J.A., Borthwick-Clarke C., Gordon-Smith E.C., Rutherford T.R. Acquired aplastic anemia and paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: studies on clonality. Blood. 1991; 12: 3162—7.
2. Kulagin A.D., Lisukov V.A., Kozlov V.A. Aplastic anemia. Novosibirsk: Nauka; 2008. (in Russian)
3. Bessler M., Mason P. J., Hillmen P., Miyata T., Yamada N., Takeda J. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene. EMBO J. 1994; 13(1): 110—7.
4. Takeda J., Miyata T., Kazuyoshi Kawagoe, Yoshiyasu Lida, Yuichi Endo, Teizo Fujita et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemo-globinuria. Cell. 1993; 5: 703—11.
5. Ware R.E., Rosse W.F., Hall S.E. Immunophenotypic analysis of re-ticulocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1995; 86(4): 1586—9.
6. Parker C.J. Bone marrow failure syndromes: paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2009; 4: 333—46.
7. Jandl J.H. Physiology of red cells. In: Jandl J.H., ed. Blood: Textbook of Hematology. 1987.
8. Lee G.R., Bithell T.C., Foerster J., Athens J.W., Lukens J.N. Granulocytes-neutrophils. In: Wintrobe's Clinical Hematology. 1993; 9: 223.
9. Latour R.P., Mary J.Y., Salanoubat C., Terriou L., Etienne G., Mohty M. et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: Natural history of disease subcategories. Blood. 2008; 112: 3099—106.
10. Parker C., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R. Diagnosis and management of PNH. Blood. 2005; 12: 3699—709.
11. Borowitz J.M., Craig F.E., DiGiuseppe G.A., Illingworth A.J., Rosse W., Sutherland D.R. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. CytometryB. Clin. Cytom. 2010; 78B: 211—30.
12. Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. ASH Education Book. 2008; 1: 116—23.
13. Rosse W.F. Dr Ham's test revisited. Blood. 1991; 78(3): 547—50.
14. Oelschaegel U., Besson I., Arnoulet C., Sainty D., Nowak R., Naumann R. et al. A standardized flow cytometric method for screening paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) measuring CD55 and CD59 expression on erythrocytes and granulocytes. Clin. Lab. Haematol. 2001; 23(2) :81—90.
15. Van der Schoot C.E., Huizinga T.W., van't Veer-Korthof E.T. et al. Deficiency of glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane glycoproteins of leukocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, description of a new diagnostic cytofluorometric assay. Blood. 1990; 76: 1853—9.
16. Hall S.E., Rosse W.F. The use of monoclonal antibodies and flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1996; 87: 5332—40.
17. Sutherland D.R., Kuek N., Azcona-Olivera J., Anderson T. et al. Use of a FLAER-Based WBC assay in the primary screening of PNH clones. Am. J. Clin. Pathol. 2009; 132(4): 564—72.
18. Lee L.G., Chen C.-H., Chiu L.A. Thiazole orange: A new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 1986; 7: 508.
19. Sato S., Kozuma Y., Hasegawa Y., Kojima H., Chiba S., Ninomya H. Enhanced expression of CD71, transferrin receptor, on immature reticulocytes in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Int. J. Lab. Hematol. 2009; 32: е137—43.
20. Sato S., Hasegawa Y., Nagasawa T., Ninomiya H. Reticulocyte-gated flow cytometric analysis of red blood cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Lab. Hematol. 2006; 12(2): 82—5.
21. Serke S., Huhn D. Identification of CD71 (transfemn receptor) expressing erythrocytes by multiparameter-flow-cytometry (MP-FCM): Correlation to the quantitation of reticulocytes as determined by conventional microscopy and by MP-FCM using a RNA-staining-dye. Br. J. Haematol. 1992; 81: 432.
22. Serke S., Huhn D. Improved specificity of determination of immature erythrocytes (reticulocytes) by multiparameter flow-cytometry and thiazole orange using combined staining with monoclonal antibody (anti-glycophorin-A). Clin. Lab. Hematol. 1993; 15(1): 33—44.
23. Tsagarakis N.J., Paterakis J. A simple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. CytometryPtB. 2012; 82B: 259—63.
24. Hochmann B., Rojewski M., Schrezenmeier H. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuira (PNH): higher sensitivity and validity in diagnosis and serial monitoring by flow cytometric analysis of reticulo-cytes. Ann. Hematol. 2011; 90(8): 887—99.
Поступила 16.01.14 Received 16.01.14
