CC BY
63
УДК 577.21:576.3 + 577.334
С.А.Чукаев1, С.М. Николаев2, О.А. Роднаева1, Л.А. Нагаслаева2
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА ЛИСТЬЕВ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ И АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ ПРИ ОСТРОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
1Бурятский государственный университет, Улан-Удэ 2Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ
В экспериментальных исследованиях установлена терапевтическая, эффективность сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной и курсовых сеансов адаптации к гипоксии при остром, токсическом гепатите, вызванном, введением парацетамола. Выявлено, что комплексное применение данных средств обусловливает существенное повышение активности ферментов детоксикации ксенобиотиков и снижение интенсивности, процессов перекисного окисления липидов, что способствует, нормализации структуры, печеночной ткани и. биохимических показателей крови.
Ключевые слова: острый токсический гепатит, гепаторотекторы, адаптация к гипоксии
EVALUATION OF ADMINISTRATION OF HIPPOPHAE RHAMNOIDES L. DRY EXTRACT EFFICIENCY IN COMBINATION WITH ADAPTATION TO HYPOXIA AT ACUTE TOXIC HEPATITIS
S.A. Chukaev1, S.M. Nicolaev2, O.A. Rodnaeva1, L.A. Nagaslaeva2
1Buryat State University, Ulan-Ude 2Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
Therapeutical efficiency of dry extract of Hippophae rhamnoides l. leaves as well as courses of adaptation to hypoxia at acute toxic hepatitis has been established, under experimental conditions. Use of combination, of these medicines results in increase of enzymes of toxic agents metabolism, as well as in decrease of reactions of lipid, peroxidation. These effects promote normalization of structure of liver tissue and. biochemical parameters of blood.
Key words: acute toxic hepatitis, hepatoprotectors, adaptation to hypoxia
Одной из актуальных задач современной биологии и медицины является разработка новых эффективных способов профилактики и коррекции токсических поражений печени. Современные алгоритмы фармакотерапии токсических гепатитов предусматривают широкое применение гепа-топротекторов, большинство которых являются средствами природного происхождения [8, 10]. Фармакотерапевтическая эффективность препаратов данной группы определяется присутствием в их составе комплекса биологически активных веществ (полифенольных соединений, фосфолипидов, витаминов антиоксидантной группы и др.), способных ингибировать процессы свободнорадикального окисления (СРО) и интенсифицировать метаболизм ксенобиотиков в гепатоцитах [3, 8]. Собственные данные авторов свидетельствуют о том, что гепатопротекторной активностью обладают, в том числе, и средства, полученные из флоры Байкальского региона [3]. В последнее время ведутся исследования, связанные с изысканием рациональных схем комбинированного использования лекарственных средств при токсических поражениях печени [10]. Известно также, что одним из эффективных способов защиты мембран гепа-тоцитов от повреждения токсическими агентами является использование рациональных режимов адаптации к гипоксии, повышающих устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов
внешней среды [2]. При этом следует отметить, что эффекты сочетанного применения фармакологических средств природного происхождения и немедикаментозных способов воздействия на организм, как одного из способов профилактики и коррекции токсических поражений печени, изучены явно недостаточно.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилась оценка терапевтической эффективности сочетанного применения сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной и адаптации к гипоксии в условиях экспериментального моделирования острого токсического гепатита.
МЕТОДИКА
Исследования были проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180 — 200 г. Острый токсический гепатит моделировали введения лабораторным животным парацетамола (2,5 г/кг массы тела, 1 раз в сутки, внутрижелудочно) в течение 2 дней [9]; динамику изменения морфофункционального состояния печени оценивали через 7 суток после первого введения препарата.
В работе оценивали антитоксический эффект сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной, полученного в лаборатории медикобиологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ) методом трехкратной экстракции лекарственного
растительного сырья в 40% этиловом спирте. Фитоэкстракт вводили внутрижелудочно в разовой дозе 100 мг/кг массы тела животных ежедневно в течение 7 суток (терапевтический режим применения). Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в эквиобъемном количестве.
Гипоксическую тренировку животных (профилактический режим) осуществляли путем их ежедневного ступенчатого «подъема» в барокамере со скоростью 50 м/с на «высоту» 3000 м — в первые сутки эксперимента, 4000 м — на вторые сутки, 5000 м — на 3 — 7-е сутки, и экспозиции в этих условиях в течение 30 минут [2].
Изучение эффектов сочетанного применения двух указанных выше факторов подразумевало использование гипоксической тренировки в профилактическом режиме и курсовое применение ЭОК в терапевтическом режиме (т. е. после введения токсического агента).
Об эффективности каждого из использованных режимов терапевтического воздействия на организм лабораторных животных при остром токсическом гепатите судили по динамике изменения ряда морфометрических и биохимических показателей.
Так, на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, производили подсчет общей площади, занимаемой некротизированными гепатоцитами, и площади, занимаемой измененными паренхиматозными клетками (с вакуализацией цитоплазмы различной интенсивности, компакти-зацией или резким просветлением ядра), используя морфометрическую сетку Г.Г. Автандилова [1]. Активность монооксигеназной системы печени
оценивали по скорости р-гидроксилирования анилина [4] и N-деметилирования амидопирина [14] в микросомах печени крыс, которые выделяли методом низкоскоростного центрифугирования. Ряд биохимических показателей определяли в гомогенатах печени крыс. Динамику изменения интенсивности реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) контролировали посредством определения уровня ТБК-реактивных продуктов (ТБКРП) [6]. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по методу М.А. Королюк и соавт. [7]. Исследование уровня восстановленного глутатиона проводили по методу Beutler и соавт. [11]. Активность глутатион^-трансферазы (ГТ, КФ 2.5.1.18) определяли с помощью методики, предполагающей использование в качестве субстрата динитрохлорбензола (ДНХБ) [12]; активность ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатамино-трансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), а также концентрацию холестерина в сыворотке — используя общепринятые биохимические методы [5]; содержание белка в микросомах и гомогенатах печени — по методу O.N. Lowry и соавт. [13].
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики; для оценки степени достоверности различий между экспериментальными группами использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона — Манна — Уитни).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как свидетельствуют полученные данные, экспериментальное моделирование острого ток-
Таблица 1
Динамика изменения морфометрических показателей в условиях воздействия парацетамола и применения
сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной
Группы животных S некрозов, % от общей площади полей зрения S паранекрозов, % от общей площади полей зрения
Позитивный контроль (парацетамол) 13,8 ± 0,84 47,3 ± 3,21
Парацетамол + ГС 9,1± 0,52* 36,7 ± 1,73*
Парацетамол + ЭОК 4,9 ± 0,22* 25,7 ± 1,93*
Парацетамол + ЭОК + ГС 3,5 ± 0,14* 13,3 ± 3,66*
Примечание: * - статистически достоверные различия (р < 0,05) в сравнении с соответствующими показателями группы позитивного контроля.
□ Интактный контроль
□ Парацетамол
□ Парацетамол + ГС
□ Парацетамол + ЭОК
□ Парацетамол + ГС + ЭОК
Оксидазная Деметилазная Активность глутатион-
активность, нМ/мин*мг активность, нМ/мин*мг S-трансферазы, IU/мг белка белка белка
Рис. 1. Влияние ЭОК и адаптации к гипоксии на активность ферментов метаболизма ксенбиотиков в условиях моделирования острого токсического гепатита.
сического гепатита путем 2-кратного введения парацетамола обусловливает характерное изменение всего комплекса регистрируемых параметров, позволяющих оценить морфофункциональное состояние печени. Так, при морфометрических исследованиях выявляются выраженные очаги повреждений печеночной ткани; удельная доля площади некрозов составляет в среднем 13,8 %, паранекрозов — 47,3 % от общей площади полей зрения (табл. 1).
Оксидазный и деметилазный виды активности цитохрома Р450 снижаются на 7-е сутки эксперимента в 3,1 раза и в 6,1 раза соответственно, активность ГТ — в 3,1 раза (рис. 1), что свидетельствует о рассогласованности функционирования ферментов первой и второй фаз метаболизма ксенобиотиков и снижении эффективности работы детоксицирующей системы в целом.
Ускоренное накопление ТБКРП в гомогенатах печени на фоне снижения активности каталазы (в среднем — в 2,3 раза) и содержания восстановленного глутатиона (в 7,4 раза по отношению к уровню контрольных величин) указывает на параллельно развивающееся нарушение баланса работы тканевых про- и антиоксидантных систем организма (рис. 2). Выраженная активация сывороточных ферментов: АлАТ, АсАТ, ЩФ (в 2,0 раза, 2,3 раза и 4,1 раза в сравнении с уровнем, характерным для интактного контроля соответственно) и рост содержания холестерина (в среднем — на 70,3 %) (рис. 3) указывает на развитие цитолитического и
холестатического синдромов. Вся совокупность приведенных данных свидетельствует о том, что использованная экспериментальная модель вызывает тяжелое токсическое повреждение печеночной ткани, причиной которого, очевидно, являются метаболические превращения парацетамола с образованием радикальных интермедиатов, обладающих выраженной гепатотоксичностью [11].
Для правильной оценки полученных данных, представленных в следующей части работы, представляется необходимым указать на следующие обстоятельства, связанные с планированием экспериментов. Во-первых, режим применения ЭОК (100 мг/кг, внутрижелудочно, ежедневно в течение
7 суток) как в качестве средства монотерапии, так и в сочетании с курсовым воздействием на организм лабораторных животных умеренной гипоксии, был выбран на основании ранее полученных результатов [3]. Во-вторых, вариант терапевтического, а не профилактического введения ЭОК (т. е., не до, а после введения токсического агента) в целом, не является характерным для экспериментальных исследований. Такой выбор был обусловлен целесообразностью разделения временных промежутков применения фитосредства, с одной стороны, и воздействия гипоксического фактора — с другой, в серии экспериментов по оценке эффективности их сочетанного использования.
В результате проведенных исследований выявлено, что профилактическое курсовое применение сеансов адаптации к гипоксии (5000 м., 30 минут
о ч
<и о
5
С
Ф
ш
□ Интактный контроль
□ Парацетамол
□ Парацетамол + ГС
□ Парацетамол + ЭОК
□ Парацетамол + ГС + ЭОК
МДА, мкмоль/мг белка GSH, мМ/мг белка
Каталаза, 1и*103/мг белка
Рис. 2. Влияние ЭОК и адаптации к гимпоксии на показатели, характеризующие антиоксидантный статус организма, при остром токсическом гепатите.
ч
01
о
Ю
5
С
0)
т
Активность АлАТ, Активность АсАТ, Активность ЩФ, Содержание
мкмоль/л*ч ммоль/л*ч ед/л*102 холестерина,
ммоль/л
□ Интактный контроль
□ Парацетамол
□ Парацетамол + ГС
□ Парацетамол + ЭОК
□ Парацетамол + ГС + ЭОК
Рис. 3. Влияние ЭОК и адаптации к гипоксии на биохимические показатели крови при остром токсическом гепатите.
ежедневно, в течение 7 суток) обусловливает развитие позитивной динамики изменения регистрируемых морфофункциональных показателей. В частности, по данным морфометрического анализа, регистрируется уменьшение зоны некротических и некробиотических поражений печеночной ткани (в среднем на 34,1 % и 22,4 % соответственно) (табл. 1).
Курсовое воздействие умеренной гипобари-ческой гипоксии обусловливает статистически значимое повышение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков (рис. 1), а также некоторую нормализацию параметров, характеризующих антиоксидантный статус (рис. 2); в обеих сериях наблюдений эффекты носят позитивный характер, но при этом имеют весьма умеренную степень выраженности.
Кроме этого, использованный режим гипок-сической тренировки в существенной степени предотвращает развитие синдромов цитолиза и хо-лестаза, о чем свидетельствует практически полная нормализация параметра АлАТ, а также снижение активности ферментов: АсАТ и ЩФ — в 1,4 — 1,6 раза по сравнению с уровнем, характерным для позитивного контроля (рис. 3).
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ЭОК (при использовании в терапевтическом режиме) проявляет весьма существенную гепатопротекторную активность. Так, курсовое применение фитоэкстракта в режиме монотерапии обусловливает уменьшение оцениваемой площади как некрозов (в среднем на 64,5 %), так и некробиотических поражений печеночной ткани (в среднем на 45,7 %) (табл. 1).
При оценке изменения скоростей цитохром Р450-зависимой гидроксилирующей системы окисления ксенобиотиков в микросомах печени лабораторных животных установлено, что экстракт листьев облепихи крушиновидной умеренно (но в большей степени по сравнению с гипоксической тренировкой) стимулирует процессы детоксикации (рис. 1). Оксидазная и деметилазная виды активности цитохрома Р450 микросомальной фракции печеночной ткани под влиянием экстракта облепихи при курсовом введении в разовой дозе 100 мг/кг увеличиваются в 1,9 раза и 3,0 раза соответственно — по сравнению с соответствующий контрольными показателями.
Курсовое введение экстракта листьев облепихи крушиновидной животным с острым токсическим гепатитом сопровождается достоверным снижением интенсивности перекисного окисления липидов мембран клеток. В группах животных, получавших растительный экстракт, наблюдается значительное снижение скорости накопления ТБКРП (в среднем — на 49,3 %), повышение активности каталазы (в среднем — на 76,9 %) и уровня восстановленного глутатиона (в среднем — в 2,8 раза) по сравнению с уровнем, характерным для позитивного контроля (рис. 2).
Фитосредство, так же как и курсовая адаптация к гипоксии, предупреждает развитие признаков
цитолиза и холестаза: при повреждении печени белых крыс парацетамолом ЭОК, снижает активность АлАТ на 37,7 %, АсАТ — на 26,6 %, щелочной фосфатазы — на 45,6 %; концентрация холестерина уменьшается на 27,3 % по сравнению с показателями в группе позитивного контроля (рис. 3).
Результаты проведенного сопоставительного анализа позволяют заключить, что наиболее эффективным способом профилактики и коррекции токсических повреждений печени из исследованных в данной серии экспериментов является сочетанное применение курсовых сеансов адаптации лабораторных животных к гипоксии и фитосредства с гепатозащитной активностью — ЭОК.
Полученные данные свидетельствуют о том, что использование указанного комплекса фармакологических и немедикаментозных средств обусловливает уменьшение оцениваемой площади некрозов (в среднем в 3,9 раза), и некробиотиче-ских поражений печеночной ткани (в среднем в 3,6 раза) (табл. 1). Параллельно регистрируется существенное (в 2,0 — 4,9 раза) повышение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков (рис. 1), позитивная динамика изменения биохимических параметров, характеризующих эффективность работы тканевых систем антиокислительной активности (рис. 2), активности аминотрансфераз крови, щелочной фосфатазы и содержания холестерина (рис. 3), что указывает на нивелирование проявлений синдромов цитолиза и холестаза.
Результаты статистического анализа позволяют утверждать, что эффективность сочетанного использования курсовой адаптации к гипоксии (в профилактическом режиме) и ЭОК (в терапевтическом режиме) превышает эффективность использования каждого из указанных методов в отдельности — в качестве средств монотерапии. Особенно показательной в данном аспекте является динамика изменения морфометрических показателей, деме-тилазной активности цитохрома Р450, активности глутатион^-трансферазы и содержания восстановленного глутатиона — в гомогенатах печени, а также содержания холестерина — в крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании проведенного анализа полученных результатов можно заключить, что курсовое применение экстракта листьев облепихи крушиновидной при токсическом повреждении печени парацетамолом (100 мг/кг ежедневно, 7 суток) вызывает выраженный гепатопротекторный эффект, что, по-видимому, объясняется синергизмом действия содержащихся в растении биологически активных веществ [3]. Использование курсов адаптации к гипобарической гипоксии оказывает аналогичное действие, что, очевидно, определяется способностью данного вида немедикаментозного воздействия позитивно влиять на целый ряд органов, тканей, интегративных систем организма [2].
Сочетанное использование фитоэкстракта и тренировочных, стимулирующих организм,
режимов умеренной кислородной недостаточности, обусловливает развитие терапевтического эффекта максимальной степени выраженности, обеспечивая стабилизацию мембран гепатоци-тов, способствуя стимуляции детоксицирующей функции печени и, оптимизируя, таким образом, течение регенеративных процессов, благоприятно влияя на морфофункциональное состояние печени.
Полученные результаты обосновывают целесообразность применения комплексных способов профилактики и коррекции токсических поражений печени с использованием как фармакологических средств (прежде всего, природного происхождения), так и немедикаментозных методов воздействия на организм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. — М., 1990. — 336 с.
2. Адаптация к периодической гипоксии в терапии и профилактике / Ф.3. Меерсон, В.П. Твер-дохлиб, В.М. Боев, Б.А. Фролов. — М.: Наука, 1989. - 70 с.
3. Гепатопротекторное действие сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной / С.А. Чукаев, С.М. Николаев, О.А. Роднаева, Л.А. Нагаслаева // Сиб. мед. журнал. — 2005. — Т. 53, № 4. — С. 61—64.
4. Карузина И.И. Методы измерения гидрокси-лазной активности / И.И. Карузина, А.И. Арчаков // Совр. методы в биохимии. — М.: Медицина, 1977. — С. 53 — 57.
5. Колб В.Т. Справочник по клинической химии / В.Т. Колб, B.C. Камышников. — Минск, 1982. — 366 с.
6. Колесова О.Е. Перекисное окисление липидов и методы определения продуктов липоперок-сидации в биологических средах / О.Е. Колесова, А.А. Маркин, Т.Н. Федорова // Лаб. дело. — 1984. — № 9. — С. 540 — 546.
7. Королюк М.А. Метод определения каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова и др. // Лаб. дело. — 1988. — № 1. — С. 16—19.
8. Саратиков А.С. Новые гепатопротекторы природного происхождения / А.С. Саратиков,
A.И. Венгеровский // Эксперим. и клин. фарма-кол. — 1995. — Т. 58, № 1. — С. 8—11.
9. Скакун Н.П. Состояние перексисного окисления липидов и желчеобразование при поражении печени парацетамолом / Н.П. Скакун,
B.В. Шманько // Фармакол. и токсикол. — 1984. — Т. 47, № 4. — С. 105—108.
10. Скакун Н.П. Эффективность витагепата и сирепата в сочетании с карсилом при хроническом поражении печени / Н.П. Скакун, И.П. Мосейчук, Я.Я. Гиль // Эксперим. и клин. фармакол. — 1997. — Т.60, № 5. — С. 78 — 82.
11. Beutler E. Improved method for the glutathione determination / E. Beutler, O. Duron, B.U. Kelly // J. Lab. Clin. Med. — 1963. — Vol. 61. — P. 882 — 890.
12. Habig W.H. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. / W.H. Habig, M.J. Pabst, W.B. Jakoby // J. Biol. Chem. — 1974. — Vol. 249, N 22. — P. 7130 — 7139.
13. Lowry O.N. Protein measurements with the Folin phenol reagent / O.N. Lowry, N.J. Roserbrougt, A.L. Farr et al. // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193, N 2. — P. 265 — 275.
14. Nash T. Colorimetric estimation of formaldehyde by means of the hantzsen reaction / T. Nash // Biochem. J. — 1953. — Vol. 55. — P. 416 — 421.
Сведения об авторах
Чукаев Сергей Александрович - к.м.н., доцент; заведующий кафедрой фармакологии и традиционной медицины Бурятского государственного университета, тел. 8(3012)448255, e-mail: s_chukaev@mail.ru.
Николаев Сергей Матвеевич - д.м.н., профессор, заведующий Отделом биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, тел. 8(3012)433463.
Роднаева Ольга Анатольевна - к.м.н., ст. преподаватель кафедры зоологии Бурятского государственного университета. Нагаслаева Лариса Андреевна - к.фарм.н., научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
