CC BY
105
ГЕМАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.155.35-053.2-091-07
В. С. Сухоpуков, А. Н. Пампуpа, Е. А. Pужицкая, Т. В. Винофадова, А. А. Чусляева, Е. Е. Ваpламов оценка ЭОЗИНОфИЛО^АММЫ ПЕPИФЕPИЧЕСКОЙ КPОВИ ДЕТЕЙ С ЭОЗИНООИЛИЕИ
ФГБУ московский НИИ педиатpии и детской хиpуpгии Mинздpавсоцpазвития Pоссии
Необходимость изучения и интеpпpетации эозинофилогpамм детей с аллеpгическими заболеваниями обусловлена высокой частотой среди них эозинофилии, шщотой спектpа моpфологических и функциональных щизнаков эозинофилов, зависимостью показателей от хаpактеpа клинического течения болезни, наличия осложнений и схем лечения. Уpовень лабоpатоpных методик, пpименяемых в повседневной клинической щактике для оценки моpфологических и функциональных особенностей эозинофилов, недосточно высок. Внедpение совpеменных высокотехнологичных методов, таких как компьютеpная моpфометpия, высокочувствительные и высокоспецифичные модификации ELISA, котоpые используются для ощеделения ассоци^ованных с эозинофилией цитокинов, хемокинов и фактоpов pоста, позволяет подойти к pешению этого вощоса на качественно новом уpовне.
Ключевые слова: эозинофилия, моpфометpия, цитокины, дети
V.S. Sukhorukov, A.N. Pampura, Ye.A. Rhujitskaya, T.V. Vinogradova, A.A. Tchuslyayeva, E.E. Varlamov
THE EVALUATION OF EOSINOPHILOGRAM OF PERIPHERAL BLOOD IN CHILDREN WITH EOSINOPHILIA
The need in study and interpretation of eosinophilograms in children with allergic diseases is conditioned by higher rate of eosino-philia, large specter of morphologic and functional signs of eosinophils, dependence of indicators from character of clinical course of disease, presence of complications and schemes of treatment. The level of laboratory techniques applied in routine clinical practice to evaluate morphological and functional characteristics of eosinophils is not developed enough. The implementation of such modern high-tech techniques as computer morphometry, highly sensitive and highly specific modifications ELISA, which are applied to detect associated with eosinophilia cytokines, chemokines and growth factors make it possible to approach to this issue at the new qualitative level.
Key words: eosinophilia, morphometry, cytokines, children
Эозинофилия является одним из наиболее частых кли-нико-лабораторных признаков аллергических заболеваний. Количественные показатели эозинофилов и уровни ассоциированных с эозинофилией цитокинов характеризуются значительными динамическими изменениями. До настоящего времени специалистами высказываются противоречивые мнения об эффекторной функции эозинофи-лов у здоровых лиц и больных с различными заболеваниями [8, 10]. Современными исследованиями была доказана потенциальная патогенетическая роль эозинофилов в развитии аллергической патологии [5, 8, 11]. В частности, показано, что эффекторная активность эозинофилов опосредует изменения органов респираторного тракта у пациентов с аллергическими заболеваниями [6, 12]. Доказано участие эозинофилов в управлении эффектом №2, ассоциированных с атопией, посредством продукции специфических хемокинов, цитокинов и энзимов [6, 7, 11]. Как показали лабораторные исследования, эозинофилы синтезируют и высвобождают широкий спектр медиаторов воспаления, включая катионные белки, цитокины, хемокины и факторы роста [1]. Однако влияние эозинофилов на различные звенья аллергического воспаления, особенно сопряженного с эозинофилией, остается
Для корреспонденции:
Ружицкая Елена Апполосовна,, науч. сотр. НИИ общей патологии Адрес: 125412, Москва, ул. Талдомская, 2 Телефон: (499) 487-76-00 E-mail: [email protected]
недостаточно изученным. Внимание, которое специалисты уделяют количественным изменениям и функции эозинофи-лов, неадекватно мало по сравнению с оценкой их патогенетической роли при аллергических заболеваниях у детей, в то время как показатели, характеризующие морфологические и функциональные особенности эозинофилов, могут использоваться в качестве критериев тяжести клинического состояния больных с аллергическими заболеваниями и эффективности их лечения. В частности, показана диагностическая значимость параметров эозинофилов с различной плотностью при обследовании больных с эозинофилией [1-3].
Целью исследования явилось определение морфо-метрических показателей эозинофилов с различной плотностью и уровней ассоциированных с эозинофилией цитокинов (эотаксина и интерлейкина-5) у детей с аллергическими заболеваниями.
Матеpиалы и методы. Проведено комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследование 18 детей и подростков (7 девочек и 11 мальчиков) в возрасте от 6 до 18 лет, более половины (55,6%) из которых составляли больные старше 14 лет. На долю детей в возрасте 6-10 лет приходилось 27,8%, в возрасте 11-15 лет - 33,3%, старше 15 лет - 38,9%. У всех больных было клинически диагностировано и объективно подтверждено результатами лабораторных исследований наличие аллергических заболеваний. У 8 больных диагностирован аллергический ринит (рис. 1), у одного больного признаки ринита сочетались с аллергическим бронхитом, у 2 - с аллергическим конъюнктивитом, у 3 - с аллергическим дерматитом, у 4 - с бронхиальной астмой легкой степени. Относительное количество эозинофилов в формуле крови составляло от 6 до 15%. В качестве контроля использовали результаты обследования 9
Рис. 1. Эозинофилы в отделяемом слизистой оболочкой носа. Здесь и на рис. 3-7 окраска по Романовскому-Гимзе. х400.
Таблица 1
относительное и абсолютное количество клеток цельной ^ови больных с эозинофилией (X ± т)
Клеточные элементы Относительное количество, % Абсолютное количество, кл/мл
Лейкоциты - 7138,9 ± 441,9
Нейтрофилы 50,78 ± 3,69 3666,06 ± 366,26
Эозинофилы 8,67 ± 1,05 615,56 ± 91,27
Моноциты 10,56 ± 1,26 700,5 ± 87,32
Лимфоциты 30,06 ± 3,17 2164,39 ± 203,69
Таблица 2
относительное количество клеток "легкой" и "сpедней" фpакций (в %) у больных с эозинофилией (X ± т)
Показатель "Легкая" фракция "Средняя" фракция
Нейтрофилы 2,64 ± 0,80** 49,41 ± 6,53**
Эозинофилы 1,22 ± 0,23* 6,50 ± 1,62*
Моноциты 11,47 ± 1,74** 3,41 ± 1,01**
Лимфоциты 84,83 ± 2,01** 40,62 ± 5,92**
Примечание. * - достоверное различие между показателями "легкой" и "средней" фракций при уровне значимости р < 0,01; ** -при уровне значимости р < 0,001.
Таблица 3
Pезультаты моpфометpической оценки эозинофилов цельной ^ови, "легкой" и "тяжелой" фpакций (X ± т)
Показатель Периферическая кровь "Легкая" фракция "Средняя" фракция
Диаметр эозинофилов, мкм 10,72 ± 0,31* 8,07 ± 0,36* 7,62 ± 0,29*
Периметр эози-нофилов, мкм 35,32 ± 1,12* 25,72 ± 1,24* 24,56 ± 0,98*
Среднее количество гранул в эозинофиле, ед. 203,24 ± 7,78* 105 ± 43,00* 146,8 ± 14,33*
Незрелость гранул, % 0,38 ± 0,08* 2,08 ± 0,14* 0,95 ± 0,08*
Примечание. * - достоверное различие показателей "легкой" и "средней" фракций и цельной крови при уровне значимости р < 0,001. Жирным шрифтом выделены достоверно различающиеся показатели "легкой" и "средней" фракций.
1
2
3
4
5
6
Рис. 2. Расположение фракций при разделении периферической крови на градиенте фиколл-урографина. 1 - плазма с забуференным физраствором; 2 - клетки "легкой" фракции; 3 - градиент с плотностью 1,076 г/мл; 4 - клетки "средней" фракции; 5 - градиент с плотностью 1,083 г/мл; 6 - эритроциты.
практически здоровых лиц, у которых в периферической крови число эозинофилов не превышало 1-3%.
В работе представлены результаты первого фрагмента исследования эозинофилограмм детей с аллергическими заболеваниями, сопровождающимися эозинофилией. Эозино-филограммы включали 2 группы показателей: параметры морфометрии эозинофилов периферической крови (цельной крови, "легкой" и "средней" фракций клеток); концентрации ассоциированных с эозинофилией цитокинов (эотаксина и интерлейкина-5).
Фракционирование клеток периферической крови проводили на двухступенчатом градиенте фиколл-урографина. Использовали растворы фиколл-урографина с плотностью 1,076 и 1,083 г/мл, приготовленные по методу А. Воуит (1961).
Перед началом фракционирования эозинофилов и их морфометрического исследования оценивали лейкоцитоз, используя камеру Горяева, подсчитывали формулу крови в мазках, зафиксированных 96% этиловым спиртом и окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для формирования двухступенчатого градиента в цилиндрической пробирке на градиент с плотностью 1,083 г/мл наслаивали раствор фиколл-урографина с плотностью 1,076 г/мл в объемном соотношении 1:1. Разведенную в 3 раза забуференным физиологическим раствором цельную кровь наслаивали поверх двухступенчатого градиента в соотношении 3:1, центрифугировали в режиме 40 мин при 400 g. Клетки образовывали беловатые кольца над I и II ступенями градиента (рис. 2).
Собирали клетки "легкой" и "средней" фракций в сухие конические полипропиленовые пробирки емкостью 1,5 мл, дважды отмывали забуференным физиологическим раствором. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл аутологичной плазмы и приготовляли мазки на обезжиренных предметных стеклах. Для определения цитологического состава клеток и морфометрического исследования эозинофилов "легкой" и "средней" фракций мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе.
В препаратах клеток "легкой" фракции (плотность градиента 1,076 г/мл) практически здоровых лиц содержались лимфоциты (до 90% всех клеток) и моноциты (до 10% всех клеток) (рис. 3). Нейтрофилы были единичными, эо-зинофилы не встречались. В препаратах клеток "средней" фракции (плотность градиента 1,083 г/мл) здоровых лиц в основном содержались нейтрофилы, в незначительном количестве (до 9%) - лимфоциты и моноциты (рис. 4). Эози-нофилы были единичными или не встречались.
Рис. 3. "Легкая" фракция клеток периферической крови (плотность градиента 1,076 г/мл) практически здорового пациента. Включает лимфоциты, моноциты и единичные нейтрофилы. х1000.
Рис. 4. "Средняя" фракция клеток периферической крови (плотность градиента 1,083 г/мл) практически здорового пациента. Включает нейтрофилы и незначительное количество мононуклеаров. х1000.
У пациентов с аллергическими заболеваниями среди клеток "легкой" и "средней" фракций выявлялись эозинофилы (рис. 5-7). Для оценки морфологических особенностей эо-зинофилов цельной крови, "легкой" и "средней" фракций использовали компьютерную программу Видео Тест Мастер (СПб., Россия, 2004). Оценивали параметры:
- диаметр эозинофилов (в мкм);
- периметр эозинофилов (в мкм);
- среднее количество гранул в эозинофиле (в ед.);
- базофилию (незрелость) гранул (в %).
Концентрации эотаксина и интерлейкина-5 в периферической крови обследованных детей определяли методом ELISA. Использовали наборы производства "Bender MedSystems GmbH" (Австрия). Результаты оценивали с помощью программированного ридера Anthos 2020 производства "Biochrom" (Великобритания).
Pезулътаты и обсуждение. Количественный состав клеток цельной крови, "легкой" и "средней" фракций представлен в табл. 1-2.
Состав лейкоцитов периферической крови у больных с эози-нофилией не отличался от возрастной нормы, за исключением абсолютного и относительного количества эозинофилов, кото-
Рис. 5. "Легкая" фракция клеток периферической крови (плотность градиента 1,076 г/мл) больного аллергическим ринитом. Включает, кроме лимфоцитов и моноцитов, эози-нофилы. х400.
Рис. 6. Эозинофил в "легкой" фракции клеток периферической крови (плотность градиента 1,076 г/мл) больного аллергическим ринитом. х1000.
рое было значительно повышено [4]. Количественный состав клеток "легкой" и "средней" фракций представлен в табл. 2.
По результатам, представленным в табл. 2, относительное количество гранулоцитов (нейтрофилов и эозинофилов) в "легкой" фракции достоверно меньше, чем в "средней", а мононуклеаров (моноцитов и лимфоцитов) - достоверно больше. Эозинофилы в "легкой" фракции присутствуют в существенном количестве, тогда как у здоровых лиц они единичны. Согласно данным литературы, число эозинофилов в "легкой" фракции отражает тяжесть течения аллергического заболевания [1].
Одной из задач исследования являлось определение морфологических признаков, информативных для оценки активности эозинофилов (табл. 3).
Согласно результатам исследования, размеры эозинофи-лов периферической крови (их диаметр и периметр) у детей с эозинофилией значительно превышали показатели "легкой" и "средней" фракций. Размеры эозинофилов в цельной крови варьировали в широких пределах не только у разных больных, но и у одного и того же больного. Так, интервал диаметра эозинофилов составил 3,94 мкм (от 8,38 до 12,32 мкм), периметра - 15,18 мкм (от 26,74 до 41,92 мкм). Среднее число гранул в эозинофилах цельной крови достоверно превышало их число в эозинофилах "средней" и в еще большей степени - "легкой" фракции. Признаки незрелости
Л .
й С* f
Рис. 7. "Средняя" фракция клеток периферической крови (плотность градиента 1,083 г/мл) больного аллергическим ринитом. Включает в основном нейтрофилы и эозинофилы. х400.
гранул выявлялись в меньшем числе эозинофилов цельной крови, чем более легких фракций. При этом количество эози-нофилов с признаками незрелости гранул достоверно больше среди клеток "легкой", чем "средней" фракции.
Поскольку в настоящее время доказано участие целого ряда цитокинов в реализации эффекторной функции эозинофилов, в периферической крови обследованных детей определяли концентрации эотаксина и интерлейкина-5. Эотаксин был выявлен в сыворотке крови всех больных с эозинофилией, его концентрация составила 44,19 ± 5,56 пг/мл, диапазон значений - от 14,3 до 97,1 пг/мл. Содержание интерлейкина-5 выше порога чувствительности метода было зарегистрировано у 7 из 18 обследованных больных (в 38,9% проб), диапазон его концентрации составил от 0 до 12,8 пг/мл.
Полученные нами результаты в основном соответствуют данным литературы. Так, ранее была показана связь появления эозинофилов в "легких" фракциях с характером клинического течения аллергических заболеваний [1]. Проводилось фракционирование клеток периферической крови и было установлено наличие эозинофилов с низкой плотностью при эозинофилиях [1-3]. Я. Ме1о и соавт. (2005) показано, что морфология активированных под воздействием цитокинов (например, эотаксинов) эозинофилов имеет отличительные особенности, в частности, уменьшается число их гранул [9]. Следует отметить, что нам не встретились публикации, касающиеся морфометрии эозинофилов с различными плотност-ными характеристиками, ни в одной работе не упоминалось о том, что в "легкой" фракции содержится повышенное количество эозинофилов с признаками незрелости гранул.
Заключение. Результаты проведенных исследований позволили сформулировать ряд положений, отражающих особенности эозинофилов цельной крови, "легкой" (плотность 1,076 г/мл) и "средней" (плотность 1,083 г/мл) фракций у больных с аллергическими заболеваниями, сопровождающимися эозинофилией.
1. В "легкой" и "средней" фракциях клеток периферической крови увеличивается относительное количество эозинофи-лов и вследствие этого уменьшается относительное количество мононуклеаров (моноцитов и лимфоцитов).
2. Диаметр и периметр эозинофилов цельной крови детей с эозинофилией превышают соответствующие показатели "легкой" и "средней" фракций.
3. Размеры эозинофилов в цельной периферической крови варьируют в широких пределах: интервал диаметра эозинофилов - 3,94 мкм, периметра - 15,18 мкм.
4. Среднее число гранул в эозинофилах цельной крови значительно превышает их число в эозинофилах "средней" и в еще большей степени - "легкой" фракции.
5. Признаки незрелости гранул чаще выявляются в эо-зинофилах "легких" фракций, чем в эозинофилах цельной крови.
6. Количество эозинофилов с признаками незрелости гранул больше среди клеток "легкой", чем "средней", фракции.
7. Поскольку в настоящее время доказано участие целого ряда цитокинов в реализации эффекторной функции эо-зинофилов, в структуру современной эозинофилограммы целесообразно включать показатели не только морфометрической характеристики эозинофилов цельной крови и "легких" фракций (цитограммы), но и содержания цитокинов, ассоциированных с эозинофилией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Джальчинова В. Б., Чистяков Г. М. Эозинофилы и их роль в патогенезе аллергических заболеваний. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999; 5: 42-45.
2. ЛитвиноваЛ. С., PязанцеваН. В., НовицкийВ. В., ГpигоpьеваЕ. С. Апоптоз эозинофильных гранулоцитов, опосредованный цито-кинами, при больших эозинофилиях крови. Цитология. 2008; 50 (1): 67-71.
3. Новицкий В. В., Pязанцева Н. В., Литвинова Л.С. и др. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и иммуноцитов при формировании больших эозинофилий крови. Бюллетень сибирской медицины. 2006; 2: 52-61.
4. Кост Е. А., ред. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. 2-е изд. М.: Медицина; 1975; 48-49.
5. Adamko D., Lacy P., Moqbel R. Eosinophil function in allergic imf-lammation: from bone marrow to tissue response. Curr. Allergy Asthma Иер. 2004; 4: Р. 149-158.
6. Flood-Page P., Menzies-Gow A., Phipps S. et al. Anti-IL-5 treatment reduces deposition of ECM ргс^^ in the bronchial subepitelial basement membrane of mild ate^ic asthma. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1029-1036.
7. Haldar P., Brightling C.E., Gupta S. et al. Mepolizumab and exacerbations of refractory eosinophilic asthma. N. Engl. J. Med. 2009; 360: 973-984.
8. Mahmudi-Fzer S., Odemuyiwa S. O., Moqbel R. Intelligent granules: Are eosinophil cristalloid granules inimitable? J. Clin. Immunol. 2010; 126: 28-30.
9. Melo R. C. N., Weller P. F., Dvorak A. M. Activated human eosinop-hils. Imag. Allergy Immunol. 2005; 138: 347-349.
10. Moqbel R., Lacy P. New concepts in effector functions of eosinophil cytokines. Clin. Ехр. Allergy. 2000; 30: 1667-1671.
11. Nair P., Pizzichini M. M., Kjarsgaaed M. et al. Mepolizumab for prednisone-dependent asthma with sputum eosinophiliа. N. Engl. J. Med. 2009; 360: 985-993.
12. TulicM.K., SlyP. D., AndreusD. et al. Thymtc indoleamine 2,3-dioxyge-nase-positive eosinophilis in young children: potencial role in maturation of naive immune system. Am. J. Pathol. 2009; 175: 2043-2042.
Поступила 16.03.12
