CC BY
71
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12
Текущий раздел: Молекулярная медицина
Оценка экспрессии мРНК гена р16 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки
Н.В. Мельникова1, В.К. Боженко1, Л.А. Ашрафян1, И.Б. Антонова1, О.И. Алешикова1, , О.Н. Бурменская2, Д.Ю. Трофимов2, Е.А. Кудинова1, Л.З. Хунова1, Н.Ю.Двинских1
1 ФГБУ «Российский научный центррентгенорадиологии» Минздравсоцразвития РФ, г.Москва;
2 ООО «ДНК-Технология», Москва,
Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v12/papers/meln_v12.htm Статья опубликована: 25 октября 2012 года
Сведения об авторах
Рабочий адрес: 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д.86 , ФГБУ «Российский Научный Центр Рентгенорадиологии» Минзравсоцразвития России.
Мельникова Н.В. - и.о.в.н.с. , к.м.н. лаборатории патоморфологии ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7495333 91 30 [email protected] Боженко В.К. -г.н.с., профессор, д.м.н. руководитель отдела патоморфологии и лабораторной диагностики ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России Ашрафян Л.А. - член-корреспондент РАМН, профессор, руководитель отдела онкогинекологии ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7499 1206077 Антонова И.Б. -д.м.н., в.н.с. отдела онкогинекологии ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7499 1206077
Алешикова О.И. - к.м.н., м.н.с. отдела онкогинекологии ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7499 1206077
Кудинова Е.А. - к.м.н. зав. клинико-диагностической лабораторией ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России
Хунова Л.З. - аспирант лаборатории комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7499 1206077
Двинских Н.Ю. - к.м.н. врач-патологоанатом патологоанатомического отделения ФГБУ
«РНЦРР» Минздравсоцразвития России +7495333 91 30
Рабочий адрес: .Москва, Варшавское шоссе,д.125 Ж, корп. 6
Бурменская О.Н. -.к.б.н. ООО «ДНК-Технология», Москва +74959804555
Трофимов Д.Ю. - д.б.н., ООО «ДНК-Технология», Москва +74959804555
Резюме
В статье анализируются возможности оценки экспрессии мРНК гена p16 методом количественной
ПЦР при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки
Ключевые слова: цервикальная интраэпителиальная неоплазия, р16, количественная ПЦР
Evaluation of mRNA expression for p16 gene in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer
N.V.Melnikova1, V.K.Bozhenko\ LA.Ashrafyan1, I.B.Antonova1, O.LAleshikova1, O.N.Burmenskaya2, D.Yu. Trofimov2, E.A.Kudinova1, L.Z. Hunova1, N.Yu.Dvinskih1
1 - Federal State Establishment “Russian Scientific Center of Roentgenoradiology оf Health Ministry”, Moscow
2 - “Company DNA-Technology LLC”, Moscow
Summary
The article analyzes the possibility of the expression analysis of p16 mRNA by quantitative PCR in cases of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.
Keywords: cervical intraepithelial neoplasia, р16, immunohistochemical study, quantitative PCR
Оглавление:
Введение
Материалы и методы исследования Результаты и обсуждение Заключение Список литературы
Введение
В Российской Федерации наибольший удельный вес в структуре онкологической смертности женщин имеют злокачественные новообразования шейки матки (4,6%) [1]. Установлено, что этиологическим агентом его развития являются вирусы папилломы человека (ВПЧ) группы «высокого риска заболевания» (ВПЧ 16, 18 и родственные им) [2]. Только у части инфицированных женщин в результате персистенции вируса наблюдается развитие цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN). Пристального внимания заслуживает изучение факторов, способствующих развитию рака шейки матки у данной группы больных [3,4].
Белок р16INK4a - ингибитор циклин D-зависимых клеточных киназ останавливает переход клеток из G1 в S-фазу, т.е. инициацию клеточного деления. Сверхэкспрессия
ингибитора циклинзависимой киназы p16INK4a (p16) в диспластических клетках эпителия шейки матки указывает на наличие активной вирусной инфекции. Показано, что анализ уровня экспрессии р16 методом иммуноцитохимии может использоваться для диагностики рака шейки матки как дополнительный метод к цитологическому исследованию [5-7].
Цель исследования: изучить диагностические возможности тестирования мРНК гена р16 по материалу соскоба шейки матки с использованием количественной ПЦР при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки.
Перейти в оглавление статьи >>>
Материалы и методы исследования
Исследование основано на данных клинико-морфологического и молекулярнобиологического обследования 16 пациенток с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки (средний возраст 41,1 ± 9,6 года) и 40 больных с гистологически подтвержденным диагнозом CIN различной степени (средний возраст 37,5 ± 10,5 года), находившихся на лечении в ФГБУ <<РНЦРР>> Минздравсоцразвития в период с 2006 по 2010 гг. Контрольную группу составили 6 женщин с морфологически неизмененным эпителием шейки матки (средний возраст 38 ± 12,4 года).
Уровень мРНК гена p16 определяли методом количественной ПЦР. Все образцы также исследовались врачом-цитологом. Критерием достоверности были результаты сопоставления с плановым гистологическим исследованием биопсийного и операционного материала.
Для исследований методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) забор материала соскобов цервикального канала и поражений шейки матки выполняли одноразовыми зондами до проведения комплексного обследования и начала лечения заболеваний шейки матки в пробирки со средой для стабилизации РНК. Хранение материала до начала исследования осуществляли при температуре - 70 °С.
Выделение РНК
Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов “RNeasy mini kit” (фирма Qiagen, Германия). Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата, сорбции РНК на колонках, отмывках РНК в спиртовых растворах и элюции РНК. Объем образцов после выделения составил 100 мкл.
Проведение обратной транскрипции
Реакцию обратной транскрипции ставили, используя реактивы фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология» согласно инструкции фирмы производителя.
Проведение ПЦР
Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология». ДНК-зонды, использовавшиеся для детекции продуктов амплификации исследуемых и нормировочных генов, были помечены БАМ. Анализ проводили на ПЦР-амплификаторе ДТ-96 фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология».
Для оценки относительного содержания мРНК р16 в образцах использовали анализ содержания мРНК референтного гена HPRT-1 в том же образце.
Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Ст х (где х - конкретный ген), получаемых для каждого гена на приборе ПЦР «реального времени» после проведения ПЦР реакции. Определение уровня экспрессии мРНК р16 относительно мРНК HPRT-1 считали методом дельта - дельта Си-ти (ДА С) [8]. \p16\l\HPRT1] = Е - (Ш-а2), где
[p16]/[HPRT1] - нормированное по HPRT1 значение экспрессии р16, измеряется в
относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК р16 приходится на 1 копию
HPRT1;
Е - эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;
СП - значение порогового цикла в образце для р16;
0:2 - значение порогового цикла в образце для HPRT1.
При статистической обработке исследуемых переменных было выявлено, что распределение значений не может быть аппроксимировано нормальной функцией распределения, поэтому для оценки достоверности различия значений в группах использовалась непараметрическая статистика - Ц-тест Манна-Уитни.
Перейти в оглавление статьи >>>
Результаты и обсуждение
В результате проведенного анализа соскобов шейки матки минимальные значения экспрессии мРНК р16 INK4a получены для группы неизмененного эпителия шейки матки - 0, 465±0,495 отн. ед. (М ± ББ, где М-среднее, ББ -стандартное отклонение). Уровень экспрессии р16 был выше в группе цервикальных интраэпителиальных неоплазий, так ст1 характеризовалась медианой экспрессии равной 1,358±1,93 отн. ед., а для группы цервикальных интраэпителиальных неоплазий в диапазоне ст2- ст3 значения составили
0,89±0,88 отн. ед.
Максимальных величин экспрессия мРНК р16 INK4a достигала в группе плоскоклеточного рака - 1,48±1,36 отн. ед. (Рисунок 1).
COD диагноз
Рис. 1 Анализ уровня экспрессии мРНК р16 INK4a в неизменнном эпителии шейки матки (норма), при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях (CIN) и плоскоклеточном раке шейки матки (рак).
Также установлено, что достоверно более высоким уровень экспрессии мРНК р16 INK4a был в эпителии клеток с гистологически подтвержденной cin1 в сравнении с неизмененным эпителием шейки матки (/*=0,042) (Рисунок 2).
Boxplot by Group Variable: P16 ink
морфология
Рис. 2. Оценка экспрессии мРНКр16 INK4a в неизмененном эпителии (п) и ст1 (1§).
Достоверно выше уровень экспрессии мРНК р16 INK4a был в группе, объединившей цервикальные интраэпителиальные неоплазии в диапазоне ст2 - ст2-3 - ст 3 в сравнении с неизмененным эпителием шейки матки (Р=0,030) (Рисунок 3).
Boxplot by Group Variable: P16_ink
4,0 .-----------------------------------.-----------------
3,5
3,0
2,5
2,0
С
I
Ю
£ 1,5
1,0
0,0
-0,5
hg n
морфология
Median 25%-75% I Min-Max
Рис.3 Уровень экспрессия мРНК p16 INK4a при ст2 - ст3(Ь§) и в неизмененном эпителии шейки матки (п).
Установлено, что экспрессия p16 INK4a была достоверно выше в клетках инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки в сравнении с таковой в неизмененном эпителии (Р=0,016), что отражено на Рисунке 4.
4,5 |-
4,0 •
3,5 ■
3,0 ■
2,5 •
С
1 2,0 •
Ol
1,5 •
1,0 ■
0,5 •
0,0 •
-0,5
Boxplot by Group Variable: P16 ink
c n
морфология
Median
25%-75%
Min-Max
Рис. 4 Сравнительный анализ экспрессии мРНК р16 INK4a в неизмененном эпителии (п) и раке шейки матки (с).
Полученные нами результаты согласуются слитературными данными, представленными для иммуноцитохимического исследования соскоба с шейки матки [9] . Авторы отмечали, что в случае прогрессировании дисплазии при иммуноокрашивании с антителами к р16 отмечается постепенное увеличение доли позитивных клеток. Однако оценка результатов иммуноцитохимического исследования авторами осуществлялась полуколичественным способом.
Перейти в оглавление статьи >>>
Заключение
Алгоритм обследования и лечения пациенток цервикальными интраэпигелиальными неоплазиями должен включать выявление прогностических молекулярно-биологических маркеров предраковых поражений и рака шейки матки. В современной литературе большую роль играет разработка объективных молекулярно-генетических критериев прогнозирования течения заболеваний шейки матки [4]. В клинической практике используется тест CINtec Plus Cytology, Roche, основанный на иммуногистохимическом
анализе уровня экспрессии р16 как дополнительного маркера молекулярно-
биологических процессов трансформации эпителия шейки матки при наличии вирусной инфекции HPV [10].
В то же время, хорошо известно, что иммуногистохимические методы - трудно стандартизуемые и могут дать только полуколичественную оценку анализируемого параметра. Поэтому мы исследовали возможность анализа уровня экспрессии р16 на основе количественного определения уровня его мРНК. Нами показано, что обнаруженные зависимости уровня экспрессии р16, определяемые на основании оценки количества мРНК, повышаются по мере роста степени дедифференцировки ткани. Установлено, что выраженная экспрессия мРНК гена p16 является ранним маркером неблагоприятного прогноза цервикальных интраэпителиальных неоплазий. Доля случаев с экспрессией линейно возрастает при нарастании тяжести CIN. Выраженная экспрессия не обнаружена в CIN I, выявлена в CIN II, CIN III, инвазивном плоскоклеточном раке, что позволяет отнести ее к прогностическим факторам при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях. Значимые нарушения экспрессии мРНК гена p16 характеризуют трансформацию CIN II и CIN III. Выраженная экспрессия мРНК гена p16 может быть отнесена к неблагоприятным прогностическим факторам цервикальных интраэпителиальных неоплазий, что должно учитываться в алгоритме обследования и лечения больных с местными изменениями шейки матки предопухолевого характера. Наши результаты согласуются с данными, полученными на основе анализа экспрессии белка иммуногистохимическим методом. Следовательно, тестирование мРНК генаp16 с использованием количественной ПЦР может быть использовано в качестве дополнительного маркера для повышения эффективности скрининга рака шейки матки, прогноза развития процессов малигнизации на фоне HPV инфекции и позволит прогнозировать развитие злокачественных поражений шейки матки. Разработанный метод прост и экономически выгоден в исполнении и может заменить ИГХ исследование. Перейти в оглавление статьи >>>
Список литературы:
1. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Москва.: ФГБУ «МНИОИ им. П. А. Герцена» Минздравсоцразвития России.2012. 260 с.
2. Zur Hausen H. Papillomaviruses in anogenital cancer as a model to understand the role of viruses in human cancers.// Cancer Res. 1989. V.49. N17. P.4677-4681.
3. В.К. Боженко, Л.А. Ашрафян, Н. В. Мельникова и др. Особенности экспрессии генов пролиферации и апоптоза при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химиии. 2011. N12. C.54-58.
4. В.К. Боженко, Л.А. Ашрафян, И.Б. Антонова и др. Анализ экспрессии генов пролиферации и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки.// Опухоли женской репродуктивной системы. 2011. N4x.72-76.
5. Bergeron C., Ordi J., Schmidt D. et al..Conjunctive p16INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia.// Am J Clin Pathol. 2010. V.133. N3.P.395-406
6. Denton K.J., Bergeron C., Klement P. et al. The sensitivity and specificity of p16(INK4a) cytology vs HPV testing for detecting high-grade cervical disease in the triage of ASC-US and LSIL pap cytology results.// Am J Clin Pathol. 2010. V.134. N1. P.12-21.
7. Gupta R, Srinivasan R, Nijhawan R et al. Protein p 16INK4A expression in cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix.// Indian J Pathol Microbiol. 2010. V.53.N1.P.7-11.
8. Д.Ребриков, Г.Саматов, Д. Трофимов и др. ПЦР в реальном времени. Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009. 223с.
9. P.Samarawardana, D.L. Dehn, M.Singh et al. p16INK4a is superior to high-risk human papillomavirus testing in cervical cytology for the prediction of underlying high-grade dysplasia.// Cancer Cytopathology. 2010.V. 118.N 3.P. 146-156.
10. I .Tsoumpou, M. Arbyn, M Kyrgiou et al. p16INK4a immunostaining in cytological and histological specimens from the uterine cervix: a systematic review and meta-analysis.// Cancer Treat Rev. 2009. V. 35.N3. P. 210-220.
Перейти в оглавление статьи >>>
ISSN 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
