CC BY
18
https://doi/org/10.33647/2713-0428-17-3E-59-63
(«О
BY 4.0
ОЦЕНКА ЭЛИМИНАЦИИ ЯДЕРНОГО МАТЕРИАЛА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ДЕРМЫ
К.И. Мелконян1, Т.В. Русинова1, Я.А. Козмай1*, А.С. Асякина1,2
1ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России 350063, Российская Федерация, Краснодар, ул. Митрофана Седина, 4
2 ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет» 350040, Российская Федерация, Краснодар, ул. Ставропольская, 149
В исследовании была проведена сравнительная оценка степени дезинтеграции и элиминации ядерного материала в образцах децеллюляризированной дермы свиньи, получаемых с помощью химического, детергентного и ферментативного методов обесклечивания и выступающих в качестве потенциальных раневых покрытий. В качестве химического метода (Протокол № 1) выступала обработка растворами №ОН и Н202, при детергентном методе (Протокол № 2) использовались растворы Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия в комбинации с №2-ЭДТА, при ферментативном (Протокол № 3) — растворы трипсина-Версена и свиной панкреатической ДНКазы. После получения образцов в них и в образцах нативной дермы (контрольная группа) проводился анализ количества ДНК, результаты которого показали соответствие критериям эффективного обесклечивания во всех образцах. Была установлена перспективность использования детергентного метода по сравнению с другими методиками создания обесклеченных дермальных матриксов.
Ключевые слова: децеллюляризация, дермальные раневые покрытия, ядерный материал, детер-
гентная обработка, ферментативный метод, химический метод
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Мелконян К.И., Русинова Т.В., Козмай Я.А., Асякина А.С. Оценка элиминации ядерного материала при различных методах децеллюляризации дермы. Биомедицина. 2021;17(3Е):59-63. https://doi/org/10.33647/2713-0428-17-3E-59-63
Поступила 16.04.2021
Принята после доработки 11.05.2021
Опубликована 20.10.2021
ASSESSMENT OF NUCLEAR MATERIAL ELIMINATION BY DIFFERENT METHODS OF DERMIS DECELLULARIZATION
Karina I. Melkonyan1, Tatyana V. Rusinova1, Yana A. Kozmai1*, Alevtina S. Asyakina12
1 Kuban State Medical University of the Ministry of Health Сare of Russia 350063, Russian Federation, Krasnodar, Mitrofana Sedina Str., 4
2 Kuban State University 350040, Russian Federation, Krasnodar, Stavropolskaya Str., 149
I We carry out a comparative assessment of the degree of nuclear material disintegration and elimination in the samples of decellularized porcine dermis after using chemical, detergent and enzymatic decellulariza-tion methods. Decellularized dermis materials are promising materials as wound dressings. The chemical method (Protocol No. 1) was performed using NaOH and H2O2 solutions; the detergent method (Protocol No. 2) involved the solutions of Triton X-100 and sodium deoxycholate in combination with Na2-EDTA; the enzymatic method (Protocol No. 3) was based on the solutions of trypsin Versene and porcine pan-
creatic DNase. Subsequently, we analyzed the DNA amount in deceUularized and native dermis (control group) samples. The results of this analysis showed positive results in all three protocols. It was found that the detergent method have advantages over other methods of producing decellularized dermis matrices.
Keywords: decellularization, dermal wound dressings, nuclear material, detergent treatment, enzymatic method, chemical method
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
For citation: Melkonyan K.I., Rusinova T.V., Kozmai Y.A., Asyakina A.S. Assessment of Nuclear Material Elimination by Different Methods of Dermis Decellularization. JournalBiomed. 2021;17(3E):59-63. https://doi/org/10.33647/2713-0428-17-3E-59-63
Submitted 16.04.2021 Revised 11.05.2021 Published 20.10.2021
Введение
В последние годы для решения проблемы нехватки донорских органов используется технология децеллюляризации. В её основе лежит разрушение клеточных мембран, органоидов и ядерного материала, в результате чего остаётся внеклеточный матрикс (ВКМ) [3]. Такой матрикс имеет трёхмерную структуру обесклеченной ткани и не обладает антигенной нагрузкой [6], что делает его перспективным материалом для использования в трансплантологии [4]. Особенно актуальным в настоящее время является создание децеллюляризирован-ных дермальных матриксов, которые могут быть применены в ожоговой терапии и пластической хирургии.
Для проведения децеллюляризации могут применяться различные способы: физические, химические, детергентные и ферментативные [2, 5]. К физическим относят механическую и ультразвуковую обработку и заморозку/оттаивание; к химическим — воздействие щелочами и кислотами, а также гипертоническими солевыми растворами; в качестве детергентов могут использоваться ионные (дезоксихолат натрия, додецил сульфат натрия, Тритон-Х200), неионные (Тритон-Х100) и цвиттер-ион-ные (CHAPS, сульфобетаины) детергенты, к ферментам — трипсин, папаин и различные нуклеазы [2]. Стоит отметить, что различные методики и реагенты воздействуют
60
на ткани определённым образом, с чем связаны возможные негативные последствия децеллюляризации (например, нарушение биологических свойств матриксов в связи с нарушением их структурной организации). В связи с этим имеется необходимость подбора оптимального методики де-целлюляризации, эффективность которой может быть охарактеризована с помощью оценки содержания оставшихся компонентов клеток, например ДНК [1].
Таким образом, целью нашего исследования является сравнительная оценка эффективности элиминации ядерного материала после химической, детергентной и ферментативной децеллюляризации дермы свиньи.
Материалы и методы
Основой для создания БМ была нативная кожа поросёнка (самец, возраст 2 мес.) породы Ландрас массой 13,4 кг, полученного из учебно-производственного комплекса «Пятачок» на базе Кубанского государственного аграрного университета. Животное наркотизировали растворами золетила (Zoletil 100, 1 мг/кг) и ксилазина (Rometar, «Spofa», 4 мл/кг). Животное содержалось в стационарной клетке, индивидуально. В качестве корма применялся стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для свиней КК 56. Водопроводная очищенная вода давалась в поилках ad libitum. Животные содержались в контролируемых
условиях окружающей среды: температура воздуха — 18-22°С, относительная влажность — 60-70%. Освещение в помещениях — естественно-искусственное, 12-часовой световой цикл. Образцы дермы толщиной 0,5 мм брали после предварительного механического удаления эпителиального слоя электродерматомом в стерильных условиях. Образцы дермы хранили при -80°С. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом (протокол № 96 от 29.01.2021).
При децеллюляризации по Протоколу № 1 (химический метод) образец дермы при температуре 25°С обрабатывали смесью 5% р-ра NaOH («Вектон», РФ) и 3% р-ра H2O2 («Йодные Технологии и Маркетинг», РФ) в соотношении 1:1 в течение 17 ч, затем отмывали в дистиллированной воде и нейтрализовали 1 н. H2SO4. По Протоколу № 2 дерму помещали в деионизирован-ную воду на 4 ч. Затем проводили 2 цикла обработки 1% Тритоном Х-100 («Sigma Aldrich», США) и 4% р-ром дезоксихолата натрия («Sigma Aldrich», США) в комбинации с 0,002 М №2-ЭДГА общей продолжительностью 12 ч при комнатной температуре в шейкере-инкубаторе (170 об./мин). При каждой смене растворов образцы отмывали деионизированной водой в течение 10 мин. По Протоколу № 3 размороженную дерму инкубировали в течение 6 ч (3 цикла по 2 ч) при 37°С в р-ре трипсина-Версена («Биолот», Россия). Затем с целью удаления ядерного материала клеток образцы инкубировали в р-ре свиной панкреатической ДНКазы («Sigma Aldrich», США; 2000 ЕД в 200 мл фосфатного буфера) при 37°С в течение 4 ч. Между циклами также проводилась отмывка образцов деионизированной водой.
Количественное определение содержания ДНК выполняли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 («Thermo Fisher Scientific Inc», США) с использованием набора реагентов («Dneasy Blood and Tissue Kit»,
«Qiagen», Швеция) по протоколу фирмы-изготовителя. Статистическая обработка полученного материала производилась с использованием пакета программ MS Excel, v6.0, GraphPad Prism version 6.04. Результаты исследований оценены с использований t-кри-терия Стьюдента. Доверительный интервал рассчитывался по таблице распределения Стьюдента. Достоверными признавались различия при значениях р<0,05.
Результаты и их обсуждение
В результате использования различных протоколов обесклечивания были получены образцы децеллюляризированной дермы. Количественный анализ показал, что содержание ДНК в полученных образцах после обработки по всем протоколам снижалось примерно в три раза по сравнению с содержанием в нативной дерме свиньи (рис.). При этом содержание ДНК в образцах, полученных химическим методом (Протокол № 1), по сравнению с данными образцов, обработанных детергентным и энзимати-ческим методами (Протоколы № 2 и № 3 соответственно), было повышено на 18,05 и 26,05% соответственно.
ДНК
T
11» 91
62.B6 53-25 49.87
Кпи^пная ДСОЧД I(1 иIи>пг Г/1 Ирппжоп ГГ* П(КППКОП №3
Рис. Количественный анализ содержания ДНК в на-тивной и децеллюляризированной различными методами дерме свиньи. ** — p<0,01; *** — p<0,001. Fig. Quantitative DNA analysis in native and decellularized porcine dermis by various methods. **— p<0.01; ***—p<0.001.
Полученные результаты иллюстрируют эффективность обесклечивания по Протоколам № 2 и № 3, с помощью которых из клеточных матриксов был успешно удалён ядерный материал до требуемых для децеллюляризации и успешной имплантации показателей (~50 нг/мг ткани) [1, 2].
Выводы
Несмотря на различные подходы к де-целлюляризации дермы, использованные нами методики показывают удовлетворительные результаты по количественному содержанию нуклеиновых кислот в мат-риксах. Тем не менее, хотя наилучшие ре-
зультаты показал ферментативный метод, являющийся наиболее «мягким» методом обесклечивания, стоит отметить, что этот метод наиболее дорогостоящий, что значительно увеличивает стоимость получаемых материалов. В связи с этим наиболее перспективным методом децеллюляриза-ции выступает детергентный метод, показавший большую эффективность при элиминации ДНК дермы. Однако необходимо отметить, что химический метод при дальнейшей разработке, направленной на более эффективное разрушение ядерного материала, позволит существенно снизить себестоимость получаемых дермальных матриксов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Максяткина Л.В., Абатов Н.Т., Ахмалтдинова Л.Л., Бадыров Р.М., Трошин В.В. Применение биоим-плантов при пластике дефектов передней брюшной стенки. Вестник Казахского Национального медицинского университета. 2019;1:304-309. [Maksyatkina L.V., Abatov N.T., Ahmaltdinova L.L., Badyrov R.M., Troshin V.V. Primenenie bioimplan-tov pri plastike defektov peredney bryushnoy stenki [The use of bioimplants for plastic surgery of defects of the anterior abdominal wall]. Bulletin of the Kazakh National Medical University. 2019;1:304-309. (In Russian)].
2. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057
3. Duisit J., Maistriaux L., Bertheuil N., Lellouch A.G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.
Current Transplantation Reports. 2021;8(2):1-13. DOI: 10.1007/s40472-021-00317-2.
4. Faulk D.M., Badylak S.F. Natural biomaterials for regenerative medicine applications. Regenerative Medicine Applications in Organ Transplantation. 2014;8:101-112. DOI: 10.1016/B978-0-12-398523-1.00008-2.
5. Hussein K.H., Park K.M., Teotia P.K., Yang J.W., Kim H.M., Honq S.H., Yang S.R., Park I.C., Park S.M., Woo H.M. Fabrication of a biodegradable xenoantigen-free rat liver scaffold for potential drug screening applications. Transplantation Proceeding. 2013;45(8):3092-3096. DOI: 10.1016/B978-0-12-398523-1.00008-2.
6. Keane T.J., Swinehart I.T., Badylak S.F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 2015;84:25-34. DOI: 10.1016/j. ymeth.2015.03.005.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Мелконян Карина Игоревна, к.м.н., ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: kimelkonian@gmail.com
Русинова Татьяна Викторовна, к.б.н., ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: rusinova.tv@mail.ru
Karma I. Melkonyan, Cand. Sci. (Med.), Kuban State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia;
e-mail: kimelkonian@gmail.com
Tatyana V. Rusinova, Cand. Sci. (Biol.), Kuban State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia; e-mail: rusinova.tv@mail.ru
Козмай Яна Андреевна*, ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России; e-mail: yana.kozmay@gmail.com
Асякина Алевтина Сергеевна, ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России; ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»; e-mail: alevtina.asyakina@mail.ru
Yana A. Kozmai*, Kuban State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia; e-mail: yana.kozmay@gmail.com
Alevtina S. Asyakina, Kuban State Medical University of the Ministry of Health Care of Russia; Kuban State University; e-mail: alevtina.asyakina@mail.ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
