CC BY
82
© БЕЛОХВОСТИКОВА Т.С., ХОРОШИХ О.В., КИСЕЛЕВА Н.В., СМИРНОВА Е.А. - 2012 УДК 616.15.392-07
ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНА CD9 ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОБЛАСТНЫХ ЛЕЙКОЗАХ
Татьяна Сергеевна Белохвостикова1,2, Оксана Владимировна Хороших1'2,
Надежда Владимировна Киселева2, Екатерина Александровна Смирнова2 ('Иркутская государственная академия последипломного образования, ректор - д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра клинической лабораторной диагностики, зав. - д.м.н., проф. Р.Г. Скворцова; 2Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница, гл. врач - к.м.н. П.Е. Дудин, центр лабораторных исследований, зав. -
к.м.н. Л.Б. Корякина)
Резюме. Проведено ретроспективное исследование фенотипических характеристик 205 случаев острых мие-лоидных лейкозов (ОМЛ). Показано, что определение поверхностных и внутриклеточных антигенов клеток методом проточной цитофлуориметрии для диагностики ОМЛ, имеет первостепенное диагностическое значение. Установлено, что при остром промиелоцитарном лейкозе молекула CD9 присутствовала на бластных клетках во всех исследованных случаях, что позволяет считать ее маркерной молекулой. Обсуждена необходимость включения в диагностическую панель иммунофенотипирования ОМЛ поверхностного антигена CD9.
Ключевые слова: острые миелобластные лейкозы, острый промиелоцитарный лейкоз, антигены клеточной поверхности, тетраспанины.
THE ESTIMATION OF ANTIGENE CD9 EXPRESSION IN ACUTE MYELOLEUKEMIA
T.S. Belokhvostikova1-2, O.V. Khoroshich1-2, N.V. Kiseleva2, E.A. Smirnova2 ('Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education, 2Irkutsk Regional Clinical Hospital)
Summary. The retrospective research of the phenotype characteristics of 205 cases of acute myeloid leukemia (AML) has been conducted. It has been shown that definition of superficial and intracellular antigenes of cells by the method of flowing cytometry for diagnostics of AML has paramount diagnostic value. It has been established, that in acute promyelocytic leukemia the molecule CD9 was on blast cells in all investigated cases, that allows to consider it as marker’s molecule. The necessity of inclusion of immunophenotyping AML of superficial antigene CD9 into diagnostic panel has been discussed.
Key words: acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, antigenes of cellular surface, tetraspаnins.
Лабораторная диагностика острых лейкозов складывается из четырех составляющих: морфологического, цитохимического, иммунофенотипического и генетического исследований. Ни один из критериев не является абсолютным. Например, при гипогранулярном варианте острого промие-лоцитарного лейкоза (ОПЛ) не обнаруживается типичная морфология клеток. В этом случае правильный диагноз можно поставить лишь по совокупности данных, полученных методами проточной цитофлоуриметрии и молекулярногенетического исследования. Иммунофенотипирование и генетические исследования являются наиболее развивающимися областями диагностики гемобластозов, на которых построена их современная классификация [5]. В настоящее время нельзя представить лечение гематологических больных без надежной лабораторной диагностики первичных вариантов заболеваний, контроля проводимой химиотерапии. В связи с этим в последние годы в Иркутской ордена «Знак Почета» областной клинической больнице получила развитие лабораторная диагностика гемобластозов методом проточной цитофлоуриметрии. Являясь быстроразвиваю-щимся, этот метод имеет целый ряд нерешенных проблем. Одной из них является отсутствие Российских рекомендаций и стандартизации протоколов по проведению цитоф-лоуриметрических исследований. По рекомендациям ВОЗ (2008), в диагностике гемобластозов методом проточной цитофлоуриметрии должны предусматриваться не только возможности диагностики первичного варианта опухоли, но и минимальной остаточной болезни для контроля результатов химиотерапии [1]. Однако до настоящего времени метод проточной цитофлоуриметрии является дорогостоящим, а необходимость его использования в повседневной рутинной лабораторной диагностике диктует экономическую реальность минимизации диагностической панели. Это требует поиска надежных маркеров опухолевых клеток, создания оптимальных диагностических панелей моноклональных антител.
Ранее экспрессия антигена клеточной поверхности СЭ9 описана на стволовых кроветворных клетках, предшественниках мегакариоцитов, тромбоцитах, ранних В-клетках, активированных В- и Т-клетках, эозинофилах, базофилах, нормальных и опухолевых тучных клетках, нервных и глиальных клетках головного мозга и периферических нервов, клетках гладких мышц и эпителия сердца и сосудов, стромальных
клетках костного мозга [3]. При острых лейкозах экспрессия CD9 отмечается при В-клеточных острых лейкозах, промиелоцитарном лейкозе, реже при других типах острого миелобластного лейкоза (ОМЛ). CD9 относится к семейству тетраспанинов - трансмембранных белков, которое включает кроме CD9, также CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151 и другие молекулы, всего около 20 белков. Тетраспанины вносят вклад в структурную организацию плазматической мембраны, формируя структуры микрокомплексов, которые влияют на слияние клеток и регулируют их выживаемость, подвижность, включая процессы метастазирования [3,4].
В связи с изложенным целью нашего исследования явилась оценка экспрессии антигена CD9 на бластных клетках при различных вариантах ОМЛ.
Материалы и методы
Нами проанализированы 205 случаев ОМЛ. Разделение на исследуемые группы проводили в соответствии с вариантами лейкоза по ФАБ (франко-американо-британской) классификации. Всего исследовано 7 групп ОМЛ: М0, М1, М2, М3, М4, М5, М6. Исследование проводилось на 2-х лазерном проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Beckton Dickinson, США) с возможностью регистрации прямого, бокового светорассеивания и 4-х параметров флуоресценции клеток. Настройка прибора проводилась с применением калибровочных частиц «Calibrate». Полученные данные обрабатывались с помощью программы «CellQuest pro». Во всех случая использовалась одноэтапное исследование с использованием следующей панели моноклональных антител: CD45, CD13, CD33, CD117, CD9, МРО, CD64, CD95, CD71, CD14, CD4, CD8,CD3, CD235a, CD 41a, CD34, tdt, HLA-DR, CD15, CD7, CD36, CD5, CD10, CD19, CD38, CD56, CD11q IgM, CD22, CD20, Kappa, Lambda, CD203a Материалом служили образцы костного мозга и периферической крови больных, стандартно стабилизированные К2 EDTA. Окраску клеток моноклональными антителами, мечеными флуорохромами, производили с использованием лизирования с последующей отмывкой клеток. Положительной считали экспрессию маркера более чем на 20% клеток. Оценивали наличие маркера на исследуемых клетках и плотность маркера с использованием стандартизованного значения интенсивности флуоресценции клеток.
Статистическую обработку проводили с помощью стандартного пакета программного обеспечения Excel. Рассчитывались относительные величины, средние и ошибки средних.
Результаты и обсуждение
По данным проточной цитофлоуриметрии OMЛ распределились по вариантам следующим образом (табл. 1). Наиболее частыми вариантами явились М1-М2 варианты, в совокупности составившие 41,5%, М4 - 26,3%, М3 ^ПЛ)
- 11,2% случаев. Ранее эти данные нами обсуждались по результатам пятилетних исследований [2].
Таблица 1
Распределение вариантов СМЛ по данным проточной цитофлоуриметрии в 2005-2011 гг.
Вариант по FAB классификации ОМЛ Число больных ОМЛ % встречаемости ОМЛ в Иркутской области
М0 20 9,8
М1 31 15,1
М2 54 26,3
М3 23 11,2
М4 54 26,3
М5 7 3,4
М6 11 5,4
Бифенотипические 5 2,4
Всего 205 100%
Анализ протоколов исследований экспрессии антигена СЭ9 при ОМЛ выявил следующее (рис. 1). Нами отмечено, что СЭ9 встречается при всех вариантах ОМЛ. Экспрессия
МО М1 М2 М3 М4 МБ Мб
Рис. 1. Экспрессия СЭ9 в % при различных вариантах ОМЛ.
СЭ9 на бластных клетках наблюдалась во всех исследуемых группах. В группе М3 (ОПЛ) нами обнаружена экспрессия этой молекулы во всех изученных случаях. Наименьшее диагностическое значение СЭ9 имело при М6 варианте ОМЛ
ЛИТЕРАТУРА
1. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. -М.: Триада, 2005. - 166 с.
2. Хороших О.В., Белохвостикова Т.С., Мусинцева Я.А., Киселева Н.В. Опыт лабораторной диагностики острых лейкозов на территории Иркутской области методом проточной цитофлуориметрии // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2010. - №6. - С.257-259.
- эритромиелозе. При остальных вариантах ОМЛ CD9 экспрессировалась относительно равномерно в 39,74±1,7% случаев. Следовательно, CD9 может использоваться как маркер ОПЛ, поскольку экспрессируется на всех опухолевых клетках.
Следующим этапом исследования явилось изучение ко-экспрессии иммунофенотипических маркеров при остром промиелоцитарном лейкозе для определения значимости обнаружения CD9 на бластных клетках. Основными критериями диагностики ОПЛ методом проточной цитофлуориметрии является отсутствие экспрессии HLA-DR, CD34 и высокий уровень внутриклеточной экспрессии миело-пероксидазы [1]. Аналогичная картина может отмечаться у некоторых больных с ОМЛ с созреванием, чаще при вторичных лейкозах, развившихся вследствие предшествующей терапии. При М1 и М2 вариантах ОМЛ экспрессия CD9 на клетках носила гетерогенный характер, не достигая высоких значений средней интенсивности флуоресценции. При ОПЛ нами отмечено, что CD9 экспрессируется на бластных клетках гомогенно, также интенсивно как и другие диагностически значимые миелоидные маркеры. Это подтверждено высоким значением средней интенсивности флуоресценции у всех обследованных больных 974,1±69,7 абсолютных единиц плотности, в то время как экспрессия общего лейкоцитарного антигена CD45 на этих клетках составила 172,5±46,6 абсолютных единиц плотности.
CD9 обнаруживалась в коэкспрессии с другими диагностически значимыми миелоидными маркерами:
CD33, CD117, CD13, CD71
- в 82,3% случаев ОПЛ.
Результаты экспрессии мие-лоидных маркеров при ОПЛ представлены в таблице 2.
В классификации ВОЗ 2008 года CD9 в качестве маркерной молекулы не указана, в отличие от предыдущей классификации 2001 года. Поэтому целью данного сообщения является «реабилитация» этой молекулы в качестве надежного маркера цитофлоуриметрической картины ОПЛ.
Считаем, что оценка характера, уровня экспрессии антигена CD9 позволяет использовать этот критерий для надежной дифференциальной диагностики ОПЛ с другими миелобластными лейкозами - без экспрессии HLA-DR, диагностировать микрогранулярный вариант ОПЛ, вызывающий затруднения при морфологической оценке клеток. Следовательно, определение уровня и плотности экспрессии антигена CD9 должно быть включено в диагностическую панель при ОМЛ.
3. Ovalle S., Gutierrez-Lopez M.D., Monjas A., Cabanas C. Implication of the tetraspanin CD9 in the immune system and cancer // Inmunologia. - 2007. - Vol. 26. №2. - P.65-72.
4. Powner D., Kopp P.M., Monkley S.J., et al. Tetraspanin CD9 in cell migration // Biochem Soc Trans. - 2011. - Vol. 39. №2. -P.563-567.
5. Vardiman J. W., Thiele J., Arber D.A., et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes // Blood. - 2009. - Vol. 114. №5. - P.937-951.
Таблица 2 Частота встречаемости основных антигенов при ORH (n=23)
Маркер % клеток, экспрессирующих маркер
CD45 97,6±3,5
CD13 87,3 ± 20,7
CD33 96,8±3,5
CD117 66,2±27,3
CD9 96,8±7,9
МРО 96,3±4,5
CD64 44,1±41,5
CD95 97,7±4,1
CD71 62,9±33,9
Информация об авторах: 664079, Иркутск, мрн Юбилейный, 100, тел. (3952) 465270, e-mail: bts@iokb.ru, Белохвостикова Татьяна Сергеевна - заведующая лабораторией, профессор, д.м.н.; Хороших Оксана Владимировна -врач клинической лабораторной диагностики, аспирант; Киселева Надежда Владимировна - врач клинической лабораторной диагностики; Смирнова Екатерина Александровна - интерн.
