CC BY
79
УДК 619:616-092.19+636.4:611.018.4 С.Н. Луканина
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАЩИТЫ ПОЧЕК КРЫС АНТИОКСИДАНТОМ ТИОФАНОМ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
В статье приводятся результаты исследования эффективности защиты почек крыстиофаном при глюкортикод-индуцированном окислительном стрессе.
Установлено, что в условиях хронической глюкокортикоидной нагрузки в организме крыс происходит усиление свободнорадикальных процессов, локальным проявлением которого является повреждение структурных компонентов почки. Сочетанное использование антиоксиданта тиофана и глюкокортикои-дов уменьшает альтерацию клеток и межклеточного вещества компонентов базальной гломерулярной мембраны, увеличивает активность ферментов антиоксидантоной защиты клеток паренхимы почки.
Ключевые слова: почка, окислительный стресс, альтерация, антиоксидант.
S.N. Lukanina
EFFECTIVENESS ESTIMATION OF RAT KIDNEY PROTECTION BY TIOPHAN ANTIOXIDANT IN THE PROCESS OF OXIDATIVE STRESS
The research results of effectiveness of rat kidneyprotectionby thiophan in the process of glucorticoid-induced oxidative stressare given in the article.
It is detrmined that free radical process increase occurs in the conditions of chronic glucocorticoid stress in rat organism. As a result, structural kidney components are locally damaged. Application of both thiophan antioxidant and glucocorticoids decreases alteration of cells and intercellular substance of the basal glomerular membra-necomponents, increases ferment activity for antioxidantal kidney parenchyma cellprotection.
Key words: kidney,oxidative stress, alteration, antioxidant.
В условиях интенсивного ведения сельского хозяйства темп роста животного может рассматриваться в качестве интегрального показателя благополучия особи. С общебиологических позиций под ростом понимается увеличение линейных размеров тела животного, связанного с функциональной активностью костной и хрящевой тканей. Костная ткань обладает уникальной метаболической пластичностью и активно реагирует на любые изменения физиологических и биохимических параметров в организме животных. При промышленной технологии содержания сельскохозяйственных животных эта закономерность отчетливо проявляется у высокопродуктивных особей. Одним из важнейших органов, участвующих в поддержании гомеостаза костной ткани, является почка. Отсутствие в литературных источниках сведений в отношении одного из наименее изученных механизмов реализации стресс-реакции - своднорадикального перекисного оксисления липидов клеток паренхимы почек явилось основанием для выбора данного органа в качестве объекта исследования.
Учитывая важную роль активированных кислородных метаболитов в этиологии и патогенезе различных заболеваний сельскохозяйственных животных [5,6], поиск эффективных антиоксидантных препаратов и оценка их эффективности в эксперименте на лабораторных животных определяет актуальность настоящего исследования.
Цель исследования - изучить эффективность защиты почек крыс антиоксидантом тиофаном при глюкокортикоид-индуцированном окислительном стрессе.
Материал и методы исследования
Исследование проводили на половозрелых самцах крыс линии Вистар массой 220-250 г. Согласно протоколу эксперимента были сформированы 4 группы животных по 10 особей в каждой: интактная, две опытных и одна контрольная. Животных всех групп содержали в стандартных условиях вивария без ограничения доступа к воде и корму. С интактными животными никаких манипуляций не производили. Всем крысам опытных и контрольной групп внутрижелудочным зондом вводили глюкокортикоид преднизолон в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 14 суток.
Крыс первой опытной группы не лечили и через 2 ч после введения преднизолона животным per os вводили водопроводную воду в объеме 2 мл. Крысам второй опытной группы через 2 ч после введения преднизолона per os вводили 2 мл 25% масляного раствора полифункционального серосодержащего антиоксиданта нового поколения тиофана. Крысам контрольной группы через 2 ч перорально вводили 2 мл растительного масла.
На 14-е сутки животных всех групп под эфирным наркозом выводили из эксперимента и забирали равные половины левой почки для проведения морфогистохимических и биохимических исследований. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, заливали в парафин. Срезы толщиной 10 мкм готовили на санном микротоме.
Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Состояние коллагеновых волокон оценивали реакцией по Маллори. Распределение в ткани кислых гликозами-ногликанов (ГАГ) и гликопротеинов определяли сочетанной реакцией с альциановым синим - реактивом Шиффа.
Объем почечных телец и сосудистых клубочков определяли методом морфометрического анализа с использованием комплекса программ Axion Vision. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стъюдента (р<0,05).
Содержание в тканях почки продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) определяли в реакции с 3-хлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами в присутствии ионов меди [4]; концентрацию диеновых коньюгатов (ДК) выявляли реакцией с гептан-изопропаноловой смесью [7]. Активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддимутазы (СОД) регистрировали по степени ингибирования хемилюминесценции в растворе с ксантиноксидазой [10]; содержание каталазы (КАТ) определяли реакцией перекиси водорода с добавлением молибдата аммония [3]. Реакции оценивали спектрофотометрически.
Результаты исследования и их обсуждение
В образцах почки крыс первой опытной группы, у которых создавали модель окислительного стресса путем перорального введения глюкокортикоида преднизолона, отмечаются ярко выраженные изменения структурной организации почечных клубочков и извитых канальцев. На гистологических препаратах почки идентифицируются корковые и юкстамедуллярные нефроны, среди которых морофологически определяются активные нефроны и нефроны с признаками повреждения.
Морфологические признаки активных нефронов в препаратах крыс первой опытной группы не имеют выраженных различий от соответствующих образцов интактных животных (рис. 1, А) и состоят из почечных телец и извитых канальцев. Результаты морфометрического анализа свидетельствуют, что количество активных нефронов в препаратах почки крыс первой опытной группы достоверно (на 44,41%) снижено по сравнению с соответствующими образцами почки интактных животных. При этом площадь почечного тельца, сосудистого клубочка в препаратах почки крыс первой опытной группы и интактных животных не имеют достоверных различий.
В нефронах с признаками деструкции капилляры клубочка местами чрезмерно расширены и полнокровны, местами сужены. Эндотелиальные клетки имеют признаки отека. В сосудах микроциркулярторного русла паренхимы и стромы почки регистрируются признаки сладж-феномена эритроцитов (рис. 1, Б). На светооптическом уровне в исследуемых образцах почки крыс обнаруживается изменение морфологических и тинкториальных свойств компонентов базальной гломерулярной мембраны. Базальная мембрана капилляров сосудистого клубочка в состоянии отека и фрагментации (рис. 1, В), неравномерно окрашивается реактивом Шиффа на гликопротеины. Реакция компонентов базальной гломерулярной мембраны на кислые ГАГ отрицательная. Повреждение сосудов клубочка и компонентов гломерулярной фильтрацонной мембраны,
гипертрофия мезангиальных клеток и наличие эозин-позитивного бесструктурного содержимого в просвете капсулы Шумлянского-Боумена являются характерными морфологическими признаками мембранозной нефропатии.
При гистологическом анализе проксимальных и дистальных извитых канальцев обнаруживается отсутствие полярности строения клеток нефротелия. В цитоплазме нефроцитов проксимального извитого канальца отмечается скопление мелких эозинпозитивных капель, занимающих значительный объем клетки. В просвете канальцев определяется бесструктурное интенсивно оксифильное вещество (рис. 1, Г).
Таким образом, результаты морфогистохимического исследования почек крыс, которым длительно вводили преднизолон, свидетельствуют о глубоких нарушениях структурной организации паренхимы органа. Согласно принципу комплементарности, который постулирует единство структуры и функции, выявленные изменения структуры почечного клубочка, а именно деструкция элементов базальной гломерулярной мембраны и стенки капилляров, несомненно, должны приводить к нарушению фильтрационных функций почки. Это подтверждается скоплением в полости почечного клубочка белка, который оксифильно окрашивается эозином. Можно полагать, что гипертрофия мезангиальных клеток, которые обладают фагоцитарной активностью, связана с их повышенной активностью в отношении деградации крупных молекулярных комплексов, фильтрующихся при повреждении компонентов базальной гломерулярной мембраны. Регистрируемое в просвете извитых канальцев оксифильное бесструктурное вещество является гиалиновыми цилиндрами, что на уровне ультраструктуры является продуктом распада мембранных органелл клеток нефротелия [2].
Объяснение механизмов структурно-функциональных нарушений в почке при длительной глюкокорти-коидной нагрузке остается до конца неизученным. В качестве основного звена патогенеза, по данным литературных источников, рассматривается возникающая под влиянием глюкокортикоидов гипертензия, которая приводит к ишемии органа, а следовательно, и к гипоксии [8, 9]. В условиях ренальной гипертензии в почке происходит перераспределение циркуляции крови и ее аварийный сброс по юкстамедуллярному шунту [1]. При этом корковые нефроны по сравнению с юкстамедуллярными оказываются более ишимизированными, а следовательно, в большей степени подверженными гипоксическому повреждению. Вследствие того, что при гипоксии происходит разобщение окислительного фосфорилирования и, как следствие повышенная генерация клетками АКМ, механизм свободнорадикального повреждения компонентов нефрона является доминирующим. Дифференциальное определение участия глюкокортикоидов и АКМ в повреждении почечных клубочков явилось одной из сложных методологических задач настоящего исследования. Решение данной проблемы основывалось на оценке влияния антиоксиданта тиофана на морфофункциональную характеристику почки крыс при их сочетанном использванием с преднизолоном. При этом в гомогенатах тканей почки крыс первой и второй групп оценивались показатели окислительного стресса.
Результаты морфологического анализа образцов почки крыс второй опытной группы, которым через 2 ч после введения преднизолона перорально вводили масляный раствор антиоксиданта тиофана, показали, что количество клубочков с признаками деструкции имеет статистически достоверно низкий показатель по сравнению животными первой опытной группы. Деструктивные изменения в нефронах имели признаки слабо выраженной мембранозной нефропатии, что на обзорных препаратах определялось по утолщению стенки капилляров клубочка и их неравномерной окраске эозином (рис. 1, Д). При постановке сочетанной гистохимической реакции на кислые ГАГ и гликопротеины структурные компоненты базальной пластины интенсивно окрашиваются реактивом Шиффа. Пролиферации мезангиальных клеток в исследуемых образцах не обнаруживается. Выявленные морфологические признаки могут указывать на дистрофические изменения матрикса базальной гломерулярной мембраны и незначительном нарушении структуры фильтрационного барьера почечного клубочка. Морфологические и тинкториальные свойства цитоплазмы подоцитов свидетельствуют об их высокой функциональной активности. Можно полагать, что в условиях нарушения структуры мембраны капилляров клубочка сохранение функциональной активности гломерулярной фильтрационной мембраны обеспечивается включением адаптивного синтеза подоцитами кислых ГАГ, которые участвуют в формировании фильтрационных щелей.
При гистологическом исследовании извитых канальцев нефронов животных данной группы обнаружено, что клетки нефротелия проксимальных и дистальных извитых канальцев сохраняют характерную для нормы полярность строения и имеют призматическую или кубическую форму (рис. 1, Е). Интенсивность ба-зофильного окрашивания цитоплазмы и реакции на ГАГ возрастает на апикальном полюсе клетки в области щеточной каемки, что может указывать на активность процесса транспорта соединений в данном компар-тменте клетки. В отличие от аналогичных образцов почки животных первой опытной группы в просвете канальцев отсутствуют гиалиновые цилиндры.
fr JfoifoxW >•* ■»*
\w Лг:
91 Н.>«
И ». •«*■. ,3./ V
ИИ »./• < • iP ?,а * л
v**.t ’* v Ш
Mi* , ШЖ
Б
* ЙЛ
Рис. 1. Структурные элементы нефрона: А - почечный клубочек крыс интактной группы;
Б, В, Г - почечный клубочек и нефротелий извитых канальцев животных первой опытной группы;
двойная темная стрелка - полнокровие сосудов и сладж-феномен эритроцитов; темная стрелка - отек гломерулярной мембраны; двойная светлая стрелка - белковый депозит;
Д, Е - клубочек и нефротелий извитых канальцев почки крыс второй опытной группы; темная стрелка - утолщение эндотелия сосудов; двойная светлая стрелка - клетки нефротелия.
Гематоксилин-эозин. Ув. 100 х
Для доказательства участия АКМ в альтерации клеток почечного клубочка, нефротелия и межклеточного вещества гломерулярной мембраны в гомогенатах почки оценивали показатели окислительного стресса (табл.).
Превышение содержания первичных и вторичных продуктов свободнорадикального окисления, а также депрессия ключевых ферментов антиоксидантной защиты в образцах почки крыс первой опытной группы является доказательством развития окислительного стресса.
Показатели окислительного стресса в гомогенатах почек крыс
Группа животных Содержание МДА, мкмоль/г белка Содержание ДК, мкмоль/г белка Активность СОД, моль/мин г белка Содержание КАТ, мкмоль/г белка
Интактная (n=10) 0,18±0,02 7,84±1,05 302,05±2,38 2,97+0,1
Первая опытная (n=10) 0,23+0,01* 11,03±1,13* 2B7,14±3,04* 2,38+0,092*
Вторая опытная (n=10) 0,19±0,01д 8,3±0,75д 299,76+2,04^ 2,86+0,23
Примечания: * отличие показателей крыс первой опытной группы от значений интактных крыс; А различия показателей животных первой и второй опытных групп (р<0,05).
Результаты биохимического анализа показали, что в условиях хронической глюкокортикоидной нагрузки использование антиоксиданта тиофана статистически достоверно снижает содержание в гомогенатах почки крыс второй опытной группы МДА и ДК и статистически достоверно повышает активность СОД.
Анализ образцов почки крыс контрольной группы показал, что структурно-функциональные изменения нефронов и количество почечных телец с признаками деструкции не имели достоверных различий с образцами крыс первой опытной группы. Эта же закономерность сохраняется при сравнении результатов биохимических исследований. Концентрация МДА и ДК, а также активность СОД и КАТ не имели достоверных различий с аналогичными образцами крыс первой опытной группы.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что в условиях хронической глюко-кортикоидной нагрузки в организме животных происходит усиление свободнорадикальных процессов, локальным проявлением которого является повреждение структурных компонентов почки. Сочетанное использование антиоксидата тиофана и глюкокортикоидов уменьшает альтерацию клеток и межклеточного вещества компонентов базальной гломерулярной мембраны, снижает содержание МДА и ДК, увеличивает активность ферментов антиоксидантоной защиты клеток паренхимы почки.
Литература
1. Исаков И.И. Артериальные гипертонии. - Л., 1983. - 200 с.
2. Кириллов Д.О. К морфогенезу хронического пиелонефрита: Электронно-микроскопические исследования // Архив патологии. - 19B0. - №1. - С. 3B-45.
3. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 19BB. - №1. - С. 1б-19.
4. Определение резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови: метод.
рекомендации / сост. Ю.И. Рагина, М.И. Душкин. - Новосибирск, 1998. - 11 с.
5. Пахмутов И.А., Межевов Л.С. Влияние антиоксидантов на организм здоровых и больных бронхопневмонией телят // Мат-лы междунар. науч.-произв. конф. - Казань, 2003. - С. 99-102.
6. Сидоров И.В., Костромитинов И.А. Активные формы кислорода в окислительных процессах у животных и защитная регуляторная роль биоантиоксидантов // С.-х. биология. - 2003. - №6. - С. 3-12.
7. Стальная И.Д. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - 391 с.
B. Яременко О.Б. Глюкокортикоиды в ревматологии: современная номенклатура дозовых режимов и ра-
циональное применение // УкраЇньский ревматологічний журн. - 2002. - №3(9). - С. 20-2б.
9. Boumpas D.T., Chrousos G.P., Wilder R.L., Cupps T.R. Glucocorticoid therapy for immune-mediated diseases: basic and clinical correlates // Annals of internal medicine. - 1993. - Vol. 119. - №12. - P. 119B-120B.
10. Laihia J.K., Jansen C.T., Ahotupa M. Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity // Free Radic. Biol. Med. - 1993. - Vol. 14. - P. 457-4б1.
