CC BY
23DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-31-22-30 УДК 535.64:575.116.4:632.4:631.52
О. Г. Бабак1, Е. В Дрозд1, Н. А. Некрашевич1, Н. В. Анисимова1, К. К. Яцевич1, И. Е. Баева2, И. Г. Пугачева2, А. В. Французенок2, М. М. Добродькин2, А. В. Кильчевский1
ОЦЕНКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ТОМАТА (SOLANUM LYCOPERSICUM L.) К ФИТОФТОРЕ (PHYTOPHTHORAINFESTANS)
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академия наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: O.Babak@igc.by ^Учреждение образования «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» Республика Беларусь, 213407, Могилевская область, г. Горки, ул. Мичурина, 5
Оценена эффективность известных в литературе молекулярных маркеров аллелей резистентности к Phytophthora infestans с целью применения методов маркер-сопутствующей селекции (МАС) при создании устойчивых к фитофторозу гибридов и сортов томата. Установлена высокая эффективность выявления гомозиготных и гетерозиготных форм по генам Ph2 и Ph3 с помощью CAPS dTG63 (Hinfl) и SCAR NCLB-9-6678 маркеров соответственно. Адаптированы методики выделения ДНК, составы реакционных смесей, режимы амплификации и визуализации результатов. Показано наличие аллеля Ph3 в гибридах F1-стандартах Адапт и Аламина, в гибридах F1 Азарт, Агеньчик, Дзивосны, Блэк Бриллиант, внесенных в Реестр сортов Республики Беларусь, а также в селекционных линиях из коллекций Института генетики и цитологии НАН Беларуси и Белорусской государственной сельскохозяйственной академии.
Ключевые слова: томат, устойчивость к фитофторе, Phytophthora infestans, ДНК-маркеры.
Введение
Фитофтороз (late blight), вызываемый грибами класса Oomycetes рода Phytophtora, является наиболее опасной болезнью для ряда важнейших сельскохозяйственных культур во всем мире [1, 2]. В настоящее время грибы рода Phytophtora наносят ущерб картофелю; томату (P infestans); яблоне (P cactorum); сое (P. sojae) и другим растениям (P. ramorum, P. cinnamomi, P. palmivora) [3, 4, 5]. Появившись впервые на картофеле в 1840-х годах почти одновременно в США и Европе вследствие высокой внутрипопуляционной изменчивости, возбудитель Phytophthora infestans широко распространился и на томат, относящийся, как и картофель, к семейству пасленовых. Размножаясь половым и бесполым путем при высокой влажности (75-80%) или наличии капельной влаги, при умеренных температурах (15-25 °С), возбудитель при единичном начальном заражении может образовать несколько десятков тысяч спорангиев [6]. Дан-
ное свойство обеспечивает лавинообразный характер развития болезни. В благоприятных условиях окружающей среды болезнь может повредить все надземные части растений томатов в течение 7-10 дней [2] и привести к 100% потере урожая [6]. Phytophthora infestans уже около 170 лет является объектом изучения ботаников, физиологов, фитопатологов, генетиков и селекционеров. Однако и в третьем тысячелетии сохраняется потенциальная опасность эпифитотии фитофтороза.
Сохранение урожая томата от грибных болезней осуществляется двумя основными путями — посредством применения защитных препаратов (преимущественно фунгицидов) и отбором устойчивых растений. Применение фунгицидов может приводить к негативным экологическим последствиям, в частности, к изменению состава почвенных микроорганизмов или появлению агрессивных рас возбудителя, устойчивых к используемым препаратам. В литературе представлен ряд публикаций,
описывающих появление новых штаммов Ph. infestans, преодолевающих защиту, создаваемую применяемыми фунгицидами [7, 8].
Генетическая устойчивость растений-хозяев является важнейшим способом защиты от патогенов. Поиск устойчивых форм долгие годы осуществлялся с использованием различных фитопатологических методов при полевой и лабораторной оценках. С развитием молекулярного анализа неоспоримую роль стал играть направленный поиск ценных генов, контролирующих устойчивость к болезням. К настоящему моменту описаны три основных гена устойчивости к фитофторозу: Phi, Ph2 и Ph3, установлена их локализация на 7, 10 и 9 хромосомах соответственно, описаны их источники в диких формах и культурном томате [9, 10], изучена структура устойчивых и неустойчивых аллелей [11, 12], разработаны молекулярные маркеры для типирования форм на наличие устойчивых аллелей Ph2 и Ph3 [13, 14]. Согласно литературным данным, ген Ph2 является эффективным против расы T-1 P infestans, и чаще его ассоциируют со снижением скорости распространения заболевания [15]. Самым сильным геном устойчивости из вышеописанных является Ph3, который в доминантном состоянии обеспечивает устойчивость к широкому спектру изолятов Ph. infestans [16]. Анализ его первичной структуры показал, что он кодирует CC-NBS-LRR (coiled-coil nucleotide-binding leucine-rich repeat) — белок, который принадлежит к обширному классу NBS-LRR растительных R-генов [17]. Однако даже этот ген не обеспечивает устойчивости к высокоагрессивным изолятам фитофтороза. Наиболее эффективным считается сочетание двух генов Ph2 и Ph3, которые были объединены в ряде товарных сортов с использованием разработанных ДНК-маркеров [17, 18].
Наряду с данными тремя генами, используемыми в селекции, в настоящее время продолжается поиск новых источников устойчивости к фитофторозу. Имеются данные о выявлении новых генов устойчивости. Так, С. Kole с соавторами [19] сообщают о выявлении гена Ph4, расположенного на хромосоме 2 у дикого вида S. harbrochaites; Н. Merk c соавторами [20] — о новых источниках устойчивости Ph5-1 и Ph5-2, расположенных на первой
и десятой хромосомах соответственно. Однако сведений о разработке к ним маркеров и создании сортов S. lycopersocum, несущих указанные гены, пока нет.
В связи с этим целью наших исследований являлись апробация и адаптация известных SCAR маркеров к генам устойчивости к фитофторозу Ph2 и Ph3, оценка селекционного материала, используемого белорусскими селекционерами, а также вовлечение аллелей устойчивости в новые создаваемые сорта и гибриды для защищенного и открытого грунта.
Материалы и методы исследования
В качестве исследуемого материала использовались образцы томата для открытого и защищенного грунта коллекций Института генетики и цитологии НАН Беларуси и Белорусской государственной сельскохозяйственной академии: сорта, гибриды F отборы из популяций F2-F6, а также коммерческие сорта и гибриды, используемые в качестве стандартов при оценке образцов томата в государственном сортоиспытании.
Коллекция открытого грунта включала следующие образцы: гибрид Fj Адапт, 30 гибридов Fj, полученных по схеме топкросса, сорта Ирма, Zafar, Доходный, Желтый жемчуг, Спажытак, Звездопад, Дивиденд, Источник, Корнет, Клондайк, Акварель, 67 селекционных линий F-F0.
5 о
Коллекция образцов для защищенного грунта включала следующие формы крупноплодного томата и томата черри: гибриды Fj Евро, Старт, Аламина, Александр, Азарт, Дзивосны, Блэк бриллиант, Беларуски малинавы, Индиго х 19/19-6, сорта Никола, Иришка, Индиго, Малиновый коктейль, Линия 14, Линия-94, Линия ТХ-140, Линия ТХ-144, Линия Б-3-1-8, Линия-4, Линия С-9464, Линия 19/0, Линия 19/3, Линия-2, Линия-9 (Fj), № 20/2021 (F7), 4 популяции F5-F6 томата черри на основе ФМС, популяции F2 T39 и T40.
Выделение ДНК проводили с использованием набора для выделения ДНК из растительного материала комплектации С компании «Прайм-тех» согласно протоколу производителя.
При апробации молекулярных маркеров, представленных в таблице 1, использовали реактивы, предлагаемые белорусскими компаниями. Для приготовления 15 мкл апробаци-
онной реакционной ПЦР смеси использовали: 50 нг ДНК, 250 нМ каждого из пары прайме-ров, 200 нМ dNTP, 7,5 мкл 2х PCR буфера для Tornado ДНК-полимеразы, 0,2 мкл Tornado ДНК-полимеразы («Праймтех», «АртБиоТех») (2и/мкл). Апробационный режим проведения
Отобранные маркеры и выделенные устойчивые формы использовали для создания ценных гибридов и нового селекционного материала с комплексом аллелей хозяйственно-важных признаков.
Результаты и обсуждение
Для апробации и адаптации способа ДНК-типирования аллелей гена Ph-2 нами использован предложенный американской группой авторов (D. Panthee с соавт., 2012) CAPS маркер dTG63 (Hinfl) [21], который позднее применили корейские исследователи (J. M. Lee
амплификации включал следующие этапы: 1-й этап: 92 °С — 15 мин; П-й этап: 35 циклов: 99 °С — 4 с; 52-55 °С — 30 с; 68-72 °С — 1 мин; Ш-й этап: 72 °С — 5 мин; ГУ-й этап: 16 °С — 2 мин. Оценка продуктов амплификации проводилась методом электрофореза в 2% агарозном геле.
с соавт., 2015) [14] (табл. 1). После амплификации с использованием апробационной смеси и режима ПЦР был получен ожидаемый фрагмент размером 246 пар нуклеотидов (п. н.). Реакционная смесь для рестрикции (5 мкл) включала: 2,5 мкл ампликона; 0,5 мкл R буфера; 0,2 мкл рестриктазы НшД; 1,8 мкл Н20. Инкубирование проводили при 37 °С 16 часов. После рестрикции ПЦР-продукты устойчивых форм оставались неразрезанными, а продукты восприимчивых форм разрезались на фрагменты длиной 220 и 26 п. н.
Электрофоретическое разделение продуктов
Таблица 1
Наименование и характеристика маркеров, используемых для ДНК-типирования аллелей
устойчивости к фитофторе
Ген, хромосома Литературный источник Тип и название маркера Праймеры, рекомендуемая полимераза для ПЦР Температура отжига, °С Ожидаемые фрагменты, R/S, п. н.
Ph-2, хромосома 10 D. Panthee, 2012; J. M. Lee, 2015 *CAPS, dTG63 (Hinfl) F: CTACTCTTTCTATGCAATTTGAATTG R: AATAATTTTCAACCATAGAATGATT, Tornado ДНК-полимераза 55 246 / 220
Ph-3, хромосома 9 H. Jung Kim, 2015: J. M. Lee, 2015 SCAR, Ph3-SCAR F: CTACTCGTGCAAGAAGGTAC R: TCCACATCACCTGCCAGTTG, Tornado ДНК-полимераза 55 176 / 154
D. Panthee, 2015 SCAR, NCLB-9-6676 F: ACAGAAAAGTGCACGAAGTT R: ATTTGAATGTTCTGGATTGC, Taq-полимераза 52 1000 / 1300
SCAR, NCLB-9-6677 F: AAAGCCAATACCTTAGCACA R: ATTCAACGGTCAAAAACTTG, Taq-полимераза 52 1000 / 1250
*SCAR, NCLB-9-6678 F: CCTTAATGCAATAGGCAAAT R: ATTTGAATGTTCTGGATTGG, Tornado ДНК-полимераза 52 600 / 900
SCAR, NCLB-9-6679 F: TCGGCTTATAGAAAAGCAAC R: CGGAGAACAGTTTTGAACTC, Taq-полимераза 52 1000 / 1200
Примечание. * — маркеры, рекомендуемые по результатам апробации
ПЦР проводили в агарозном геле плотностью 2%. Гель помещали в электрофоретическую камеру с TAE буфером таким образом, чтобы гель был погружен в буфер на 5 мм. В каждую дорожку геля вносили по 6 мкл продукта ПЦР, для оценки размера применяли маркер молекулярного веса GeneRulerTM 100 bp (Thermo Scientific).
С использованием ДНК-маркера dTG63 было оценено 58 различных образцов. Однако устойчивый фрагмент был обнаружен в гетерозиготном состоянии только у образца По-
иск 21/21 (рис. 1А, № 18, 19). Для установления более четкой разницы между фрагментами разгонка продуктов амплификации также проводилась в геле с MetaPhor-агарозой и маркером молекулярного веса с шагом GeneRulerTM 50 bp (Thermo Scientific) (рис. 1Б). Данный способ позволил выявить у образца МК1 наличие двух близких по размеру рестрикционных фрагментов, что говорит о возможном наличии иного аллеля Ph-2.
Апробация способов выявления аллелей гена Ph-3 проводилась с применением пяти
Рис. 1. Продукты рестрикции гена Ph-2: М — маркер молекулярного веса (100 bp (А) и 50 bp (Б)) А: 1, 2 — Ирма; 3 — 1272-1 (F7); 4 — 1272-6 (F7); 5-7 — С9464 х Иришка F1; 8 — Т39-3; 9 — Т39-7; 10-12 —
д. 71; 13-15 — д. 108; 16, 17 — Поиск 12/21; 18, 19 — Поиск 21/21; 20, 21 — Т1/2 нм; 22, 23 -ВИР6 (Сливка
красная); 24, 25 — ВИР56 (Индиго); 26 — ВИР57 (Gold berries); Б: 1, 2 —19/19-5 (F6); 3, 4 — 19/19-6 (F6); 5 — МК1; 6 — МК2; 7, 8 — Агеньчык; 9, 10 — Старт (Fj); 11, 12 — Дзивосны; 13, 14 — Блэк бриллиант; 15, 16 — Линия4; 17б, 18 — Индиго х 19/19-6 (Fj)
маркеров, разработанных двумя исследовательскими группами: Ph3-SCAR (H. Jung Kim, 2015) [11], SCAR NCLB-9-6676, NCLB-9-6677, NCLB-9-6678, NCLB-9-6679 (D. Panthee с со-авт., 2015) [14], (табл. 1). Данные маркеры разработаны на основе отличий в структуре устойчивых и восприимчивых аллелей 3 InDel (11 п. н., 11 п. н., 56 п. н.) и SNP G/A [11].
При использовании Ph3-SCAR маркера апробационные условия ПЦР показывали наличие ожидаемых фрагментов: ампликоны размером 176 и 154 п. н., свидетельствующие о наличии признака устойчивости и восприимчивости к фитофторе соответственно. Однако разгонка достаточно близких по размеру продуктов в обычном агарозном геле (рис. 2А) не давала четкой картины, в отличие от разгонки продуктов амплификации в геле с MetaPhor-агарозой (рис. 2Б).
При амплификации с маркерами NCLB-9-6676 и NCLB-9-6677, согласно авторам, ожидались фрагменты 1 000 и 1 300/1 250 п. н., свидетель-
ствующие о наличии признака устойчивости и восприимчивости к фитофторе соответственно [14]. При апробационных условиях (с использованием ДНК-полимеразы Tornado) амплификация практически не проходила. Возможно, это связано с большим размером ПЦР-продукта, который сложен для синтеза ПЦР-полимеразой Tornado.
Результаты применения реакционной ПЦР смеси Mix 5x Евроген (с использованием Taq-полимеразы) показали синтез фрагмента размером в 1 000 п. н., при этом более крупные фрагменты не выявлялись. На рисунке 3 показаны результаты электрофореза продуктов амплификации с SCAR маркером NCLB-9-6677.
Продукты амплификации с данным маркером имели отличные от ожидаемых размеры: около 300 и 1 000 п. н. (рис. 3). При сопоставлении с результатами, полученными с другими маркерами, наличием ампликонов размерами 300 и 1 000 п. н. характеризовались восприимчивые формы, у устойчивых наблюдался
м 1 А 2 3 4 5 6 7 t 9 10 LI 12 М
200 100 Б 300 IOC
г« 200
1W
Рис. 2. Продукты амплификации ДНК образцов с Ph3-SCAR маркером в обычном агарозном геле (А) и в геле с MetaPhor-агарозой (Б): М — маркер молекулярного веса (100 bp DNA ladder (BRL)); 1-3 — Ирма; 4-9 дел. 1272
2020 БГСХА; 10-12 — С9464 х Иришка (Ft)
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М
* Л J™.
J00 100 J00 100
Рис. 3. Продукты амплификации ДНК образцов с SCAR маркером NCLB-9-6677: М — маркер молекулярного веса массы (100 bp); 1 — отрицательный контроль; 2-9 — дел. 1272 2020 БГСХА (F7); 10, 11 — Ирма; 12, 13 — Ред Грант
продукт размером 1 000 п. н., при этом выявить гетерозиготные формы не представлялось возможным.
При амплификации с маркером NCLB-9-6678, согласно авторам, ожидались фрагменты 600 и 900 п. н., свидетельствующие о наличии при-
знака устойчивости и восприимчивости к фитофторе, соответственно [14]. В результате амплификации с апробационной ПЦР-смесью (рис. 4), а также смесью с использованием Taq -полимеразы (рис. 5) были получены заявленные автором фрагменты. Данный маркер, как
Рис. 4. Продукты амплификации ДНК образцов с SCAR маркером NCLB-9-6678: М — маркер молекулярного веса массы (100 bp); 1 — Агеньчык; 2 — 19/19-6; 3 — Индиго х 19/19-6 (Fj); 4 — № 20/2021 (F7); 5, 6 — № 86/2021 (F6); 7, 8 — № 87/2021 (F6); 9, 10 — Аламина (F^; 11, 12 — Старт (F^; 13, 14 — № 1/2021 (Блэк бриллиант); 15,
16 — № 14/2021 (Дзивосны)
Рис. 5. Продукты амплификации ДНК образцов с SCAR маркером NCLB-9-6678: М — маркер молекулярного веса (100 bp); 1 — Линия 16-8; 2 — Zafar; 3 — Линия 217; 4 — Линия 221; 5 — Линия 19-652; 6 — Корнет; 7
— Желтый жемчуг; 8 — Линия 1476; 9 — Линия 1477; 10 — Fj Азарт; 11 — Линия 19-651; 12-Fj Адапт; 13
— Линия 19-609; 14 — Fj Линия 16-8 х Желтый жемчуг; 15 — Линия 16-8 х Ирма; 16 — Линия 16-8 х Линия
217; 17 — Линия 16-8 х Линия 221
наиболее удобный (четко различимые фрагменты, меньшее время для амплификации), был использован для ДНК-типирования основного исследуемого материала. На рисунках 4 и 5 представлены частичные результаты по выявлению аллелей гена Ph-3 у образцов для защищенного и открытого грунта.
Амплификация с маркером NCLB-9-6679 выполнялась с использованием Mix 5x Евро-
ген. В результате электрофоретической разгонки продуктов были выявлены ожидаемые фрагменты 1 000 и 1 200 п. н., свидетельствующие о наличии признака устойчивости и восприимчивости к фитофторе, соответственно. На рисунке 6 представлены частичные результаты оценки линейного материала с данным маркером.
В результате апробации представленных
М 1 2 3 4 5 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М
1000 - jjj^
¿3 шт
JOO •м
Рис. 6. Продукты амплификации гена Ph-3 с SCAR маркером NCLB-9-6679: М — маркер молекулярного веса (100 bp); 1, 2 — Линия 19-647; 3, 4 — Линия 19-606; 5, 6 — Линия 19-657; 7, 8 — Линия 19-628; 9, 10 — Линия 1272-4,6; 11, 12 — Штамбовый № 128; 13, 14 — Линия-94; 15, 16 — Линия 19-508; 17, 18 — Линия 19-650
в литературе маркеров, как наиболее эффективные для скрининга образцов нами рекомендованы CAPS dTG63 (HinfX) маркер для выявления аллелей гена Ph2 и SCAR NCLB-9-6678 маркер для выявления аллелей гена Ph3 в гомозиготном и гетерозиготном состоянии.
С помощью данных маркеров выявлены источники аллеля устойчивости к фитофторе гена Ph3 в образцах С9464, ТХ-140, Индиго, используемых в селекции форм для защищенного грунта и гибридах, созданных с их участием: Азарт, Агеньчык, Дзивосны, Блэк Бриллиант. У гибрида-стандарта Аламина выявлен данный ген в гетерозиготном состоянии. Среди образцов для открытого грунта источника-
ми аллеля Ph3 являются Корнет, Желтый жемчуг, Линия 1476, Линия 1477, гибрид Адапт.
В настоящее время выбранные маркеры используются при создании образцов с комплексом хозяйственно ценных аллелей.
Так созданы 7 линий томатов черри с различным сочетанием аллелей устойчивости: к нематоде (Mi-1.2), фузариозу (I-2), кладо-спориозу (Cf4, Cf9), фитофторозу (Ph3); качества плодов: лежкости плодов (nor), накопления проликопина (t), ликопина и каротина (b); функциональной мужской стерильности (ps-2 и Ps-2) для создания гибридов F
В 2021 году с целью создания форм томата на основе ФМС для открытого и защищен-
ного грунта с сочетанием аллелей Beta гена липопин-Р-циклазы (CYCB), обеспечивающего высокий синтез Р-каротина и комплексную устойчивость к болезням, отобраны в результате ДНК-типирования по шести хозяйственно ценным аллелям (B/b, hp2dg, Sp/sp, ps-2/Ps-2, Cf5, Ph3) из 123 образцов популяции Т40 F2 С9464 х ЛВР^ (B//hp2dg) образцы с гомозиготным сочетанием аллелей B/hp2dg/sp/ps2/Cf5/ Ph3, b/hp2dg/sp/ps2/Cf5/Ph3, B/hp2dg/sp/Ps2/Cf5/ Ph3, b/hp2dg/sp/Ps2/Cf5/Ph3. Данные формы будут использованы в дальнейшем селекционном процессе, направленном на создание форм с высоким качеством плодов и устойчивостью к патогенам.
Заключение
Таким образом, в результате выполненных исследований установлена высокая эффективность выявления гомозиготных и гетерозиготных форм по генам Ph2 и Ph3 с помощью CAPS dTG63 (Яш/1) и SCAR NCLB-9-6678 маркеров соответственно. Адаптированы методики выделения ДНК, составы реакционных смесей, режимы амплификации и визуализации результатов. Показано наличие аллеля Ph3 в гибридах Fj-стандартах Адапт и Аламина, в гибридах Fj Азарт, Агеньчык, Дзивосны, Блэк Бриллиант, внесенных в Реестр сортов Республики Беларусь, а также в селекционных линиях из коллекций Института генетики и цитологии НАН Беларуси и Белорусской государственной сельскохозяйственной академии. При этом, возможно, в ряде форм стандартов или исследуемых форм присутствуют отличные от типируемых Ph2 и Ph3 аллелей иные источники устойчивости.
Список использованных источников
1. Fry W. Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer / W. Fry - Molecular plant pathology. - 2008. - Vol. 9. - №. 3. - P. 385-402.
2. Potato and tomato late blight caused by Phytophthora infestans: an overview of pathology and resistance breeding / Nowicki M. [et al.]. - Plant disease. - 2012. - Vol. 96. - №. 1. - P. 4-17.
3. Epidemiological risk assessment using linked network and grid based modelling: Phytophthora ramorum and Phytophthora kernoviae in the UK / Harwood T. D. [et al.]. - Ecological Modelling. - 2009. - Vol. 220. - №. 23. - P. 3353-3361.
4. Camilo-Alves C. S. Decline of Mediterranean oak trees and its association with Phytoph-thora cinnamomi: a review / C. S. Camilo-Alves, M. I. Esteves da Clara, N. M. Ribeiro // European Journal of Forest Research. - 2013. - № 132. -Р. 411-432.
5. Involvement of Phytophthora spp. in chestnut decline in the Black Sea region of Turkey / Akilli S. [et al.]. - Forest Pathology. - 2012. -№ 42. - P. 377-386.
6. Поликсенова В. Д. Микозы томата: возбудители заболеваний, устойчивость растений: монография / В. Д. Поликсенова. - Минск: БГУ - 2008. - 159 с.
7. Response of accessions within tomato wild species, Solanum pimpinellifolium to late blight / Foolad M. R. [et al.]. - Plant Breeding. - 2014. - Vol. 133. - №. 3. - P. 401-411.
8. Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato / Chunwongse J. [et al.]. - The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. - 2002. - Vol. 77. - № 3. -P. 281-286.
9. Late blight resistance in four wild tomato accessions: effectiveness in diverse locations and inheritance of resistance / Black L. L. [et al.]. -Phytopathology. - 1996. - Vol. 86. - №. 11. -P. 24.
10. Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora in-festans in tomato / Moreau P. [et al.]. - Molecular Plant-Microbe Interactions. - 1998. - Vol. 11. -№. 4. - P. 259-269.
11. Gene-based molecular marker system for multiple disease resistances in tomato against Tomato yellow leaf curl virus, late blight, and verticillium wilt / Jung J. [et al.]. - Euphytica. -2015. - Vol. 205. - №. 2. - P. 599-613.
12. Jia M., Foolad M. R. Genetic analysis of late blight resistance in a new RIL population of tomato derived from LB resistant Solanum pimp-inellifolium accession PI 270443 / M. Jia, M. R. Foolad. - Plant Breeding. - 2020. - Vol. 139. -№ 3. - P. 651-659.
13. Lee J. M. Molecular markers for selecting diverse disease resistances in tomato breeding programs / J. M. Lee, C. S. Oh, I. Yeam. - Plant Breeding and Biotechnology 2015. - Vol. 3. -P. 308-322.
14. Molecular markers associated with Ph-3 gene conferring late blight resistance in tomato /
Panthee D. R. [et al.]. - American Journal of Plant Sciences. - 2015. - Vol. 6. - №. 13. - P. 2144.
15. Ohlson E. W. Identification and mapping of late blight resistance quantitative trait loci in tomato accession PI 163245 / E. W. Ohlson, H. Ashrafi, M. R. Foolad. - The plant genome. -2018. - Vol. 11. - №. 3. - doi.org/10.3835/plant-genome2018.01.0007.
16. Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato / Chunwongse J. [et al.]. - The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. - 2002. - Vol. 77. - №. 3. -P. 281-286.
17. The Ph-3 gene from Solanum pimpinelli-folium encodes CC-NBS-LRR protein conferring resistance to Phytophthora infestans / Zhang C. [et al.]. - Theor. Appl. Genet. -2014.- Vol. 127. - P. 1353-1364.
18. Marker-assisted selection for coupling
phase resistance to tomato spotted wilt virus and Phytophthora infestans (late blight) in tomato / Robbins M.D. [et al.]. - HortScience. - 2010. -Vol. 45. - P. 1424-1428.
19. Identification and molecular mapping of a new R gene, Ph-4, conferring resistance to late blight in tomato / Kole C. [et al.]. - Solanaceae Conference, University of Wisconsin, Madison, Abstract. - 2006. - Vol. 449.
20. Merk H. L. Parent-offspring correlation estimate of heritability for late blight resistance conferred by an accession of the tomato wild species Solanum pimpinellifolium / H. L. Merk, M. R. Foolad - Plant Breeding. - 2012. - Vol. 131. -№. 1. - P. 203-210.
21. Panthee D. R. A reexamination of molecular markers for use in marker-assisted breeding in tomato/ Panthee DR, Foolad MR.- Euphytica. - 2012. - Vol. 184, P.165-179.
O. G. Babak1, E. V. Drozd1, N. A. Nekrashevich1, N. V. Anisimova1, K. K. Yatsevich1, I. E. Bayeva2, A. V. Frantsuzionak2, I. G. Pugachova2, M. M. Dobrodkin2, A. V. Kilchevsky1
ASSESSMENT AND APPLICATION OF MOLECULAR MARKERS IN BREEDING FOR THE RESISTANCE OF TOMATO (SOLANUM LYCOPERSICUM L.) TO LATE BLIGHT (PHYTOPHTHORA INFESTANS)
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: O.Babak@igc.by 2Belarusian State Agricultural Academy, 5 Michurin St., 213407 Gorki, Republic of Belarus
In order to use marker-assisted selection (MAS) methods in the development of hybrids and tomato varieties resistant to late blight, the efficiency of molecular markers to the alleles resistant to Phytophthora infestans known in the literature was assessed. High efficiency in the identification of homozygous and heterozygous forms using CAPS dTG63 (Hinf1) and SCAR NCLB-9-6678 markers to Ph2 and Ph3 alleles was established respectively. DNAextraction techniques, reaction mixture compositions, as well as amplification and visualization result modes were adapted. The presence of the Ph3 allele in F1-standard Adapt and Alamina hybrids, and F1 Azart, Agenchik, Dzivosny, and Black Brilliant hybrids included in the Register of Varieties of the Republic of Belarus, as well as in the breeding lines of the collections possessed by the Institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus, and the Belarusian State Agricultural Academy was demonstrated.
Keywords: tomato, late blight resistance, Phytophthora infestans, DNA markers.
Дата поступления в редакцию: 27 сентября 2021 г.
