ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ ОВСА ПОСЕВНОГО AVENA SATIVA L. C ПОМОЩЬЮ SSR-АНАЛИЗА Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 633.13:575.22

Н. И. Дубовец, Е. А. Сычёва, А. В. Соколюк, Е. Б. Бондаревич, Л. А. Соловей

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ ОВСА ПОСЕВНОГО AVENA SATIVA L. С ПОМОЩЬЮ SSR-АНАЛИЗА

Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: N.I.Dubovets@igc.by

Проведен анализ полиморфизма 13 SSR-локусов у 22 сортов овса посевного, разделенных в зависимости от происхождения на 4 группы: белорусские, европейские, прибалтийские и российские сорта. В общей сложности в исследованном материале идентифицировано 114 аллелей, из которых в белорусских сортах присутствовало 83, в европейских — 54, в прибалтийских — 67 и в российских — 51 аллель. Выявлены наиболее полиморфные локусы АМ4, АМ14 и AM7, в которых в общей выборке сортов определено наличие 27, 17 и 16 аллелей соответственно. Эти же локусы характеризовались высоким уровнем гетерозиготности в пределах каждой отдельно взятой группы сортов, на основании чего можно сделать вывод, что анализ аллельного состава данных локусов может быть использован для дифференциации генетически близких генотипов. В сортах белорусской и европейской селекции высокополиморфным был также локус АМ11. Показано, что по уровню генетической изменчивости белорусские сорта не отличаются от зарубежных.

Ключевые слова: овес посевной, молекулярные маркеры, полиморфизм SSR-локусов, генетическая изменчивость.

Введение

Овес посевной (Avena sativa L.) по сумме посевных площадей в мире занимает пятое место после пшеницы, риса, кукурузы и ячменя и является одной из самых значимых зернофуражных культур. Столь высокая популярность культуры в животноводстве объясняется повышенным содержанием и наилучшим соотношением в белке ряда незаменимых аминокислот, особенно лизина и триптофана, богатым составом витаминов (B1, B2) и минеральных веществ, а также хорошими энергетическими свойствами благодаря высокому содержанию жира [1].

Широкое применение нашел овес и в пищевой промышленности (овсяная крупа, хлопья, мука, толокно и др.), что связано с хорошей усвояемостью содержащихся в нем питательных веществ.

С давних времен используют овес и в медицине, как народной, так и традиционной, причем в последние десятилетия несомненная польза овса для здоровья человека получила научное обоснование. Так, было установлено, что содержащиеся в зерне и растворимой клетчатке овса Р-глюканы снижают уровень холестерина

с низкой плотностью (ЛИНИ) в крови, способствуя тем самым уменьшению риска сердечнососудистых заболеваний [2]. Высокое содержание в овсе растворимой клетчатки способствует замедлению пищеварения и, следовательно, профилактике и лечению ожирения. Кроме того, овес содержит много соединений, проявляющих антиоксидантную активность [3]. В связи с этим ожидается, что спрос на овес во всем мире будет постоянно расти.

В Беларуси под посевами овса в 2019 году было занято 153,8 тысячи гектаров, что на 8 тысяч гектаров больше, чем в 2018, причем 99% посевной площади было засеяно высокоурожайными сортами отечественной селекции, созданными в НИЦ НАН Беларуси по земледелию. Средняя урожайность этих сортов в государственном сортоиспытании составляет 60-65 ц/га, а максимальная — 95-101 ц/га, однако в полевых условиях она значительно ниже (25,4 ц/га в 2019 году), что главным образом связано с негативным влиянием абиотических и биотических факторов среды [4]. Из этого следует, что для полного раскрытия достигнутого потенциала продуктивности не-

обходимо сосредоточить усилия на повышении устойчивости сортов к стрессовым факторам. Для решения этой задачи целесообразно использовать широкий пул генетических ресурсов из других регионов мира, оценив при этом уровень генетического разнообразия отечественных сортов в сравнении с сортами из других селекционных программ с привлечением современных методов ДНК-маркирования селекционного материала. Исходя из этого мы поставили перед собой цель провести анализ генетической изменчивости сортового генофонда Avena sativa L. различного эколого-гео-графического происхождения путем изучения полиморфизма SSR локусов. В данной статье представлены результаты исследования возделываемых в Республике Беларусь сортов овса, а также ряда сортов из близлежащих стран.

Материалы и методы

В исследование были включены 22 сорта овса посевного, из которых половину составляли сорта белорусской селекции (Полонез, Стра-лец, Багач, Вандроуник, Юбиляр, Крепыш, Зо-лак, Гоша, Факс, Дебют и Королек), остальные 11 сортов были условно сгруппированы по регионам следующим образом: 3 сорта (Каньон, Скорпион и Чакал) — европейской селекции, 4 сорта (Villu, Jaak, Ка lie и Stendes Darta) — при-

балтийской селекции и 4 сорта (Буцефал, Дерби, Факир и Конкур) — российской селекции.

Выделение ДНК из зерновок осуществляли с помощью готовых наборов реактивов «Genomic DNA Purification Kit» К0512 («Fermentas», Литва) согласно рекомендованному протоколу. Анализ генетического разнообразия сортов овса проводился с использованием 13 SSR-маркеров из серии АМ, разработанной Ли с коллегами [5]. Перечень маркеров и нуклео-тидные последовательности праймеров к ним представлены в таблице 1.

Для проведения ПЦР была использована следующая программа: 5 мин при 94 °С; 34 цикла с параметрами: денатурация в течение 30 с при температуре 94 °С; отжиг праймеров в течение 45 с при температуре 47,5 °С для маркера AM42, при 55 °С для маркеров AM14, AM22, AM 25, AM38, АМ53, AM83, при 60 °С для маркеров AMI, AM7, AM4, АМ11, AM15, AM30, элонгация при 72 °C в течение 90 с; конечная элонгация при 72 °C 7 мин.

Общий уровень качества прохождения реакции оценивали разделением продуктов ПЦР электрофорезом в 1,5% агарозном геле в 1*ТАЕ буфере в течение 60 мин при напряжении в 80 В. Для точного определения размера амплифици-руемых фрагментов был проведен стандартный фрагментный анализ с использованием

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров к исследованным микросателлитным локусам овса посевного

SSR-маркер F - прямой праймер (5' ^ 3') R - обратный праймер (5' ^ 3')

AM1 F: GGATCCTCCACGCTGTTGA R: CTCATCCGTATGGGCTTTA

AM4 F: GGTAAGGTTTCGAAGAGCAAAG R: GGGCTATATCCATCCCTCAC

AM7 F: GTGAGCGCCGAATACATA R: TTGGCTAGCTGCTTGAAACT

АМ11 F: CGTGGCAGAGAATCAAAGACAC R: TGGGTGGAGGCAAAAACAAAAC

AM14 F: GTGGTGGGCACGGTATCA R:TGGGTGGCGAAGCGAATC

AM15 F: GTGACCGTAAACGATAACAAC R: AAGCAAGACGCGAGAGTAGG

AM22 F: ATTGTATTTGTAGCCCCCAGTTC R: AAGAGCGACCCAGTTGTATG

АМ25 F: AGCCTGGACATGTAATCTGGT R: AGCCCTGGTCTTCTTCAACA

АМ30 F: TGAAGATAGCCATGAGGAAC R: GTGCAAATTGAGTTTCACG

АМ38 F: TGATGACCTCTTGAGTAAGCA R: TGCCTTTCGTGGACTTACTA

АМ42 F: GCTTCCCGCAAATCATCAT R: GAGTAAGCAAAGGCCAAAAAGT

AM53 F: TCGCCATTAATAAGAGGGAAGG R: GCTGCTGTTGGGTGGTTAGTG

AM83 F: CACTGCCATACATTCTGTCG R:CCTCTACCGCAAAGGAAGAA

автоматического секвенатора Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems (США). Размер продуктов амплификации определяли с применением размерного стандарта молекулярного веса S450 «Синтол» (Россия). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ GeneMapper Software Version 4.1.

Для оценки уровня генетической изменчивости сортов использовался такой показатель, как ожидаемая гетерозиготность, или генетическое разнообразие по Неи (Не) [6], вычисляемый по формуле:

Н = 1 - Ух 2

е г

где xi — частота i-того аллеля.

Результаты и обсуждение

В общей выборке сортов в исследованных 13 SSR-локусах было выявлено 114 аллелей, из которых в белорусских сортах присутствовало 83, в европейских — 54, в прибалтийских — 67 и в российских — 51 аллель. При этом 13 из 83 выявленных в белорусских сортах аллелей не встречались в сортах остальных групп, для которых, в свою очередь, отличными от белорусских были 23 аллеля.

Как видно из данных таблицы 2, не все проанализированные локусы оказались полиморфными. Так, в локусе АМ15 у всех исследован-

ных сортов выявлялся только один фрагмент длиной 229 п. н. Также один аллель размером 151 п. н. был отмечен в локусе АМ38.

Локус АМ83 был полиморфным (содержал 2 аллеля) только у белорусских и российских сортов (рис. 1), причем у первых явное преимущество по частоте встречаемости имел аллель размером 187 п. н. (73%), в то время как у вторых — 188 п. н. (75%). Европейские и прибалтийские сорта содержали одинаковый аллель размером 187 п. н.

Отсутствием полиморфизма характеризовались также локусы АМ25 у российских и АМ53 у прибалтийских сортов (рис. 1). Все остальные локусы у всех групп сортов были полиморфными и содержали в общей выборке растений от 2 до 27 аллелей.

Из четырех аллелей, выявленных в локусе АМ25, лидирующее положение по частоте встречаемости занимал аллель 229 п. н. (59%), на втором месте оказался аллель 227 п. н. (22,7%), на третьем — аллель 230 п. н. (13,6%). Аллель 228 п. н., идентифицированный у единственного сорта Багач, является уникальным.

Уникальный аллель размером 346 п. н. обнаружен также в локусе АМ53, обладателем которого является сорт европейской селекции Чакал. Что касается остальных трех выявленных в данном локусе аллелей, то два из них — 341 п. н. и 258 п. н. встречались со сходной

SSR-локус Количество аллелей Частота встречаемости Фактический размер, п. н. Теоретический размер, п. н.

AM1 9 0,029-0,600 154-210 157-240

AM4 27 0,010-0,152 118-190 166

AM7 16 0,008-0,164 146-191 156

АМ11 12 0,020-0,300 138-226 130-250

АМ14 17 0,022-0,121 106-128 133

AM15 1 1 229 229

AM22 11 0,016-0,300 168-309 160-320

AM 25 4 0,040-0,570 227-230 215-240

AM30 6 0,040-0,350 179-191 170-220

AM38 1 1 151 150-178

AM42 4 0,040-0,470 171-175 177-213

AM53 4 0,040-0,460 256-346 230-350

AM83 2 0,270-0,720 187-188 170-190

Таблица 2

Характеристика исследованных SSR-локусов сортового генофонда овса посевного

Рис. 1. Число выявленных аллелей в полиморфных локусах АМ25, АМ30, АМ42, АМ53 и АМ83 сортов овса

посевного из разных селекционных программ

2;

20

« <ц <ц

15

10

о «

о

У 5

0

2 2

1

_4_4_| _4_4_

□II ¿11

3 3

2 „ 2 II

АМ 25 АМ 30 ЛМ 42 АМ 53 АМ 83

частотой (50 и 42% соответственно), тогда как частота встречаемости третьего аллеля размером 256 п. н. была существенно ниже — 4%.

В локусе АМ42 численное преимущество имели аллели 171 п. н. (47,6%) и 174 п. н. (42,9%), которые встречались у всех групп сортов, в то время как аллели 172 и 175 п. н., были отмечены с одинаковой частотой 4,8% лишь в материале прибалтийской и российской селекции (рис. 1).

Среди шести аллелей, выявленных в локусе АМ30, с практически одинаковой частотой присутствовали аллели 179 п. н. и 185 п. н. (35,4 и 33,3% соответственно). Третье место по частоте встречаемости занимал аллель 189 п. н. (14,6%). Для остальных трех аллелей данный показатель варьировал от 4,2 до 6,3%, причем аллели 180 п. н. и 186 п. н. были выявлены только в прибалтийских и российских сортах.

В локусе АМ1 с наибольшей частотой (60%) встречался аллель 156 п. н., который был идентифицирован у всех проанализированных сортов за исключением сорта Jaak эстонской селекции. Аллели 197 п. н., 199 п. н. и 154 п. н. занимали 2, 3 и 4 места с частотой встречаемости 11%, 8,5% и 5,7% соответственно. Остальные пять аллелей отмечены с одинаковой частотой, равной 2,8%.

В локусе АМ22 преобладал аллель 169 п. н. с частотой встречаемости 32%, за ним следовали аллели 286 п. н. (19%), 304 п. н. (11%), 224 п. н. и 229 п. н. (по 9,8%). Частота встречаемости остальных шести аллелей варьиро-

вала от 1,6 до 4,9%. Следует отметить, что по количеству выявленных в этом локусе аллелей белорусские сорта в 2,5 раза превосходили сорта из других групп (рис. 2).

В локусе АМ11 чаще других отмечены три аллеля: 216 п. н. (30%), 139 п. н. (22%) и 151 п. н. (12%). Частота встречаемости остальных девяти аллелей была существенно ниже с варьированием от 2 до 6%. Наиболее полиморфными по этому локусу были сорта белорусской и европейской селекции, причем каждая из этих групп содержала по три аллеля, не встречающиеся у сортов другой группы.

Из 16 аллелей локуса АМ7 три были уникальными, выявленными только у двух сортов европейской селекции: аллели 189 п. н. и 191 п. н. содержал сорт Каньон, а аллель 179 — Скорпион. Максимальной частотой в общей выборке сортов характеризовался аллель 151 п. н. (19,6%), затем следовал аллель 153 п. н. (14,1%), за ним — аллель 159 п. н. (12%). Довольно редким был аллель 150 п. н. (2,2%), частота встречаемости остальных шести аллелей варьировала от 6,5 до 9,8%.

Локус АМ14 был более полиморфным в сортах белорусской и прибалтийской селекции (рис. 2). Наиболее высокая частота встречаемости отмечена здесь для аллеля 108 п. н. (12,1%), незначительно уступили ему аллели 119 п. н. и 122 п. н. (по 11%). Одиннадцать аллелей встречались с частотой от 4,4 до 7,7%. Самую низкую частоту встречаемости 2,2% имели три аллеля.

25 20

5S

- 15

<u «

ч л

о «

о

21

16

13

AM I

AM 4

g__о

8

AM 7

AM II

15

13

10

D1 4 4 A

III

AM 14

AM 22

Белорусские сорта H! Европейские сорта И Прибалтийские сорта Р Российские сорта

Рис. 2. Число выявленных аллелей в полиморфных локусах АМ1, АМ4, АМ7, АМ11, АМ14 и АМ22 сортов овса

посевного из разных селекционных программ

В самом полиморфном локусе АМ4 чаще других выявлялись три аллеля: 125 п. н. (15,2%), 131 п. н. (13,3%) и 137 п. н. (12,4%). Среднюю частоту встречаемости от 4,8 до 6,7% имели шесть аллелей, для остальных восемнадцати аллелей показатель варьировал от 1 до 3,8%. Два аллеля были уникальными: 118 п. н. у белорусского сорта Гоша и 169 п. н. у прибалтийского сорта УПи.

Для оценки уровня генетической изменчивости включенных в исследования сортов овса посевного использовался такой показатель, как ожидаемая гетерозиготность, или генетическое разнообразие по Неи (Не), выбор которого был обусловлен тем, что он практически не зависит от размера выборки. Значения показателя по каждому полиморфному локусу в пределах сформированных по регионам групп сортов представлены в таблице 3.

Как видно из данных таблицы 3, у белорусских сортов наибольшей гетерозиготностью характеризуются локусы АМ4 и АМ14, имеющие равные значения показателя, несмотря на существенные различия в количестве выявленных аллелей (табл. 1). Это объясняется тем, что значительное количество аллелей локуса АМ4 имели очень низкую частоту встречаемости.

Локус АМ4 стоит на первом месте по гете-розиготности и у европейских сортов, однако максимальное значение показателя имеют прибалтийские сорта. У этих же сортов гете-

розиготность локуса АМ14 идентична таковой у белорусских сортов, в то время как российские сорта по гетерозиготности упомянутых выше локусов несколько уступают остальным, а максимальное значение показателя у них имеет локус AM7.

Следует отметить, что AM7 является единственным полиморфным локусом, имеющим сходные значения Не для всех групп сортов. Так, в локусе АМ11 близкие значения гетерозиготности имеют с одной стороны белорусские и европейские сорта, с другой — прибалтийские и российские, однако во второй паре они существенно ниже. Аналогичная картина наблюдается для локуса АМ22.

Прибалтийские и российские сорта имеют также равные значения показателя в локусах АМ22, АМ30 и АМ42, в то время как гетерозиготность локуса АМ1 несколько выше у прибалтийских сортов, а по локусам АМ25, АМ53 и АМ83 различия между этими двумя группами сортов достигают крайних значений (табл. 3). По этим же локусам наиболее существенные различия наблюдаются и у европейских и российских сортов.

Отличием белорусских сортов от всех остальных групп является более высокая ге-терозиготность локуса АМ25 и более низкие значения показателя для локуса АМ30 и в особенности для локуса АМ1.

Среднее значение Не для всех локусов, являющееся оценкой уровня генетической измен-

Таблица 3

Ожидаемая гетерозиготность SSR-локусов в пределах сформированных по регионам

групп сортов овса посевного

Группы Ожидаемая гетерозиготность (Не)

сортов AM1 АМ4 AM7 AM11 AM14 AM22 АМ25 AM30 AM42 AM53 AM83

Белорусские 0,357 0,907 0,844 0,816 0,907 0,830 0,678 0,599 0,495 0,569 0,397

Европейские 0,667 0,871 0,847 0,847 0,847 0,694 0,444 0,716 0,500 0,625 0

Прибалтийские 0,750 0,910 0,875 0,694 0,907 0,694 0,480 0,793 0,688 0 0

Российские 0,571 0,765 0,810 0,640 0,791 0,694 0 0,780 0,688 0,375 0,375

чивости популяции, для белорусских сортов было равно 0,672, для европейских — 0,641, для прибалтийских — 0,617 и для российских — 0,589, то есть у первых трех групп различия наблюдались на уровне сотых долей единицы, несколько ниже была изменчивость российских сортов.

Для сравнения укажем, что в исследованиях Ашимовой с соавторами [7] значение показателя для сортов овса посевного из Восточной Европы составило 0,521, а для сортов казахской селекции — 0,525. Близкое значение Не (0,526) было получено для всей изученной мировой коллекции овса (163 генотипа). Сходство данных показателей, по мнению авторов, свидетельствует о широком использовании зарубежных генетических ресурсов этой культуры в селекционных программах Казахстана. Аналогичный вывод можно сделать и по результатам наших исследований. Тем не менее выявленные различия по полиморфизму ряда локусов между белорусскими сортами и сортами из других регионов дают основания полагать, что заложенный в материале из ближнего зарубежья потенциал генетической изменчивости использован нашими селекционерами не в полной мере.

Заключение

В ходе исследования полиморфизма 13 SSR-локусов у 22 сортов овса посевного выявлено 114 аллелей, из которых в белорусских сортах присутствовало 83, в европейских — 54, в прибалтийских — 67 и в российских — 51 аллель. Наибольшее количество аллелей как в общей выборке сортов, так и по отдельным регионам идентифицировано в локусах АМ4, АМ14 и АМ7 — 27, 17 и 16 аллелей

соответственно. Анализ аллельного состава данных локусов может быть использован для дифференциации генетически близких генотипов овса. Наличие уникальных аллелей определено в шести сортах овса. Установлено, что, несмотря на наличие существенных различий по гетерозиготности ряда SSR-локусов, по общему уровню генетической изменчивости белорусские сорта не отличаются от зарубежных.

Список использованных источников

1. Баталова, Г. А. Овес: технология возделывания и селекция / Г. А. Баталова. - Киров, 2000 - 206 с.

2. Oat beta-glucan lowers total and LDL cholesterol / S. Pomeroy [et al.] // Aust. J. Nutr. Dia-bet. - 2001. - Vol. 58, № 1. - P. 51-55.

3. Peterson, D. M. Oat antioxidants / D. M. Peterson // J. Cereal Sci. - 2001. - Vol. 33, № 2. - P. 115-129.

4. Куда с полей идет белорусский овес // Сельская газета, №119 от 12.10.2019.

5. Li, C. D. The development of oat microsatellite markers and their use in identifying relationships among Avena species and oat cultivars / C. D. Li, B. G. Rossnagel, G. J. Scoles // Theor. Appl. Genet. - 2000. - Vol. 101, № 8. - Р. 1259-1268.

6. Чесноков, Ю. В. Оценка меры информационного полиморфизма генетического разнообразия / Ю. В. Чесноков, А. М. Артемьева // Сельскохозяйственная биология. -2015. - Т. 50, № 5. - С. 571-572.

7. Генотипирование мировой коллекции овса с использованием микросателлитных маркеров / А. Н. Ашимовa [и др.] // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2016. -№ 1(66). - С. 134-143.

N. I. Dubovets, Е. А. Sycheva, A. V. Sokoluk, E. B. Bondarevich, L. A. Solovey

EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF OAT AVENA SATIVA L.

VARIETIES USING SSR ANALYSIS

State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: N.I.Dubovets@igc.by

Analysis of 13 SSR-loci polymorphism in 22 common oat cultivars divided into 4 groups depending on their origin (Belarusian, European, Baltic and Russian cultivars) was carried out. In total, 114 alleles were identified in the studied material, and 83 were present in Belarusian cultivars, 54 in European, 67 in Baltic, and 51 in Russian cultivars. The most polymorphic loci AM4, AM14, and AM7 were identified in which the presence of 27, 17 and 16 alleles was determined in the total sample of cultivars respectively. The same loci were characterized by a high level of heterozygosity within each individual group of cultivars allowing to conclude that the allelic composition analysis of these loci may be used to differentiate genetically close genotypes. The AM11 locus was also highly polymorphic in the cultivars of the Belarusian and European breeding. It was demonstrated that Belarusian cultivars do not differ from the foreign ones in terms of a genetic variability level.

Keywords: cultivated oat, molecular markers, SSR-loci polymorphism, genetic variability.

Дата поступления статьи: 18 сентября 2020 г.