CC BY
71
УДК 632.952:633.16
Оценка эффективности применения прозаро против фузариоза ячменя
О.П. ГАВРИЛОВА, А.С. ОРИНА, научные сотрудники ВИЗР Т.Ю. ГАГКАЕВА, ведущий научный сотрудник В.Е. ПОВЕТКИН, куратор проекта «Байер» «БайАрена - Черноземье - Запад» e-mail: [email protected]
Грибы рода Fusarium могут значительно снижать урожайность ячменя и оказывать негативное влияние на качество зерна. Результатом метаболизма некоторых из них являются микотокси-ны, которые устойчивы к температурной обработке и сохраняются в конечных продуктах на основе зерна.
Анализ зараженности ячменя из Белгородской и Курской областей в 2011 г. (16 образцов) выявил зараженность в среднем 13 % зерна (от 2 до 37 %). Инфицирован-ность фузариевыми грибами зерна урожая 2012 г. в Центральном регионе(Брянская, Воронежская, Липецкая, Московская, Рязанская, Тамбовская и Тульская области) отмечена в 91 % образцов (23 образца), и в среднем составила 5,2 % (от 1до 12 %), что в два раза превышало зараженность пшеницы из этого же региона.
Выявленный видовой состав грибов обусловливает опасность контаминации выращиваемого в Центральном регионе зерна Т-2 и НТ-2 токсинами (Т-2/НТ-2). Наибольшая доля из выявленных в анализируемом зерне фузариевых грибов (9-13 видов) приходится на F. sporotrichioides и F. langsethiae, продуцирующие эти микотоксины. Известно, что Т-2/НТ-2 являются одними из наиболее опасных для
теплокровных организмов соединений. Установлен выраженный фитотоксичный эффект Т-2 токсина, проявляющийся в задержке развития проростков и корней ячменя, что негативно сказывается на его семенных качествах и процессе солодоращения [4].
Защита ячменя от фузариоза зерна осложняется отсутствием высокоустойчивых к данному заболеванию сортов. Кроме того, на практике не всегда соблюдаются агротехнические и организационные меры, направленные на улучшение общего фитосанитарного состояния полей и повышение устойчивости растений к биотическим и абиотическим факторам. Насыщение севооборотов зерновыми культурами и использование нулевых и безотвальных обработок почвы приводят к накоплению инфекции, что обусловливает необходимость применения фунгицидов в период вегетации.
Заражение растений в поле может происходить от периода цветения до уборки. После проникновения патогенов в растение процесс развития заболевания контролировать сложно. Наилучший защитный эффект может быть достигнут при профилактической обработке фунгицидами, то есть до проникновения инфекции в ткани колоса. Вместе с тем, цветение ячменя происходит, как правило, еще до выхода колосьев из влагалища листа, и точно определить сроки применения фунгицидов достаточно сложно [1].
Для установления эффективности фунгицидов, применяемых против фузариоза, традиционно
используют методы визуальной оценки (по видимым признакам развития заболевания в поле), однако для ячменя этот способ малоприемлем из-за отсутствия ярко выраженных симптомов заболевания. Более точную оценку дают показатели зараженности зерна и содержания микотоксинов. В последние годы широко распространенным становится анализ инфи-цированности зерна по выявлению в нем ДНК патогенов. Используемый для этого молекулярно-генетический метод количественной ПЦР - хорошая альтернатива традиционным времязатратным и в значительной степени субъективным методам анализа зараженности зерна. Количественная ПЦР дает возможность выявить степень инфицированности зерна грибами и точно установить именно тот вид или группу видов, которые представляют наибольшую опасность. Метод значительно увеличивает достоверность диагностики, ускоряет проведение анализа и получение результатов.
Целью наших исследований была оценка эффективности фунгицида прозаро, кэ компании «Байер КропСайенс» для защиты зерна от фузариозной инфекции в разные сроки колошения ярового ячменя. Критериями оценки эффективности были масса зерна, количество ДНК патогена и содержание микотоксинов.
Исследования проведены в 2012 г. в Курской области на производственном поле сельхозкооператива «Новая жизнь» на яровом пивоваренном ячмене сорта Беатрис. Агротехника возделывания -общепринятая для данной природно-климатической зоны. Норма расхода прозаро - 1 л/га. По-вторность - трехкратная, количество колосоносных стеблей в по-вторности - 10 (площадка 1 х 1,5 м2, рендомизированно). В период трубкования ячменя колосья за-
крывали пергаментными пакетами (20 х 60 см) для создания повышенной влажности, благоприятствующей жизнедеятельности гриба. Пакеты на растениях оставались в течение нескольких суток.
Инокуляцию растений ячменя проводили суспензией конидий и мицелия гриба Fusarium sporotri-chioides - 5 мл суспензии в концентрации КОЕ 105 на 10 колосьев. В воду для получения гомогенной суспензии добавляли Твин 80 (0,2 %). Для обработки колосьев фунгицидом или водой и последующего через сутки опрыскивания суспензией гриба использовали мелкодисперсные пульверизаторы. Заражение растений осуществляли в вечернее время (2122 ч) при температуре 19-20 °С.
Схема опыта включала 3 варианта: опрыскивание водой + инокуляция грибом (1); обработка фунгицидом растений без инокуляции грибом (естественный инфекционный фон) + опрыскивание водой (2); обработка фунгицидом + инокуляция грибом (3). Обработку растений проводили в три срока колошения ячменя: А - за сутки до появления остей колоса из трубки;
Б - выдвижение половины колоса; В - полное колошение. Для сравнения оценивали средний образец зерна ячменя, собранный с этого же поля, не подвергавшийся в вегетационный период инокуляции грибом и обработкам фунгицидом.
После созревания зерно обмолотили с помощью ручной молотилки и взвесили. Каждый образец зерна был размолот на лабораторной мельнице. Общую ДНК экстрагировали из 200 мг муки, используя CTAB-метод [3]. Определение количества ДНК F. sporotrichioides в зерне проводили методом количественной ПЦР (SYBRGreen ПЦР) с использованием видоспецифич-ных для гриба F. sporotrichioides праймеров [6] на термоциклере IQ™5 Multicolor Real-time PCR Detection System («BioRad»). Суммарное содержание Т-2/НТ-2 токсинов определяли иммунофер-ментным методом, экстрагируя их водным ацетонитрилом (1:6) из 1 г муки. Анализ выполняли с применением тест-систем российского производства («Фарма-тех») с пределом определения ми-котоксинов 4 мкг/кг [2].
Анализ полученных результатов показал, что за сутки до появления остей колоса из трубки и в фазе выдвижения половины колоса обработка фунгицидом обеспечивала прибавку урожая в диапазоне 64-121 % по сравнению с вариантом, в котором проводили инокуляцию, но без обработки фунгицидом. Обработка фунгицидом в фазе полного колошения, когда зерновки уже сформировались, не сказывалась на урожае ячменя.
В зависимости от фазы развития ячменя (А, Б, В), в которую растения инокулировали, количество ДНК F. sporotrichioides имело тенденцию к возрастанию - 12,4; 22,5 и 42,9 пкг/мкл соответственно (рис. 1). Зерновки в фазе полного колошения являются более благоприятным питательным субстратом для развития грибов, по сравнению с начальным периодом их формирования.
Применение фунгицида на всех сроках колошения ячменя приводило к снижению количества ДНК F. sporotrichioides в зерне. Содержание ДНК гриба в вариантах с применением фунгицида прозаро при инокуляции ячменя в разные
П Вода+гриб (1) Я Фунгицида вода (2)
Фунгицида-гриб (3)
1. Количество ДНК гриба F. sporotrichioides в образцах зерна ячменя в разные фазы колошения: А — за сутки до появления остей, Б — выдвижение половины колоса, В — полное колошение
2. Суммарное содержание Т-2 и НТ-2 токсинов в зерне ячменя в разные фазы колошения: А — за сутки до появления остей, Б — выдвижение половины колоса, В — полное колошение
фазы развития (А, Б и В) уменьшилось на 47, 96 и 68 %. Таким образом, наибольшее подавляющее действие фунгицида на гриб было выявлено во время выдвижения половины колоса. И в этом же варианте получена максимальная прибавка массы зерна.
В опыте в образцах под изоляторами были созданы благоприятные условия для жизнедеятельности грибов, обитающих на данном опытном поле. Анализ зерна с этого поля показал зараженность фу-зариевыми грибами на уровне 8 %, в том числе F. sporotrichioides -6 %. Поэтому в вариантах опыта, где растения не подвергались инокуляции, но обрабатывались фунгицидом, выявлена ДНК F. sporo-trichioides, содержание которой во все фазы составило 0,30,6 пкг/мкл. Анализ зерна этих образцов выявил близкие значения содержания Т-2/НТ-2 (4966 мкг/кг), что было значительно выше, чем загрязненность полевого образца (6 мкг/кг).
Наибольшие количества мико-токсинов содержались в зерне образцов из вариантов, в которых растения инокулировали грибом F. sporotrichioides (рис. 2). Суммарное содержание Т-2/НТ-2 в разные фазы колошения (А, Б, В) составило 200, 368 и 158 мкг/кг. Максимальные количества мико-токсинов выявлены при инокуляции ячменя в фазе выдвижения половины колоса, когда условия благоприятствовали активному токси-нообразованию грибов.
Обработка ячменя фунгицидом на фоне инокуляции грибом способствовала снижению накапливаемых Т-2/НТ-2 в зерне. Наибольший эффект снижения мико-токсинов (75 %) выявлен в варианте с обработкой фунгицидом во время выдвижения половины колоса, когда он оказывал одновременно профилактическое и лечебное действия. Близкой(65%) была
эффективность обработки за сутки до появления остей. Применение фунгицида после полного вы-колашивания ячменя не приводило к значимым эффектам.
Корреляционный анализ в целом показал положительную взаимосвязь между содержанием ДНК F. sporotrichioides и накоплением микотоксинов в зерне. Наиболее тесная взаимосвязь между этими показателями выявлена для фазы выдвижения половины колоса (г = 0,71, р < 0,05). В естественных условиях это фаза наибольшей восприимчивости растений к заражению фузариевыми патогенами. Создание высокого искусственного инфекционного фона спровоцировало сильное заражение растений на более поздних стадиях развития ячменя. Влажность зерна оказывает значительное воздействие на токсинообра-зование грибов. Уменьшение влажности зернового субстрата приводит к снижению количества образуемых в зерне токсинов Т-2/НТ-2 [5]. Таким образом, накопление микотоксинов в более сформированном зерне протекает менее активно.
Результаты эксперимента показали, что наиболее благоприятным периодом для накопления в зерне микотоксинов является фаза выдвижения половины колоса из трубки. Обработка растений фунгицидом прозаро именно в этой фазе позволила достигнуть максимального защитного эффекта и получить значительную прибавку урожая.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М., Новожилов К.В. Фузариоз зерновых культур // Приложение к журналу Защита растений и карантин, № 5, 2011. 52 с.
2. Кононенко Г.П., Буркин А.А., Соболева Н.А., Зотова Е.В. Иммунофермент-ный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне // Прикладная
биохимия и микробиология, 1999, т. 35. № 4, с. 457-462.
3. European Commission. Community Reference Laboratory for GM Food and Feed, 2005. Event-specific for the quantitation of maize line NK603 using realtime PCR. http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/ summaries/NK603report_mm.pdf
4. Hintikka E.-L. Toxicosis and natural occurrence of trichothecenes in Finland. In book: Edit. by Y.Ueno. Thrichothecenes. Chemical, biological and toxicological aspects. ELSEVIER, 1983, p. 221-228.
5. Medina A., Magan N. Temperature and water activity effects on production of T-2 and HT-2 by Fusarium langsethiae strains from north European countries // Food Microbiology, 2011, vol. 28, p. 392-398.
6. Yli-Mattila T., Paavanen-Huhtala S., Parikka P., Konstantinova P., Gagkaeva T. Molecular and morphological diversity of Fusarium fungi in Finnish and north-western Russia // Eur. J. Plant Pathol., 2004, vol. 110, p. 573-585.
Аннотация. Представлены результаты оценки эффективности применения фунгицида прозаро, кэ компании «Байер КропСайенс» в разные сроки колошения ярового ячменя для защиты зерна от фу-зариозной инфекции. Установлено, что обработка ячменя фунгицидом на фоне инокуляции грибом Fusarium sporotri-chioides способствовала снижению количества ДНК патогена и содержания Т-2 и НТ-2 токсинов в зерне. Максимальный защитный эффект на яровом пивоваренном ячмене сорта Беатрис получен при обработке фунгицидом в фазе выдвижения половины колоса.
Ключевыеслова. Фунгицид прозаро, ячмень яровой, фузариоз, микотоксины, ДНК, ПЦР.
Abstract. Evaluation of the effectiveness of fungicide prosaro (company Bayer CropScience) in three different heading date of malting barley cv. Beatris to protect the grain from Fusarium infection has been done. It has been shown that fungicide application under artificial inoculation by F. sporotrichioides may reduce quantity of DNA pathogen and T-2/HT-2 toxins contamination. The best time to obtain increased chemical control of Fusarium disease of malting barley was the application in the middle heading.
Keywords. Fungicide prosaro, barley, Fusarium, mycotoxins, DNA, qPCR
