ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ УСТАНОВОК НА ОСНОВЕ МЕМБРАННОГО МОДУЛЯ МФМ-0142 ПРИ САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ ВОДЫ Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

дигиена и санитария 5/2009_

Методы гигиенических исследований

С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2009 УДК 61331:579.63

A. Е. Недачин', Р. А. Дмитриева2, А. В. Тарасов3, Ю. А. Федотов'', С. А. Лепешин5, Т. В. Доскина6,

B. А. Долгим7, А. Г. Санамян8, Д. В. Снегирев3

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ УСТАНОВОК НА ОСНОВЕ МЕМБРАННОГО МОДУЛЯ МФМ-0142 ПРИ САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ ВОДЫ

'Заведующий лабораторией, канд. мед. наук, старш. научн. сотр. НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва, (microblal@list.ru, alexandrned@mail.ru); 2ведущ. научн. сотр., канд. биол. наук, старш. научн. сотр. НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН, Москва (microblab@list.ru); 'директор, ООО НПП "Технофильтр", канд. хим. наук, старш. научн. сотр., чл.-корр. РАЕН (technofilter@mail.ru); 'начальник отдела мембран ООО НПП 'Технофильтр", канд. хим. наук, старш. научн. сотр., член-корр. РАЕН (technofilter@mail.ru); 'инженер-технолог отдела мембран, ООО НПП "Технофильтр", (technofilter@mail.ru); '¿тарш. научн. сотр. НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН, Москва, канд. биол. наук (microblab@list.ru); 'мл. научн. сотр. НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН, Москва (microblal@list.ru); *мл. науч. сотр. НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН, Москва; 'лаборант-исследователь НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН, Москва (microblal@list.ru)

В статье изложены материалы по усовершенствованию метода индикации вирусного загрязнения воды различных водных объектов окружающей среды с использованием фильтрационного модуля МФМ, основанного на микрофильтрации воды в тангенциально-радиальном режиме и концентрировании вирусов на позитивно заряженных мембранах с применением вторичного этапа концентрирования. Экспериментальные и натурные чередования показали, что данный метод выделения вирусов обладает высокой эффективностью и основан на использовании отечественных материалов. Это обусловливает его быстрое внедрение в систему сани-тарно-вирусологического контроля практических лабораторий различных ведомств, что будет способствовать повышению эсрфективности эпидемиологического надзора как неотъемлемой составной части неспецифических профилактических мероприятий вирусных инфекций водной этиологии.

Ключевые слова: санитарно-вирусологический контроль, вода, мембранные установки

A. Ye. Nedachin, R. A. Dmitriyeva, А. V. Tarasov, Yu. A. Fedotov, S. A. Lepeshin, Т. V. Doskina, V. A. Dolgin, A. G. Sanamyan, D. V. Snegirev. - EVALUATION OF THE EFFICIENCY OF OPERATION OF MFM-0142 MEMBRANE MODULE-BASED UNITS IN THE SANITARY-VIROLOGICAL MONITORING OF WATER

The paper outlines materials on how to improve a method for indication of water viral pollution in different water objects of the environment, by applying a MFM filtration module based on tangentially radial-mode water microfil-tration and viral concentration on the positively charged membranes, by using the secondary stage of concentration. Experimental and full-scale studies have demonstrated that this method for virus isolation has a high effectiveness and is based on the employment of the materials made in Russia. This determines its rapid introduction into the system for the sanitary-virological monitoring ofpractical laboratories of various departments, which willfavor the higher efficiency of epidemiological surveillance as an integral part of nonspecific prophylactic measures of virus infections of water etiology.

Key words: sanitary-virological monitoring, water, membrane units.

Одним из приоритетных направлений работ в области снижения заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями является совершенствование методов контроля за уровнем вирусного загрязнения воды. Эффективность санитар-но-вирусологического контроля зависит как от выбора метода концентрирования вирусов из различных водных объектов [2], так и от способа их выделения на клеточных культурах или определения нуклеиновых кислот вирусов с помощью полимераз-ной цепной реакции (ПЦР).

Используемые в настоящее время как в нашей стране [3], так и за рубежом [4, 5] методы концентрирования вирусов из различных объемов воды требуют значительных временных затрат (от 24 ч до нескольких суток), имеют ограничения по объему исследуемой воды (часто не более 10 л чистой воды), трудоемки из-за применения сложного импортного оборудования и в ряде случаев не обеспечивают точного определения концентрации вирусов в исследуемой пробе. Все это влияет на качество контроля водных объектов по вирусологическим показателям и как следствие на оперативность разработки противоэпидемических мероприятий при обнаружении вирусов в воде. Наиболее перспективным методом концентрирования вирусов в настоящее время можно считать метод мембраной фильтрации в режиме микрофильтрации. При этом в немалой степени эффективность концентрирования вирусов зависит от степени загрязнения воды, характеристик фильтровальной установки, типа мембран и др.

К одним из перспективных типов фильтровальных установок отечественного производства следует отнести установку на

основе относительно недорогого мембранного фильтрующего модуля МФМ-142 с тангенциально радиальным движением жидкости (ТУ 3614-005-32915592—2005) с использованием элсктропозитивных мембран марок ММК и ММПА*, которые изготавливаются в ООО НПП "Технофильтр" по ТУ 3697 -002-10471723-2003 и ТУ 9471-023-10471723-2006.

В 2003-2006 гг. в ГУ НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина РАМН были проведены исследования процесса концентрирования вирусов из вод различного происхождения с применением указанного мембранного модуля.

Технические характеристики модуля представлены в табл. 1.

Мембранная установка, использованная для исследований, состояла из мембранного модуля МФМ-0142, напорной емкости на 20 л (7) и компрессора (9) (рис. 1).

Собственно модуль состоит из верхней (/) и нижней (2) тарелок, между которыми с помощью устройства (3) зажимается мембрана. Модуль устанавливается на треноге (5). Штуцер шланга для подачи исходной воды из расходной емкости (7) соединяется со стыковочным штуцером (4).

Перед фильтрацией тарелки модуля протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают. После охлаждения в углубление нижней тарелки стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр (ММК-0,2 или ММПА*'- 0,2), предварительно смоченный в стерильной воде.

Исследуемую воду заливают в напорную емкость (7), крышку которой тщательно закрывают, и включают компрессор (9). С помощью компрессора в напорной емкости создается давле-

Таблица 1

Технические характеристики МФМ-0142

Показатель

Знамение

Рабочая поверхность мембраны, см3 Диаметр мембраны, мм Объем каналов, см2 Длина каналов, см Сечение канала, мм2

Рабочее давление на входе в МФМ (определяется типом мембраны и наличием подложки), МПа

Скорость подачи раствора, л/ч Внутренний диаметр присоединительных шлангов, мм Материал МФМ

Масса, кг Габариты, мм

104 142

8

350 2,25

01-0,3 5-30

Нержавеющая сталь

~ 4,5 170 х 150 х 160

ние 1,0 • 10"'—1,5 • 10"5 Па. В процессе фильтрации фильтрат поступает на слив, а концентрат вирусов остается на мембране модуля. В случае замедления процесса фильтрации через штуцер (5) можно сбросить воздух и далее продолжать фильтрацию при заглушённом стыковочном устройстве (5). В процессе фильтрации необходимо контролировать давление по показателю манометра (10). После окончания фильтрации компрессор отключается, штуцер (4) на линии подачи воды заглушается.

Результаты исследований показали, что сорбция фага МБ-2 и вируса полиомиелита I типа (штамм Ь52аЬ) на мембранах типа ММК-0,2 составляла 96 —98%, а на мембранах ММПА±0,2 — 99—100%. Эффективность элюции вируса при использовании данного метода колебалась от 73,3 до 90%. При этом длительность фильтрации 10 л воды составляла 45—90 мин.

При фильтрации значительных объемов исследуемой воды мы предлагаем схему с использованием перистальтического насоса взамен напорной емкости и компрессора, разработанную в конце 2008 г. (рис. 2).

Процедура фильтрации заключается в следующем. Исследуемая вода из расходной емкости (Г) (см. рис. 2) перистальтическим насосом (10) подается в мембранный модуль (7). Фильтрат после модуля поступает на слив, а концентрат остается на мембране. В процессе фильтрации необходимо постоянно контролировать давление по показаниям манометра (I). По окончании фильтрации насос выключается. Стыковочные штуцеры (8 м 9) убираются.

При проточной фильтрации в тангенциально-радиальном режиме поток жидкости в напорной части между тарелкой и мембраной движется по концентрическим каналам тарелок, соединенным между собой переточными радиальными каналами. Поток жидкости многократно изменяет направление движения, причем в одном переточном канале он делится на два потока, а в следующем канале два потока объединяются в один. Такая структура движения потока жидкости позволяет интенсифицировать процесс перемещения воды в пограничном слое мембраны и иметь минимальную толщину осадка в порах и на поверхности мембраны. Течение жидкости в каналах приближается к режиму вытеснения.

При работе модуля в описанном режиме исследуемая вода проходит над поверхностью мембраны, при этом часть неотфильтрованного потока жидкости возвращается в цикл, а фильтрат удаляется. Поскольку вода проходит касательно к поверхности мембранного фильтра, большинство вирионов сорбируется на позитивно заряженной мембране, а находящиеся во взвешенном состоянии

возвращаются обратно в расходную емкость. При этом концентрирование вирусов происходит быстрее, чем при обычной фильтрации воды в тупиковом режиме. Накопление вирусов на мембране обеспечивается за счет сепарационных, сорбционных и электростатических процессов.

В случае исследования сильно загрязненной жидкости во всасывающую или нагнетательную линию необходимо вмонтировать префильтр капсульноготипа (см. рис. 2, //), разработанный в ООО НПП "Технофильтр" в начале 2009 г. Конструкция префильтра предусматривает использование материалов, которые не сорбируют вирусы или сорбируют их в ничтожно малых количествах.

Необходимо отметить разработанную и внедренную в данной модификации модуля новую систему процесса элюции, отличную от первоначального варианта установки. Так, в первичных вариантах процесс элюции предусматривал изъятие мембраны из модуля и механический смыв вирусов с мембраны струей элюента из пипетки, что представляло определенную опасность инфицирования работающего персонала. Исключение риска инфицирования возможно было только при выполнении данной процедуры в условиях ламинарного бокса, что сопряжено с существенными сложностями и дополнительными финансовыми затратами, приводящими к значительному удорожанию метода выделения вирусов из воды.

В новом варианте фильтрационного модуля элюции вирусов с мембраны осуществляется без извлечения мембраны, т. е. в закрытом режиме.

Элюцию вирусов с мембраны (рис. 3) осуществляют путем продавливания через нее элюента (3% бифэкстракта на трисбу-фгре с рН 9,1—9,5) в 3 приема по 20 мл двумя одноразовыми шприцами. Шприцы, один из которых содержит элюент, присоединяют к стыковочным устройствам на линии входа воды (5) и на линии выхода фильтрата (б).

Устройство (7) заглушено. В каждый прием элюент продавливают через мембрану с помощью этих шприцев не менее 8— 10 раз.

Возможен вариант элюции вирусов при стыковке шприцев с устройствами (5 и 7) (см. на рис. 3). Устройство (6) в данном случае глушат. При этом варианте элюент движется над мембраной и течение фильтруемой жидкости сочетает режим вытеснения в каждом канале и турбулентность при перетоке из одного канала в другой. Такая структура потока обеспечивает высокую эффективность элюции вирусов.

Экспериментальные и натурные исследования по изучению эффективности выделения вирусов при использовании модуля

Рис. 1. Фильтрация воды с использованием компрессора и напорной емкости:

/ — верхняя тарелка; 2 — 7— напорная емкость; 8

нижняя тарелка; 3 — зажимное устройство; 4—6 — стыковочные штуцеры; — тренога; 9 — компрессор; 10 — манометр.

гиена и санитария 5/2009

Примечание. БОЕ — бляшкообразующая единица ко-лифага.

Таблица 3

Эффективность выделения вирусов с использованием модуля МФМ-0142

Концентрация полиовируса, ТЦДМ

исходная вола (10 л)

элюат (60 мл)

Эффективность, %

3,84 • 10' 3,08 •10' 80,3

1,25 -102 1,0- 10* 80,0

1,25 -101 1,2 - 102 96,0

1,5- 10г 1,2 • 10г 83,3

2 25-10' 1,7- 10' 75,6

2,25-10' 2,0- 10' 88,9

Примечание. ТЦД^ — тканевая цитопатическая доза вируса.

Рис. 2. Схема установки концентрирования вирусов с использованием перистальтического насоса:

1 — расходная емкость; 2 — МФМ-0142; 3 — манометр; 4 — шланг; 5, 7 — узлы стыковки; 8, 9 — стыковочные штуцеры; 10— перистальтический насос; II — прслфильтр; 12— воздушный колпак.

(МФМ-0142) проводили с искусственным заражением как водопроводной воды, так и воды из поверхностных источников. В качестве моделей вирусов использовали РНК-содержащий колифаг (М8-2) и вакцинный штамм полиовируса 1-го типа (ЬБс 2аЬ). Колифаг М5-2 (штамм ВКПМ РН 1505) был получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГУ НИИ генетики. В качестве лизабельной культуры использовали штамм кишечной палочки ВКПМ В-3254, Е.соМ К-12 К5 507, который также был получен в этом институте.

Вакцинный штамм полиовируса 1-го типа (ЬБс 2аЬ) был получен в ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.

Колифаги в пробах определяли прямым методом в соответствии с МУК 4.2.1018—01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды". Вирусы выделяли в соответствии с МУК 4.2.2029—05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов". Данные статистически обрабатывали, достоверность полученных результатов оценивали с использованием г-крите-рия Стьюдента. На наличие колифагов и полиовируса исследовали исходную воду и элюат. Полученные результаты представлены в табл. 2, 3.

Данные табл. 2, 3 показали высокую эффективность выделения как колифагов, так и полиовируса при использовании мо-

дифицированного способа элюции. При этом эффективность выделения фагов колебалась в пределах 74,9—90%, а полиовируса — 75,6—96%. Также установили, что эффективность индикации изученных вирусов практически не зависит от исходной концентрации как колифага, так и полиовируса в пределах изученных уровней загрязнения питьевой воды.

Сравнение процентов выделения вирусов на модуле (МФМ-0142), разработанном ранее (86,3 ± 1,7%), и на модифицированном модуле при элюции вирусов двумя шприцами в закрытом режиме (84,95 ± 3,71%) показало, что разница в проценте выделения статистически недостоверна (/ < 2). Однако существенным преимуществом модифицированного модуля является обеспечение эпидемической безопасности персонала, проводящего элюцию вирусов с мембраны в закрытом режиме.

Для получения надежных результатов, свидетельствующих о наличии или отсутствии вирусов в воде, необходимо исследование всего объема элюата, в данном случае 60 мл, так как содержание вирусов даже после концентрирования, как правило, может не превышать единичных вирионов в 1 мл этого объема элюата. В то же время существующие методы выделения вирусов на клеточных культурах из-за высокой стоимости и трудоемкости не позволяют исследовать полностью полученный элюат. Кроме того, для определения РНК или ДНК вируса в ПЦР достаточно 1 мл элюата с концентрацией не менее 10'.

В этой связи для максимального уменьшения объема полученного элюата возникла необходимость использования в схеме исследования воды с применением отечественных фильтрационных установок этапа вторичного концентрирования. В настоящее время для этапа вторичного концентрирования наибо-

Таблица 2

Эффективность выделения колифагов с использованием модуля МФМ-0142

Концентрация колифага, БОЕ

Эффективность, %

исходная вола (10 л) элюат (60 мл)

2 000 1 800 90

6 200 5135,1 82,8

7 500 6 240 83,2

9 900 8 420 85,1

40 600 30392,7 74,9

320 000 300 000 93,7

Рис. 3. Элюция вирусов без разборки модуля.

2— МФМ; 5—7— узлы стыковки; 8— стыковочный штуцер; 10— шприц с элюентом.

Схема выделения вирусов из водных объектов с использованием модифицированного модуля МФМ

Проба воды

I

Фильтрация

X

В условиях ламинарного бокса:

- разборка модуля;

- снятие мембраны;

- смыв вирусов

I-

В режиме закрытого модуля

Вторичное концентрирование

I

Выделение на культуре ткани и в ПЦР

Установка с Установка с

компрессором перистальтическим насосом

1 I

Элюция

1

лес широко применяют метод ультрацентрифугирования или осаждение вирусов полиэтиленгликолсм. Поскольку последний метод более простой и не требует дополнительного оборудования, мы использовали его для отработки этапа вторичного концентрирования вирусов из 60 мл элюата в соответствии с рекомендациями, изложенными в "Инструкции по использованию полимсразной цепной реакции (ПЦР) для выявления энтерови-русного загрязнения воды" [1]

В соответствии с этим документом в полученный элюат (60 мл) добавляли полимер — ПЭГ (М.м. 6000) и хлористый натрий до конечных концентраций соответственно 10% и 0,5 М. Смесь тщательно перемешивали до растворения ПЭГ и затем выдерживали в течение 10—12 ч при температуре 4"С. Образовавшуюся суспензию центрифугировали при 10 000 £ в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 6 мл стерильной дистиллированной воды. Полученный объем полностью использовали для выделения вирусов на клеточной культуре и РНК в ОТ-ПЦР.

Полученные результаты показали, что эффективность выделения полиовируса и ко-лифага с использованием этапа вторичного концентрирования была высокой и колебалась в пределах 80,3—100%.

Результаты показали, что введение этапа вторичного концентрирования вирусов с помощью ПЭГ 6000 М.м. позволяет уменьшить объем первичного элюата в 10 раз, он в полном объеме может быть использован для выделения вирусов на различных культурах клеток и для определения РНК и ДНК в ОТ-ПЦР.

Сравнимая эффективность элюции вирусов как из неразборного фильтрующего модуля МФМ-0142, так и при проведении этой же операции в ламинарном боксе позволила включить в схему детекции вирусов из воды оба варианта.

В целом с учетом всех вышеописанных этапов процесс индикации вирусов из водных объектов можно представить в виде схемы.

Таким образом, разработанная система выделения вирусов из воды с использованием фильтрационного модуля МФМ, основанная на микрофильтрации воды в тангенциально-радиальном режиме и концентрировании вирусов на позитивно заряженных мембранах с применением вторичного этапа концентрирования, обладает высокой эффективностью, основана на использовании отечественных материалов. Это обусловливает ее быстрое внедрение в систему санитар-но-вирусологического контроля практических лабораторий различных ведомств, что будет способствовать повышению эффективности эпидемиологического надзора, как неотъемлемой составной части неспецифических профилактических мероприятий вирусных инфекций водной этиологии.

Литература

1. Инструкция по использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления энтеровирусного загрязнения воды. — Минск, 2001.

2. Санамян А. Г., Дмитриева Р. А., Доскина Т. В. и др. // Гиг. и сан. - 2006. - № 6. - С. 74-76.

3. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. МУК 4.2.2029-05. - М., 2006.

4. ICR Microbial Laboratory Manual US EPA. ЕРА/600/ R-95/178. 1996.

5. Normalisation Française XP T 90-451. Essais des eaux. Recherche des Enterovirus. — , 1996.

Поступила 12.04.09