CC BY
34
К. А. Закурдаева, В. П. Иванов, И. А. Мандрик, И. А. Трубникова
ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ*
Курский государственный медицинский университет
Рибосомные гены (РГ) представляют собой участки молекулы ДНК, кодирующие синтез и созревание пре-рРНК [1—5]. Локусы рДНК принято также называть районами ядрышкового организатора или ядрышкообразующими районами (ЯОР), в связи с тем, что из этих участков непосредственно после деления формируется ядрышко. В ка-риотипе человека ядрышкообразующие районы обнаруживаются на акроцентрических хромосомах группы Б (13, 14, 15) и группы С (21, 22) [6-9]. Все указанные акроцентри-ки обладают равной способностью к ассоциации [10]. Ассоциацией называют структуру, состоящую из взаимно ориентированных короткими плечами акроцентрических хромосом с расстоянием между ними менее толщины хроматиды [10, 11].
Наличие ядрышкового аппарата характерно для всех эукариотических клеток. Он отражает функциональное состояние клетки, в частности ее метаболическую активность или уровень дифференцировки. Удобным и общепринятым методом изучения экспрессии РГ у человека является селективное окрашивание метафазных хромосом раствором нитрата серебра [12-14]. Размер преципитата серебра отражает количество активных (транскрибируемых) копий РГ в данной хромосоме [15]. Критерий суммарной активности ЯОР (сумма размеров преципитатов серебра 10 ЯОР в условных единицах) используется в качестве относительной меры общего количества активных РГ. В настоящее время установлена норма реакции данного признака — от 16 до 24 условных единиц [15, 16].
Изменения функциональной активности ядрышкового аппарата изучены как в процессе онтогенеза человека, так и при многих патологиях, в том числе онкологических [13, 17-20]. Однако до сих пор малоизученным остается вопрос клинического и прогностического значения показателей функциональной активности РГ при острых лейкозах. В связи с особенностями длительной цитостатической терапии данной группы больных перспективным представляется исследование изменения ядрышкового аппарата патологических клеток в процессе лечения острого лейкоза.
Цель настоящего исследования — оценить состояние функциональной активности рибосомных генов в клетках периферической крови больных острым лейкозом до начала лечения и после курса индукции ремиссии.
В группу исследования вошли 97 пациентов с первично диагностированным острым лейкозом, из них 74 — с острым миелобластным лейкозом и 23 — с острым лимфобластным лейкозом. Средний возраст больных (равный возрасту манифестации заболевания) составил 46,99 ± 12,51 лет. Группа контроля включала 70 практически здоровых лиц.
Материалом исследования послужили клетки периферической крови пациентов. Соблюдались единые условия забора материала, культивирования и фиксации. Взятие
* Работа выполнена на базе лаборатории кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета и гематологического отделения Курской областной клинической больницы.
© К.А.Закурдаева, В.П.Иванов, И.А.Мандрик, И.А.Трубникова, 2010
крови производили из локтевой вены в объеме 10 мл. Кровь немедленно помещали во флаконы с гепарином, разведенным водой в отношении 1:20, с целью предотвращения ее свертывания. Культивирование клеток периферической крови обследованных лиц проводилось общепринятым методом, описанным Hungerford и Moorhead, с небольшими модификациями. Остановку клеточного деления на стадии метафазы производили с помощью цитостатиков — колхицина и колцемида. Фиксацию культур проводили общепринятым методом с помощью смеси этилового спирта и уксусной кислоты в соотношении 3:1. Препараты готовили раскапыванием осадка клеточной суспензии на влажные охлажденные тонкие стекла на пару или с последующим обжигом над огнем спиртовки; после высушивания окрашивали раствором нитрата серебра и шифровали.
Полученные препараты анализировали под микроскопом «Zeiss» при увеличении х1200. От каждого индивида анализировали 20 метафазных пластинок. Оценивался размер ЯОР индивидуальных акроцентрических хромосом по пятибалльной системе (от 0 до 4): 0 — окраска отсутствует, 1 — слабая окраска (выпавшие зерна серебра меньше ширины хроматиды), 2 — средняя (зерна серебра соответствуют ширине хромати-ды), 3 — интенсивная (размер Ag-блока превышает ширину хроматиды), 4 — высоко интенсивная окраска (зерна серебра значительно шире хроматиды и сливаются, образуя общий конгломерат), а также количество ассоциаций и число принимающих в них участие акроцентрических хромосом.
Забор материала производился дважды: до начала терапии и после курса индукции ремиссии. Курсы полихимиотерапии включали применение следующих препаратов: цитарабин, даунорубицин, рубомицин, винкристин, метотрексат, преднизолон, L- аспарагиназа.
Все пациенты были разделены на две основные группы: больные острым миело-бластным лейкозом и больные острым лимфобластным лейкозом, которые, в свою очередь, подразделялись по срокам выживаемости на следующие группы:
1) умершие в течение первого курса терапии или до начала лечения;
2) выживаемость менее 1 года;
3) выживаемость от 1 до 3 лет;
4) выживаемость более 3 лет.
Проведена сравнительная характеристика количества активных рибосомных генов в группе контроля и при острых лейкозах до и после лечения (таблица 1). Установлено, что средний показатель количества активных рибосомных генов в группе контроля составляет 19,83 ± 1,94 условных единиц, тогда как у больных острыми лейкозами как до, так и после курсов лечения, данный показатель по 10 хромосомам был статистически достоверно ниже, чем в контроле (t=9,28 и 8,22, соответственно, при р<0,05) и составлял 17,70 ± 0,98 и 17,69 ± 1,12 условных единиц, соответственно. Снижение активности рибосомных генов происходило за счет ядрышкообразующих районов хромосом группы G (t=9,46 и 8,56, соответственно, при р<0,05). Сравнительный анализ активности рибосомных генов при острых лейкозах до и после лечения не показал статистически значимых различий между показателями.
Сравнительный анализ активности рибосомных генов при острых миело- и лимфобластных лейкозах выявил статистически значимые различия показателей количества активных рибосомных генов в этих группах (t=4,04 при р<0,05). Средний показатель количества активных рибосомных генов у больных острым миелобластным лейкозом составил 17,91 ± 0,91, лимфобластным—17,03 ± 0,92 (таблица 2). Активность рибосом-ных генов была значительно ниже при остром лимфобластном лейкозе во всех группах хромосом. Те же различия показателей количества активных рибосомных генов в груп-
Таблица 1. Сравнительная характеристика количества активных рибосомных генов в группе контроля и при острых лейкозах до и после
лечения
Признак к1, N=70 ОЛ-П2, N=97 ОЛ-ПХТ3, N=76 і Р
К-П4 К-ПХТ5 К-П4 К-ПХТ0
Активность РГ по 10 хромосомам 19,83±1,94 17,70±0,98 17,69±1,12 9,28* 8,22* 3,91* 3,00*
Активность РГ по I) хромосомам 11,80±1,38 11,54 ±0,65 11,57±0,85 1,61 1,20 4,45* 2,61*
Активность РГ по С хромосомам 8,17±1,99 6,16±0,53 6,12±0,58 9,46* 8,56* 14,14* 11,71*
Число ассоциаций хромосом 0,70±0,46 0,68 ±0,26 0,71±0,23 0,28 -0,16 3,08* 3,94*
Число хромосом в ассоциации 1,64±1,21 1,47±0,58 1,43±0,49 0,92 1,15 4,35* 6,01*
1 группа контроля; 2 группа больных острым лейкозом, первичные; 3 группа больных острым лейкозом, после полихимиотерапии; 4 группа контроля — группа больных острым лейкозом, первичные; 5 группа контроля — группа больных острым лейкозом, после полихимиотерапии.
* — статистически достоверные различия при р<0,05. і — критерий Стьюдента; Р — критерий Фишера.
пах больных острым миело- и лимфобластным лейкозом сохранялись и после курса индукции ремиссии (1=3,76 при р<0,05), однако статистически достоверные различия наблюдались только по показателям активности РГ в ЯОР хромосом группы Б (1=3,73 при р<0,05).
Таблица 2. Показатели активности рибосомных генов в группах больных острым миело- и лимфобластным лейкозом до и после лечения
Признак ОМЛ-П1, N=74 ОЛЛ-П2, N=23 і Р ОМЛ-ПХТ3, N=59 ОЛЛ-ПХТ4, N=17 і Р
Активность РГ по 10 хромосомам 17,91±0,91 17,03±0,92 4,04* 1,03 17,93±1,05 16,86±0,96 3,76* 1,19
Активность РГ по О хромосомам 11,67±0,58 11,13±0,70 3,72* 1,44 11,75±0,72 10,94 ±0,99 3,73* 1,91
Активность РГ по С хромосомам 6,25±0,51 5,90±0,51 2,83* 1,01 6,18±0,58 5,92±0,58 1,64 1,00
Число ассоциаций хромосом 0,69±0,25 0,61±0,30 0,33 1,41 0,74±0,21 0,59±0,26 2,52* 1,45
Число хромосом в ассоциации 1,51±0,55 1,35±0,67 1,20 1,48 1,51±0,47 1,18±0,51 2,48* 1,21
1 острый миелобластный лейкоз (первичные); 2 острый лимфобластный лейкоз (первичные); 3 острый миелобластный лейкоз (после курса ПХТ); 4 острый лимфобластный лейкоз (после курса ПХТ).
* — статистически достоверные различия при р<0,05. t — критерий Стьюдента; Р — критерий Фишера.
Проведен анализ показателей активности рибосомных генов клеток периферической крови пациентов с различной длительностью жизни после манифестации заболевания (таблица 3). При сравнительном анализе показателей активности рибосомных генов в группах больных острым миело- и лимфобластным лейкозом с различной выживаемостью выявлена прямая зависимость между исходным уровнем активности рибосомных генов и уровнем выживаемости пациентов, страдающих острым лейкозом, что
19.50
19.00
. 18,50 01
5 18,00
ш
0
| 17,50
1
І 17-°°
І
І. 16,50
16.00 5 15,50
15,00
14.50
1ПХТ до 1 года* 1-Згода* дольшеЗлєт
Рис. 1. Выживаемость больных острым лейкозом на фоне активности рибосомных генов
* —статистически достоверные различия при р<0,05.
отражено на рисунке 1. Показано, что чем ниже исходная активность РГ, тем короче продолжительность жизни пациента после манифестации заболевания. Сравнительный анализ активности рибосомных генов при острых лейкозах в группах с различной выживаемостью до и после лечения не выявил статистически значимых различий между показателями, за исключением группы больных ОМЛ с уровнем выживаемости от 1 до 3 лет, где после курса индукции ремиссии наблюдалось статистически достоверное снижение функциональной активности рибосомных генов (1=2,24 при р<0,05), что свидетельствует о реакции клеток на проводимую химиотерапию.
Таблица 3. Показатели активности рибосомных генов в группах больных острым миело- и лимфобластным лейкозом с различной выживаемостью
Признак Острые миелобластные лейкозы (ОМЛ) Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ)
Iі, N=9 22, N=2- З-3, N=30 4^ £ я СО Iі, N=5 2-, N=8 З-3, N=9 44, N=1
Активность РГ по 10 хромосомам 16,54±0,77 17,49±0,77 18,27±0,48 18,75±0,45 16,02±0,17 16,73±0,56 17,64±0,61 19,05
Активность РГ по О хромосомам 10,77±0,58 11,52±0,52 11,89±0,40 12,04 ±0,30 10,53±0,23 10,89±0,54 11,57±0,70 12,00
Активность РГ по С хромосомам 5,78±0,41 5,96±0,41 6,39±0,44 6,72±0,36 5,49±0,29 5,84±0,47 6,06±0,44 7,05
Число ассоциаций хромосом 0,76±0,27 0,62±0,26 0,71±0,20 0,75±0,32 0,79±0,38 0,47±0,14 0,56±0,14 1,45
Число хромосом в ассоциации 1,61±0,58 1,34±0,60 1,57±0,41 1,60±0,73 1,74±0,83 1,00±0,37 1,23 ±0,31 3,20
1 умершие в течение первого курса терапии или до начала лечения; 2 выживаемость менее 1 года; 3 выживаемость от 1 до 3 лет; 4 выживаемость более 3 лет.
-Больные ОМЛ -Больные О ЛЛ
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об исходном снижении активности рибосомных генов за счет ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом группы G, что может являться как предрасполагающим фактором развития патологического процесса, так и следствием онкогенеза. В ходе лечения не наблюдалось значимых изменений показателей активности РГ. Отсутствие ответа биосинтетического аппарата клетки на химиотерапевтическое воздействие может говорить о первичной резистентности патологического клона или, возможно, связано с недостаточной продолжительностью терапии на момент повторного забора материала. Выявлена прямая зависимость между исходным уровнем активности рибосомных генов и уровнем выживаемости пациентов, страдающих острым лейкозом. Следовательно, показатели активности рибосомных генов можно рассматривать как прогностически значимые факторы лейкогенеза.
Литература
1. Спирин Н. С. Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот / Под ред. Н. С. Спирина. М.: Высш. школа, 1990. 352 с.
2. Прокофьева-Бельговская А. А. Гетерохроматические районы хромосом / А. А. Прокофье-ва-Бельговская. М.: Наука, 1986. 431 с.
3. Прокофьева-Бельговская А. А. Основы цитогенетики человека / А. А. Прокофьева-Бель-говская. М.: Медицина, 1969. С. 13-17.
4. Фогель Ф. Генетика человека: пер. с англ. / Ф. Фогель, А. Мотуски. В 3-х т. М.: Мир, 1989. С. 13-14.
5. Ляпунова Н. А. Ядрышкообразующие районы хромосом и рибосомные гены в геноме человека: от научных поисков к практике / Н. А. Ляпунова // Современные методы диагностики наследственных болезней. М., 2001. С. 12-22.
6. Куприянова Н. С., Тимофеева М. Я. // Итоги науки и техники. Сер. молекуляр. биология. М.: ВИНИТИ, 1989. С. 81-221.
7. Мамаев Н. Н. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты / Н. Н. Мамаев, С. Е. Мамаева // Цитология. 1992. Т. 34, №10. С. 3-25.
8. Тимофеева М. Я., Кост М. В., Тихомирова Г. П. и др. Организация кластера генов 5S рибосомных РНК в геноме человека // Молекуляр. биология. 1993. №4. С. 861-868.
9. Тимофеева М. Я., Тихомирова Т. Л., Куприянова Н. С. и др. // Вторая Всесоюз. конф. «Геном человека». Переяславль-Залесский, 1991. С. 25.
10. Фролов А. К. Частота ассоциаций акроцентрических хромосом в лимфоцитах крови человека при разных способах ее оценки / А. К. Фролов // Генетика. 1985. №7. С. 1229-1235.
11. Zellweger H. Satellite associations and translocation nongolism / H. Zellweger, G. Abbo, K. Guanty. // J. Med. Genet. 1966. N3. P. 186.
12. Ляпунова Н. А. Рибосомные гены в геноме человека: вклад в генетическую индивидуальность и фенотипическое проявление дозы гена / Н. А. Ляпунова, Н. А. Еголина, Т.Г. Цветкова // Вестн. Рос. АМН. 2000. №5. С. 19-23.
13. Колчанова И. О. Функциональная активность рибосомных генов и ее модифицирующее влияние на особенности клинического проявления, течение и эффекты лечения язвенной болезни: дис. ... канд. мед. наук. / И. О. Колчанова. М., 2005. 167 с.
14. Ляпунова Н. А., Еголина Н. А., Вейко Н. Н. и др. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа // Био-логич. мембраны. 2001. Т. 18, №3. С. 189-199.
15. Залетаева Т. А., Кулешов Н.П., Залетаев Д. В., Барцева О. Б. Современные методы хромосомного анализа в клинико-цитогенетических исследованиях // Рос. мед. акад. последип. образования. М.: Медицина, 1994. 68 с.
16. Мамаев Н. Н., Мартинес У., Морозов Е. О., Иванова Н. А. Характеристика окрашенных серебром ядрышек в бластных элементах разного диаметра больных острым лейкозом // Цитология. 1988. Т. 30, № 12. С. 1478-1482.
17. Туганова Т. Н. Цитологическая оценка ядрышкового аппарата в дифференциальной диагностике пролимфоцитарных лимфом и доброкачественных лимфопролиферативных заболеваний / Т. Н. Туганова, Л. С. Болгова, О. И. Алексеенко // Онкология. 2003. Т. 5, № 1. С. 14-18.
18. Цветкова Т. Г., Раевская Г. Б., Черников В. Г. и др. Увеличение количества активных рибосомных генов, выявляемых с помощью Ag-окрашивания ядрышкообразующих районов метафазных хромосом, при старении культивируемых фибробластов человека // Цитология. 1997. №1. С. 116-117.
19. Лебедева Н.Б., Меркулова И. Б., Гаврилова Т.Н., Зубрихина Г. Н. Ядрышкообразующие районы лимфоидных элементов костного мозга и периферической крови у больных неходжкинскими лимфомами в стадии лейкемизации // Клинич. лаб. диагностика. 1997. №5. С. 65.
20. Колосков А. В., Мамаев Н.Н. Прогностическое значение активности ядрышковых организаторов мегакариоцитов у больных острым лимфобластным лейкозом // Гематология и трансфузиология, 1996. Т. 41, №1. С. 23-25.
Статья поступила в редакцию 15 июня 2010 г.
