CC BY
32
Оценка эффективности применения молекулярно-биологических методов диагностики инфекций, передающихся половым путем, в рамках периодических медицинских осмотров лиц декретированных профессий
Н.С. Анисимова1 (natalia.anisimova@pcr.ru), Г.А. Шипулин1 (shipulin@cmd.su), А.Е. Гущин1 (guschin@cmd.su), В.В. Покровский1 (pokrovsky@hivrussia.net), А.Б. Захарова2 (azakharova@mail.ru), О.Л. Новожилова2 (novoschilova@mail.ru)
1ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва (info@crie.ru)
2ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения города Москвы» филиал «Вешняковский» (Кожно-венерологический диспансер №15), Москва (info@kvd15.mosgorzdrav.ru)
Резюме
Среди всех методов прямого выявления возбудителей инфекционных болезней методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) на сегодняшний день имеют наибольшую диагностическую эффективность. Однако согласно нормативным документам в рамках медицинских осмотров лиц декретированных профессий проводится бактериоскопическое исследование отделяемого урогенитального тракта. Эпидемиологическая эффективность скрининговых исследований напрямую зависит от диагностической эффективности применяемых методов. Цель данного исследования - сравнить диагностическую эффективность бактерио-скопических и молекулярно-биологических методов диагностики инфекций, передающихся половым путем (ИППП), в условиях скринингового обследования лиц декретированных профессий. Заключение - выявляемость источников инфекции при рутинном обследовании населения на ИППП методом ПЦР может быть выше, чем с использованием бактериоскопических методов. Ключевые слова: молекулярно-биологические методы исследования, ПЦР, бактериоскопические методы исследования, медицинские осмотры лиц декретированных профессий, эпидемиологическая эффективность
Evaluating the Effectiveness of the Use of Molecular-Biological Methods of Diagnosing Infections, Sexually Transmitted Diseases in Periodic Medical Examinations of Persons Decreed Professions
N.S. Anisimova1 (natalia.anisimova@pcr.ru), G.A. Shipuiin1 (shipulin@cmd.su), A.E. Guschin1 (guschin@cmd.su),
V.V. Pokrovsky1 (pokrovsky@hivrussia.net), A.B. Zaharova2 (azakharova@mail.ru), O.L. Novozhilova2 (novoschilova@mail.ru)
1 Central Research Institute of Epidemiology of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Moscow (info@crie.ru)
2 Skin and Venereal Diseases Dispensary № 15, Moscow (info@kvd15.mosgorzdrav.ru) Abstract
Nucleic acid amplification methods show nowadays the highest diagnostic efficiency among all methods of virus direct detection. However, it is bacterioscopy of discharge from urogenital tract that is carried out in the course of medical checkups of working people, according to regulatory documents. Epidemiological efficiency of screening depends directly on diagnostic efficiency of diagnostic methods employed. The research task is to compare diagnostic efficiency of bacterioscopy and biomolecular methods of STD diagnostics at the medical checkup of working people. Conclusion: detectability rate of infection source in the course of routine STD screening can be higher when PCR methods are employed instead of bacterioscopy.
Key words: biomolecular methods, PCR methods bacterioscopy, course of medical checkups of working people, epidemiological efficiency
Введение
Обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры лиц декретированных профессий - важнейшее звено в системе медико-организационных мероприятий общественного здравоохранения. На федеральном уровне необходимость прохождения периодических медицинских осмотров регламентируется Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан, Трудовым кодексом РФ, а также Федеральным
законом РФ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения». В Москве список профессий, учреждений и организаций, работники которых проходят обязательные периодические медицинские осмотры, а также перечень и кратность обследований определены Постановлением Правительства Москвы от 28 декабря 1999 года № 1228. В перечень обследований, которые должны проходить лица декретированных профессий, среди прочих включены исследования на инфек-
ции, передающихся половым путем (ИППП). Согласно вышеуказанному постановлению, обязательны бактериоскопические исследования отделяемого урогенитального тракта на гонорею и трихомоноз.
Ценность бактериоскопического метода заключается в его простоте, доступности методик и быстроте получения результатов, что имеет значение в условиях обследования населения в рамках медицинских осмотров. Однако было показано, что чувствительность данного метода при исследовании урогенитальных мазков на гонорею от женщин с клиническими проявлениями инфекции составляет 37 - 50% [7], а чувствительность микроскопии окрашенного препарата на урогенитальный трихомоноз у женщин - 38 - 60% [11]. В то же время частота бессимптомного течения трихомоноза и гонококковой инфекции у женщин находится в интервале 10 - 50% [3, 8]. Важно отметить, что чувствительность бактериоскопических методов исследования, применяемых для диагностики ИППП, у пациентов с бессимптомным течением заболеваний существенно снижается. При столь низких показателях чувствительности применяемых методов диагностики закономерен вопрос о целесообразности их использования и об эпидемиологической эффективности массового обследования населения.
Согласно существующему определению, эпидемиологическая эффективность противоэпидемиче-cn ских мероприятий - это показатель, отражающий | снижение или прекращение заболеваемости, до-jg стигнутый за счет проведенных мероприятий [6]. ^ Скрининговые обследования населения на ИППП л являются одним из важных мероприятий в про-I филактике инфекций, определяющим дальнейшие I противоэпидемические действия, ведь раннее вы-"о явление ИППП и проведение терапии служат клю-§ чевыми факторами санации источника, предотвра-I щения распространения инфекции в популяции и ™ как следствие - снижения показателей заболева-§ емости [1]. С другой стороны, эпидемиологическая § эффективность скрининговых исследований на-| прямую зависит от диагностической эффективно-I сти применяемых методов, которая в свою очередь т является интегральным показателем диагностической чувствительности и специфичности лабораторных методов.
Среди всех методов прямого выявления возбудителей инфекционных болезней методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) на сегодняшний день имеют наибольшую диагностическую эффективность. Высокая чувствительность и специфичность тестов на основе МАНК доказана как российскими, так и зарубежными исследованиями.
Например, диагностическая чувствительность МАНК (ПЦР) при обнаружении T. vaginalis составляет 92,8%, N. gonorrhoeae - 99% [9, 10]. Однако до сих пор в нашей стране МАНК при проведении медицинских осмотров не применяются.
В связи с этим цель нашего исследования - сравнение диагностической эффективности
бактериоскопических и молекулярно-биологиче-ских методов диагностики ИППП в условиях скри-нингового обследования лиц декретированных профессий.
Материалы и методы
В исследовании участвовали женщины в возрасте 19 - 50 лет (средний возраст - 34,8 года), работающие в медицинских организациях, школьных и дошкольных учреждениях, не имеющие жалоб и клинических проявлений урогенитальных заболеваний, участвующие в прохождении периодического медицинского осмотра на базе Кожно-венеро-логического диспансера № 15 Восточного административного округа г. Москвы (далее - КВД). Клинический материал был забран врачом-гинекологом при осмотре в зеркалах. Материал забирался с заднего или боковых сводов при помощи ватного тампона. Для перенесения материала на стекло тампон прокатывался по стеклу. В качестве метода диагностики в КВД в соответствии с нормативными документами использовалась микроскопия с окраской по Граму для определения T. vaginalis и N. gonorrhoeae. Все мазки, приготовленные для направления в лабораторию КВД, были высушены на воздухе и промаркированы. После нанесения материала на стекло тампон погружался в пробирку с транспортной средой для ПЦР-исследования, которое проводилось в лаборатории ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (далее - ЦНИ-ИЭ). В ЦНИИЭ для ПЦР-исследования использовались комплект реагентов для экстракции ДНК экспресс-методом «ЭДЭМ» и набор реагентов для одновременного выявления ДНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® N. gonorrhoeae/C. trachomatis /M. genitalium /T. vag/'nal/'s-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (производство ЦНИИЭ). Качество диагностических наборов подтверждено Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, все наборы реагентов прошли государственную регистрацию, имеют регистрационное удостоверение и могут быть использованы в клинической лабораторной практике. При получении положительного результата на ИППП повторно проводилась экстракция ДНК из клинических образцов зарегистрированным методом с использованием набора реагентов «ДНК-Сорб-АМ» (производство ЦНИИЭ).
По данным статистических форм отчетности, с января 2010 по декабрь 2011 года профилактический медицинский осмотр в КВД прошли 26 452 человека. Забор материала проводился с октября 2010 по август 2011 года, за указанный период от всех пациенток, подходящих по возрасту, были отобраны и исследованы образцы. Количество образцов, исследованных в ЦНИИЭ, составило 2410.
Был проведен сравнительный анализ результатов микроскопии и ПЦР за исследуемый период.
Были также проанализированы формы государственного статистического наблюдения № 34 КВД за 2010 - 2011 годы.
Результаты и обсуждение
Методом ПЦР было исследовано 2410 образцов, что составляет 9,1% от общего числа обследованных. Результаты исследования представлены в таблице 1.
С целью исключения ложноположительных результатов все положительные образцы были повторно исследованы методом ПЦР с применением альтернативной зарегистрированной методики экстракции ДНК с помощью набора реагентов «ДНК-Сорб-АМ». Согласно данным государственных испытаний, аналитическая чувствительность для набора реагентов для одновременного выявления ДНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis при экстракции «ДНК-Сорб-АМ» составляет 5 х 102 ГЭ/мл. Полученное совпадение результатов при использовании разных методов экстракции свидетельствует о том, что положительные результаты являются истинноположительными и отражают наличие ДНК указанных микроорганизмов в клиническом материале.
Согласно полученным данным, частота обнаружения M. genitalium составила 40,2% от всех выявленных ИППП, C. trachomatis - 38%, T. vaginalis - 17,3%, а N. gonorrhoeae - 4,3%. За анализируемый период наибольшее число обследованных приходится на возрастную группу 31 - 45 лет (65,7%; P < 0,05), при этом наибольшая распространенность C. trachomatis отмечается в возрастной группе риска 19 - 30 лет (3,47%; P = 0,001), что определяет наибольшую эпидемиологическую опасность передачи инфекции и увеличивает риск развития впоследствии серьезных репродуктивных осложнений. Достоверных различий по частоте выявления M. genitalium, T. vaginalis и N. gonorrhoeae в разных возрастных группах не обнаружено.
Важно отметить, что, по данным форм федерального государственного статистического наблюдения № 34 «Сведения о больных заболеваниями, передаваемыми преимущественно половым путем, грибковыми кожными болезнями и чесоткой», всего из числа обследуемых работающих лиц (26 452 человека) бактериоскопическим методом в КВД были обнаружены T. vaginalis - у 46
(0,17%), а N. gonorrhoeae - у 4-х (0,015%). На основании полученных данных можно предположить, что при обследовании всех 26 452 человек методом ПЦР количество выявленных случаев инфекций могло бы составить: C. trachomatis - 384 (258 - 511, 95%-ный доверительный интервал (ДИ)); M. genitalium - 406 (276 - 536, 95%-ный ДИ); T. vaginalis - 176 (90 - 261, 95%-ный ДИ); N. gonorrhoeae - 44 (1 - 87, 95%-ный ДИ) (рис. 1).
Таким образом, использование низкочувствительных, но регламентированных методов диагностики ИППП не позволяет диагностировать значительное число случаев гонококковой и трихомонад-ной инфекций, что в свою очередь свидетельствует о низкой эпидемиологической эффективности применения микроскопии при скрининговых обследованиях.
Более высокая чувствительность метода ПЦР по сравнению с бактериоскопией при диагностике гонококковой и трихомонадной инфекций, в первую очередь у пациентов без клинических проявлений, была неоднократно продемонстрирована в исследованиях как зарубежных, так и отечественных авторов [4, 5], что сделало ПЦР методом выбора в скрининговых исследованиях. В зарубежных странах ПЦР и другие молекулярно-биологические методы давно стали основным диагностическим инструментом для массового обследования бессимптомных лиц на наличие возбудителей ИППП [2].
Использование метода ПЦР в формате «Муль-типрайм» в данном исследовании позволило выявить лиц, инфицированных и другими ИППП (C. trachomatis, M. genitalium), имеющими высокое клиническое и эпидемиологическое значение, которые не могли быть обнаружены бактериоскопи-ческим методом. Повторим, что исследование проводилось на группе лиц, которые не имели субъективных жалоб и клинических проявлений уроге-нитальной патологии, при этом общая распространенность ИППП в исследуемой группе составила 3,8%, что свидетельствует о достаточно высоком уровне инфицированности населения ИППП.
Выводы
1. Впервые была проведена апробация методики обследования населения с использованием набора ПЦР с одновременным обнаружением ДНК четырех основных возбуди-
Таблица 1.
Частота обнаружения возбудителей ИППП методами микроскопии окрашенного препарата и ПЦР за 2010 - 2011 годы (п = 2410)
Метод диагностики ИППП Нозологические формы ИППП
C. trachomatis T. vaginalis N. gonorrhoeae M. genitalium
ПЦР 35 (1,45%) 16 (0,66%) 4 (0,16%) 37 (1,53%)
Микроскопия Не выполнялась 0 (0%) 0 (0%) Не выполнялась
Рисунок 1.
Количество случаев ИППП, выявленных бактериоскопическим методом, и ожидаемое число случаев, которое могло бы быть выявлено методом ПЦР при обследовании 26 452 человек
500 — 400 — 300 — 200 — 100 — 0
□ Выявлено бактериологическим методом
□ Могло быть выявлено методом ПЦР
N. gonorrhoeae
T. vaginalis
C. trachomatis
M. genitalium
телей ИППП - N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis - в рамках обследования лиц декретированных профессий.
2. Полученные данные свидетельствуют о более высокой диагностической эффективности метода ПЦР в сравнении с регламентированным бактериоскопическим методом, так как методом ПЦР было дополнительно выявлено 35 случаев хламидийной инфекции, 16 случаев трихомоноза, 4 случая гонококковой инфекции, 37 случаев инфицирования M. genitalium, в то время как бактериоскопи-чески указанные случаи инфекций обнаружены не были.
3. Использование бактериоскопических методов диагностики не позволяет выявить большую часть случаев бессимптомных форм инфекций, вызванных T. vaginalis и N. gonorrhoeae.
4. Результаты ПЦР-исследования с использованием вышеуказанных наборов реагентов сви-
детельствуют о высокой распространенности C. trachomatis и M. genitalium, которые не контролируются при проведении периодических медицинских осмотров. 5. Выявляемость источников инфекции при рутинном обследовании населения на ИППП методом ПЦР может быть выше, чем при использовании бактериоскопических методов.
Таким образом, внедрение в практику здравоохранения высокоэффективных молекулярно-био-логических методов диагностики ИППП в рамках различных программ обследования населения позволит предотвратить большое число новых заражений, а также снизить риск развития репродуктивной патологии в связи с проведением своевременного лечения больных и контактных лиц.
Литература
1. Белякова Ю.А., Александрова О.Ю., Бережанский Б.В. и др. Диагностика и терапия бактериальных инфекций, передаваемых половым путем: результаты многоцентрового фармакоэпидемиологического исследования, проведенного в различных регионах России // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2010. Т. 12. № 3. С. 226 - 245.
2. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. - М., 2006. С. 85 - 101.
3. Рахматулина М.Р Урогенитальный трихомоноз: клиника, диагностика и терапия // Медико-социальные аспекты отечественного здравоохранения и современной фармакологии. Актуальные вопросы кардиологии, неврологии и психиатрии. Труды. Т. 2. С. 485 - 493.
4. Цеслюк М.В., Гущин А.Е., Савочкина Ю.А. и др. Сравнение методов лабораторной диагностики гонореи с применением «расширенного золотого стандарта» // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 7. С. 48 - 53.
5. Шипицына Е.В., Золотоверхая Е.А., Григорьев А.Н. и др. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики трихомониаза // Журнал акушерства и женских болезней. 2011. Т. LX. Вып. 2. С. 73 - 80.
6. Эпидемиология и эпидемиологическая практика. Электронный портал: http://epidemiolog.org/
References
1. Belyakova Yu.A., Aleksandrova O.Yu., Berezhanskiy B.V. et al. Diagnostika i terapiya bakterial'nyh infektsiy, peredavaemyh polovym putem: rezul'taty mnogotsentrovogo farmakoepidemiologicheskogo issledovaniya, provedennogo v razlichnyh regionah Rossii // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya himioterapiya. 2010. T. 12. № 3. P. 226 - 245.
2. Evropeyskie standarty diagnostiki i lecheniya zabolevaniy, peredavaemyh polovym putem. - M., 2006. P 85 - 101.
3. Rahmatulina M.R. Urogenital'nyj trihomonoz: klinika, diagnostika i terapiya // Mediko-sotsial'nye aspekty otechestvennogo zdravoohraneniya i sovremennoy farmakologii. Aktual'nye voprosy kardiologii, nevrologii i psihiatrii. Trudy. T. 2. P 485 - 493.
4. Tseslyuk M.V., Gushchin A.E., Savochkina Yu.A. et al. Sravnenie metodov laboratornoy diagnostiki gonorei s primeneniem «rasshirennogo zolotogo standarta» // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2008. № 7. P. 48 - 53.
5. Shipitsyna E.V., Zolotoverhaya E.A., Grigor'ev A.N. et al. Otcenka metodov amplifikatcii nukleinovyh kislot dlya diagnostiki trihomoniaza // Zhurnal akusherstva i zhenskih bolezney. 2011. T. LX. V. 2. P. 73 - 80.
6. Epidemiologiya i epidemiologicheskaya praktika. Elektronnyj portal: http://epidemiolog.org/
7. Barlow D., Phillips I. Gonorrhoea in women: diagnostic, clinical and laboratory aspects // Lancet. 1978. P. 761 - 764.
8. British National Guideline on the Management of Gonorrhoea in Adults. 2001.
9. Crucitti T., Van Dyck E., Tehe A. et al. Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens // Sex. Transm. Infect. 2003. V. 79. P. 393 - 398.
10. Tabrizi S.N. et al. Evaluation of real time polymerase chain reaction assays for confirmation of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples tested positive in the Roche Cobas Amplicor assay // Sex. Transm. Infect. 2004. V. 80. P. 68 - 71.
11. Krashin J.W., Koumans E.H., Bradshaw-Sydnor A.C. et al. Trichomonas vaginalis prevalence, incidence, risk factors and antibiotic-resistance in an adolescent population // Sex. Transm. Dis. V. 37. № 7, July 2010. P 440 - 444.
Новый метод диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая
А.С. Казанова1 (pendelbus@gmail.com), В.Ф. Лавров1, С.Н. Кузин1, Л.К. Эбралидзе1, С.Л. Ведунова1, Н.А. Малышев2, С.А. Русанова2, Л.Е. Кузина2
1ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва (instmech@iitp.ru) 2ГУЗ «Инфекционная клиническая больница № 1», Москва
Резюме
Разработан новый метод лабораторной диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicella zoster virus - VZV), основанный на анализе продукции специфических антител мононуклеа-рами периферической крови (МПК). В культуре МПК 38-ми из 39-ти больных манифестной формой вторичной VZV-инфекции, протекающей в виде опоясывающего лишая, наблюдался активный синтез специфического IgG, что подтверждалось его обнаружением в культуральной жидкости с помощью ИФА. В группе, состоящей из 20-ти серопозитивных к VZVдоноров, продукции специфических противовирусных антител обнаружено не было. Чувствительность и специфичность разработанного нами метода, таким образом, составили соответственно 97,4 и 100%, что позволяет рекомендовать его для диагностики VZV-инфекции (в том числе ее атипичных форм), возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса.
Ключевые слова: вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая, реактивация вируса, VZV-инфекция, опоясывающий лишай, мононуклеары периферической крови, VZV-IgG
A New Method for Diagnosis of Infection that Occurs Due to Reactivation of Varicella Zoster Virus
A.S. Kazanova1 (pendelbus@gmail.com), V.F. Lavrov1, S.N. Kuzin1, L.K. Ebralidze1, S.L. Vedunova1, N.A. Malyshev2, S.A. Rusanova2, L.E. Kuzina2
1The Federal State Budgetary Institution «I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera» of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow (instmech@iitp.ru)
2 State Institution of Public Health «Clinical Hospital of Infectious Disease № 1», Moscow Abstract
A new method based on spontaneous antibody production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in acute Herpes zoster (HZ) patients has been developed. VZV-IgG production was observed in 48-hour PBMC culture of 38 from 39 HZ patients, but in none of the control group, which consisted of 20 seropositive to VZV donors, with sex and age matching HZ patients. Sensitivity and specificity of PBMC antibody production measurement in diagnosis of endogenous VZV reactivation gained 97.4 and 100% respectively. The method could be applied to diagnosis of atypical VZV reactivation, i.e. Zoster sine herpete and VZV-vasculopathy without rash. Key words: Varicella zoster virus, virus reactivation, VZV-infection, Herpes zoster, peripheral blood mononuclear cells, VZV-IgG
Введение
Первичная инфекция, вызываемая вирусом ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicella zoster virus - VZV), - ветряная оспа протекает в большинстве случаев легко и имеет благоприятный прогноз [2]. Введение в национальные иммунизационные программы ряда стран обязательной вакцинации против ветряной оспы привело к снижению заболеваемости, особенно в детском возрасте, однако уровень инфицированности взрослого населения «диким» штаммом VZV остается по-прежнему
высоким [1]. По данным CDC, в США 99,6% лиц возрастной группы 40 - 49 лет инфицированы VZV [7].
Во время первичной инфекции VZV трансаксо-нальным и гематогенным путем проникает в чувствительные ганглии черепно-мозговых и спинномозговых нервов, в ганглии нодозного и чревного сплетений вегетативной нервной системы, где пожизненно персистирует в латентном состоянии [2]. В дальнейшем, при снижении функциональной активности адаптивного (преимущественно клеточного) иммунитета с возрастом, а также в результа-
