CC BY
67
УДК 616.517:612.017.1
В. А. ОХЛОПКОВ О. В. ПРАВДИНА Р. В. ГОРОДИЛОВ Е. А. ЗЫКОВА
Омская государственная медицинская академия
ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ТОЛЛ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ 2-го И 4-го ТИПОВ В КОЖЕ БОЛЬНЫХ ВУЛЬГАРНЫМ ПСОРИАЗОМ
Изучено распределение толл-подобных рецепторов 2-го и 4-го типов в коже больных псориазом. Установлено статистически значимое повышение их экспрессии, что может играть ведущую роль в формировании воспалительного процесса.
Ключевые слова: толл-подобные рецепторы, псориаз, врожденный иммунитет.
Псориаз — хронический дерматоз мультифакто-риальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации и воспалением в дерме. Пристальный интерес к этому заболеванию объясняется не только высоким удельным весом псориаза среди других болезней кожи (12—15 %), но и ростом встречаемости этого дерматоза.
В настоящее время большое внимание уделяется роли распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления в коже больных псориазом.
Защитные реакции в барьерных тканях, в том числе в коже, направлены на распознавание, уничтожение и удаление патогенов из организма. Сегодня в литературе отмечают, что механизмы врожденного иммунитета обладают специфичностью, направленной против консервативных молекулярных структур микроорганизмов, получивших название патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР). Рецепторы клеток иммунной системы, способные распознавать эти участки, получили название пат-тернраспознающие рецепторы (PRRs). Одними из наиболее важных PRRs, выявляющих патогенные компоненты и запускающих активирующие каскады иммунных реакций, считают толл-подобные рецепторы (от TLR1 до TLR9) [1, 2].
Толл-подобные рецепторы (англ. ТоП-like receptor, TLR; от нем. То11 — странный) — класс клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов и активируют клеточный иммунный ответ [3, 4].
Согласно клеточной локализации, TLRs делят на две группы. К первой относят TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 и TLR6, присутствующие на поверхности цитоплазматической мембраны клетки. Лигандами для этих рецепторов являются внеклеточные патогенассоци-ированные молекулярные паттерны. Вторую группу составляют TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, локализующиеся в мембранах внутриклеточных органелл — эндосом, лизосом, аппарата Гольджи.
Каждый ТЬЯ играет важную роль в быстром распознавании специфических микробных компонентов, включая бактерии, грибы, вирусы и некоторые простейшие.
ТЬЯ2 был первоначально описан как рецептор, распознающий пептидогликан — главный структурный компонент клеточной стенки грамположитель-ных бактерий и микробных липопептидов, найденных и в грамположительных, и в грамотрицательных бактериях [5].
ТЬЯ4, мембранный белок, член группы толл-по-добных рецепторов, обеспечивающих функционирование врожденного иммунитета, связывает липо-полисахарид клеточной стенки бактерий. Сигнал, передающийся в клетку через этот рецептор, функционально близок к рецептору интерлейкина-1 и является одним из древнейших в системе антибактериальной защиты организма. ТЬЯ4 — ключевой медиатор иммунного ответа на грамотрицательные бактерии.
Роль ТЬЯ8 менее изучена при хронических дерматозах, в частности при псориазе. Так, была обнаружена выраженная экспрессия ТЬЯ1 на кератино-цитах базального слоя эпидермиса у больных псориазом [6, 7]. В пораженной коже больных псориазом выявлена выраженная экспрессия ТЬЯ2 в верхних рядах шиповатого слоя эпидермиса, в то время как в коже здоровых лиц и непораженной коже больных псориазом она была зафиксирована в нижних рядах шиповатого слоя, располагавшегося над базальным. Обнаружено уменьшение экспрессии ТЬЯ5 на кера-тиноцитах базального слоя эпидермиса пораженной кожи больных псориазом по сравнению с кожей здоровых лиц [8—10]. В коже больных псориазом установлена повышенная экспрессия ТЬЯ2 и ТЬЯ4 на ядросодержащих клетках эпидермиса и эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, а также на макрофагах и гистиоцитах, располагающихся в воспалительном инфильтрате [11 — 13]. Имеющиеся у больных клинические проявления воспаления свидетельствуют о наличии активированного состояния клеток эпидермиса и дермы и, наряду с многими
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (108) 2012 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (108) 2012
другими факторами, могут быть обусловлены участием толл-подобных рецепторов [14]. Увеличение экспрессии TLR2 и TLR4 в клетках эпидермиса и воспалительном инфильтрате дермы больных псориазом не позволяет однозначно утверждать, что псориаз можно отнести к дерматозам инфекционной этиологии. Тем не менее в современной литературе отсутствуют работы, посвященные исследованию распределения TLR-рецепторов на фоне проводимой специфической терапии псориаза.
Цель работы — оценка экспрессии толл-подоб-ных рецепторов 2-го и 4-го типов в псориатической папуле у пациентов с вульгарным псориазом средней степени тяжести при проведении стандартной терапии.
Материал и методы исследования. Исследование было проведено в дизайне проспективного когорт-ного. Материалом служили биоптаты, полученные из очагов пораженной кожи 20 больных псориазом (мужчины), давших информированное согласие на участие в исследовании. Возраст пациентов варьировал от 18 до 55 лет, длительность заболевания — от 5 до 25 лет. В исследовании участвовали пациенты с прогрессирующей стадией псориаза (вульгарная форма). Критерии исключения: наличие сопутствующей соматической патологии у пациентов; осложненные формы псориаза; более двух обострений в год; последнее лечение по поводу псориаза менее шести месяцев назад; развитие побочных эффектов на получаемую терапию; нарушение режима лечения; осложненный аллергологический анамнез; алкоголизм и наркомания; прием лекарственных препаратов, способных влиять на течение основного заболевания.
Забор биоптатов кожи осуществляли под местной анестезией 2 %-м раствором лидокаина с использованием микротома (punch-биопсия). Кусочки ткани фиксировали в 10 %-м нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере (рН 7,2 — 7,4) на протяжении 12 — 24 часов. Проводку, заливку в парафин и приготовление парафиновых срезов проводили по общепринятой методике. Количество и распределение толл-подобных рецепторов 2-го и 4-го типов исследовали иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к TLR2 и TLR4 производства японской фирмы Histofine Simple Stain Max Po (MULTI). Для завершения окрашивания проводили фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные иммуногисто-химические препараты помещали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа. Экспрессию толл-подобных рецепторов в эпидермисе оценивали путем подсчета количества позитивных клеток на 1000 кератиноцитов, вычисляя индекс экспрессии. Толл-подобные рецепторы 2-го и 4-го типов выявляли исключительно в эпидермисе в виде коричневого окрашивания цитоплазматической мембраны кератиноцитов. Для оценки достоверности различия групп использовали непараметрический метод — критерий Манна —Уитни.
Результаты исследования. На момент обращения (1-я исследовательская точка) у 17 пациентов патологический процесс имел распространенный характер. Локализация высыпаний наблюдалась в основном на разгибательных поверхностях верхних и нижних конечностей, особенно в области коленных и локтевых суставов, на волосистой части головы («псори-атическая корона»), крестце и боковых поверхностях туловища.
Прогрессирующая стадия заболевания характеризовалась наличием не только многочисленных
плоских воспалительных эпидермально-дермальных милиарных, лентикулярных и нумулярных папулезных элементов плотноватой консистенции, округлой формы и розово-красного цвета с наклонностью к периферическому росту и слиянию с образованием бляшек различных размеров и очертаний, но и периферического венчика роста, центральным характером шелушения, при котором краевая зона папулы (бляшки) остается свободной от чешуек. Чешуйки сухие, рыхло расположенные, серебристобелого цвета. Резко выражена изоморфная реакция Кебнера (появление свежих высыпаний в местах травматизации кожи). Четко определялись все симптомы классической псориатической триады: феномен стеаринового пятна, симптом терминальной пленки, феномен кровяной росы. Эта триада выявляется путем поскабливания поверхности псориатической бляшки. Феномен стеаринового пятна объясняется постоянным слущиванием поверхностных корнеоцитов, под которыми нижележащие роговые чешуйки содержат большое количество воздуха и становятся хрупкими. При этом они крошатся, образуя матовую поверхность, похожую на ту, что возникает при поскабливании застывшего стеаринового пятна. Симптом терминальной пленки объясняется отсутствием зернистого слоя, и в результате дальнейшего поскабливания происходит слущивание рогового слоя с обнажением матовых клеток шиповатого слоя. Наконец, феномен капли росы объясняется тем, что сосочки дермы в псори-атической коже имеют неодинаковую длину и при поскабливании их кровеносные капилляры, лежащие на разной глубине, повреждаются последовательно. В результате на поверхности псориатической папулы из повреждаемых гемокапилляров сосочков последовательно появляются капельки крови, напоминающие капли росы. У трех больных диагностирована псориатическая эритродермия. Патологический процесс занимал практически всю поверхность кожного покрова. Кожа имела багрово-красный цвет с синюшным оттенком, отмечались отек, инфильтрация, обильное крупно- и мелкопластинчатое шелушение. У пациентов на момент начала лечения индекс PASI колебался в пределах от 15,3 до 45,2 единицы. Гистологическое исследование показало, что основу псориатической папулы составлял полиморфноклеточный воспалительный инфильтрат, который локализовался как в области дермы, так и в эпителиальном компартменте. Популяция нейтрофильных лейкоцитов выявлялась преимущественно в субкор-неальном отделе эпидермиса в виде очаговых скоплений (микроабсцессы Мунро — Сабуро-Копытов-ского). В отдельных наблюдениях отмечался выраженный эпидермотропизм клеток воспалительного инфильтрата. Новообразованные сосуды сосочкового слоя дермы с признаками полнокровия были выстланы изнутри крупными эндотелиоцитами. В просвете мелких капилляров регистрировались феномен краевого стояния лимфоцитов и маргина-ция нейтрофилов. Акантоз носил регулярный характер и проявлялся выраженной пролиферацией эпидермальных гребешков в глубь дермы с расширением их в нижних отделах, что придавало акантотическим тяжам колбообразную форму. Экспрессия ТЬЯ2 и ТЬЯ4 имела место исключительно в эпидермисе в виде коричневого окрашивания цитоплазматических мембран кератиноцитов, преимущественно в базальном и супрабазальном слоях (рис. а и б).
На 21-й день (2-я исследовательская точка) после начала комплексного лечения клиническая картина
Рис. Экспрессия TLR2 и TLR4 в эпидермисе больного псориазом. Иммуногистохимическое окрашивание с моноклональными антителами: а — TLR-2 до лечения, б— TLR-4 до лечения, в — TLR-2 после лечения, г — TLR-4 после лечения
соответствовала стационарной стадии патологического процесса у 15 пациентов и регрессирующей стадии — у пяти. В стационарной стадии не было зарегистрировано образования свежих эффлорес-ценций и периферического роста папул и бляшек; отмечались снижение яркости элементов, регресс папул и бляшек в центральной зоне и по периферии в виде «псевдоатрофического» ободка Воронова, шелушение по всей поверхности элемента. У пациентов отсутствовала изоморфная реакция Кебнера, были слабо выражены симптомы псориатической триады. В регрессирующую стадию на месте разрешившихся элементов появлялись гипо- или гиперпигментирован-ные пятна. После окончания терапии индекс РЛБ1 колебался в пределах от 6,3 до 9,1 единицы. При статистическом исследовании было обнаружено достоверное снижение этого показателя (р =7,1+—4,52). В биоптатах пациентов отчетливо снижалась степень выраженности акантоза, уменьшалось количество макрофагов и лимфоцитов, исчезала инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами. Кроме того, отсутствовали воспалительный инфильтрат и эпидермальная пролиферация. Экспрессия ТЬЯ2 и ТЬЯ4 к моменту окончания лечения была такой же, как и в 1-й исследовательской точке (рис. в и г). При статистическом анализе (табл.) было зафиксировано достоверное увеличение индекса экспрессии ТЬЯ2 в эпидермисе к моменту окончания терапии (р = 0,029),
в то время как индекс экспрессии ТЬЯ4 статистически значимо не изменился (р = 0,34).
Обсуждение результатов исследования. Полученные данные свидетельствуют о том, что в коже больных псориазом отмечается повышенная экспрессия ТЬЯ2 и ТЬЯ4, выявленных исключительно в эпидермисе. ТЬЯ представляют собой группу клеточных рецепторов, специфически распознающих различные микроорганизмы путем взаимодействия с РАМР. Система врожденного иммунитета способна различать попадающие в организм патогены, активировать разные варианты развития защитных реакций для их эффективного и быстрого уничтожения и стимулировать начальные этапы развития реакций приобретенного иммунитета в зависимости от типа патогена.
Как показали результаты исследования, в биопта-тах, полученных из очагов поражения больных псориазом, экспрессия ТЬЯ2 и ТЪЯ4 наблюдалась в базальном и супрабазальном слоях эпидермиса, а в роговом слое и зонах паракератоза отсутствовала. При статистическом анализе (табл.) было обнаружено достоверное увеличение индекса экспрессии ТЬЯ2 в эпидермисе к моменту окончания терапии (р = 0,029), в то время как индекс экспрессии ТЬЯ4 статистически значимо не изменился (р = 0,34). В ряде работ в пораженной коже больных псориазом была выявлена выраженная экспрессия ТЬЯ2 в верхних
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (108) 2012 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (108) 2012
Индекс экспрессии ТЬК в биоптатах кожи больных вульгарным псориазом на фоне лечения
Экспрессия TLR2 и TLR4 1-я исследовательская точка (клиническое и биопсийное исследование) 2-я исследовательская точка (на 21-й день лечения)
TLR2 (Q25^Me^Q75) 973-974-976 975-977-981
TLR4 (Q25^Me^Q75) 975-977-978 974,75-975-977,25
рядах шиповатого слоя эпидермиса, а в коже здоровых лиц и непораженной коже больных псориазом — в нижних рядах шиповатого слоя, располагавшихся над базальным слоем. Отмечено значительное снижение экспрессии ТЬЯ2 после проведения традиционной терапии больных псориазом, что не согласуется с нашими результатами. Возможно, это связано с малым объемом выборки пациентов [6].
Хотя, вероятно, мы имели дело с инфекционнозависимой формой псориаза, при которой одним из инициирующих факторов обострения являются антигены микроорганизмов. Считается, что персис-тенция антигенов микроорганизмов способна взаимодействовать с ТЬЯ и активировать их к синтезу провоспалительных цитокинов, поддерживающих миграцию иммунокомпетентных клеток в очаги поражения. В связи с этим увеличение ТЬЯ2, выявленное в настоящем исследовании, следует рассматривать как один из протективных механизмов, вызывающих ремиссию вульгарного псориаза.
Выводы
1. Исследование экспрессии толл-подобных рецепторов псориатической папулы позволяет оценить роль инфекционных агентов в патогенезе дерматоза.
2. Толл-подобные рецепторы 2 и 4 типа у больных вульгарных псориазом экспрессируются исключительно в эпидермисе вне зависимости от стадии дерматоза.
3. К моменту окончания курса традиционной терапии вульгарного псориаза в очагах сыпи достоверно повышается количество толл-подобных рецепторов 2-го типа позитивных клеток эпидермиса, в то время как количество толл-подобных рецепторов 4-го типа остается прежним.
Библиографический список
1. Симбирцев, А С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета / А. С. Симбирцев // Иммунология. - 2005. - № 6. - С. 368-377.
2. Ярилин, А. А. Основы иммунологии / А. А. Ярилин. -М. : Медицина, 2005. - 606 с.
3. Меджитов, Р. А. Врожденный иммунитет / Р. А. Меджи-тов, Ч. И. Джаневей // Казанский медицинский журнал. -2004. - № 1. - С. 161-167.
4. Катунина, О. Р. Функции толл-подобных рецепторов как компонента врожденного иммунитета и их участие в патогенезе дерматозов различной этиологии / О. Р. Катунина // Вестник дерматологии и венерологии. - 2011. - № 2. -С. 18-23.
5. Tapping, R. I. Genetic polymorphisms within the human Toll-like receptor 2 subfamily / R. I. Tapping, C. M. Johnson // Dermatology. — 2007. — Vol. 50, № 8. — Р. 25 — 29.
6. Bеgone, E. Е. Toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria / E. Е Bеgone, D. A Zhang // Science. — 2004. - Vol. 21, № 6. - Р. 1522-1526.
7. Henseler, T. I. Disease concomitance in psoriasis / T. I. Hen-seler, E. A Christophers // Dermatology. — 2000. — Vol. 62, № 2. - Р. 982-986.
8. Hansson, G. K. Toll to be paid at the gateway to the vessel wall / G. K. Hansson, A A Curry // Dermatology. - 2005. -Vol. 78, № 4. - Р. 1085-1087.
9. Randhawa, A. K. Toll-like receptors: their roles in bacterial recognition and respiratory infections / A. K. Randhawa, T. R. Hawn // Dermatology. - 2008. - Vol. 81, № 10. - Р. 479-495.
10. Beutler, B. A Evolution of the TIR, tolls and TLRs: functional inferences from computational biology / В. A Beutler, М. A Reh-li // Microbiotogy and Immunology. - 2002. - Vol. 48, № 32. -Р. 1-21.
11. Iwasaki, A. A Toll-like receptor control of the adaptive immune responses / A A Iwasaki, R. A Medzhitov // Immunology. -2010. - Vol. 57, № 40. - Р. 987-995.
12. Medzhitov, R. A A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity / R. A Medzhi-tov, C. A. Janeway // Immunology. - 2006. - Vol. 91, № 68. -Р. 394-397.
13. Kupper, T. S. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences / T. S. Kupper, R. C. Fuhlbrigge // Immunology. - 2004. - Vol. 31, № 3. - Р. 211-222.
14. Lu, Y. C. LPS/TLR4 signal transduction pathway Cytokine 42 / Y. C. Lu, P. S. Ohashi // Immunology. - 2008. - Vol. 2, № 10. - Р. 145-151.
ОХЛОПКОВ Виталий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой дерматовенерологии и косметологии.
ПРАВДИНА Ольга Валерьевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры дерматовенерологии и косметологии.
ГОРОДИЛОВ Роман Вячеславович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии.
ЗЫКОВА Елена Александровна, ассистент кафедры дерматовенерологии и косметологии.
Адрес для переписки: 644001, г. Омск, ул. 5-я Линия, 117а.
Статья поступила в редакцию 29.03.2012 г.
© В. А. Охлопков, О. В. Правдина, Р. В. Городилов,
Е. А. Зыкова
