CC BY
0
РЕДАКЦИОННАЯ СТАТЬЯ
Оценка эффективности применения конъюгатов куриных IgY антител к IgG человека в иммуноферментном анализе и дот-иммуноанализе
Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н.
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Российская Федерация
Резюме
Цель работы - сравнительная оценка куриных (IgY) и мышиных моноклональных (IgG) антител к IgG человека в качестве зонда для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.
Материал и методы. Проведены эксперименты по сравнению способности зондов на основе мышиных IgG и куриных IgY антител к IgG человека, а также протеинов А и G, связанных с пероксидазой хрена и коллоидным золотом, определять человеческие иммуноглобулины разных классов, а также выявлять в сыворотке крови человека IgG, специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ). В качестве реагента захвата в ИФА и дот-анализе использовали рекомбинантный аналог домена III гликопро-теина Е ВКЭ. Исследования выполнены в сравнении с коммерческим набором «ВектоВКЭ-IgG» с применением панелей сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ, желтой лихорадке и денге, а также образцов от здоровых доноров.
Результаты и обсуждение. Показано, что сконструированные экспериментальные наборы для ИФА и дот-анализа адекватно определяют положительные и отрицательные образцы и позволяют дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к другим флавивирусам. Зонды с пероксидазой и коллоидным золотом обеспечивают одинаковые лимиты обнаружения IgG, а зонды на основе куриных антител демонстрируют более интенсивные оптические сигналы и преимущества в чувствительности по сравнению с конъюгатами мышиных IgG.
Заключение. Полученные данные позволяют рассматривать конъюгаты на основе куриных антител в качестве перспективных реагентов для иммуноанализа.
Финансирование. Исследование проведено в рамках выполнения государственного задания Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Полтавченко А.Г.; проведение экспериментов - Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н.; анализ и интерпретация данных - Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Филатов П.В.; подготовка текста - Полтавченко А.Г., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В.
Для цитирования: Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. Оценка эффективности применения конъюгатов куриных IgY антител к IgG человека в иммуноферментном анализе и дот-имму-ноанализе // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2024. Т. 13, № 1. С. 6-14. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2024-13-1-6-14
Статья поступила в редакцию 01.11.2023. Принята в печать 29.12.2023.
Ключевые слова:
IgY; IgG; клещевой
энцефалит;
конъюгаты;
иммунодиагностика;
дот-иммуноанализ;
иммуноферментный
анализ
Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КУРИНЫХ IgY АНТИТЕЛ К IgG ЧЕЛОВЕКА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ И ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
Efficiency of applying chicken IgY antibody conjugates against human IgG in ELISA and dot immunoassay
Poltavchenko A.G., Ersh A.V., Ushkalenko N.D., Filatov P.V., Kolosova E.A., Shanshin D.V., Shcherbakov D.N.
State Research Center of Virology and Biotechnology "VECTOR", Federal Inspection Agency for Consumer and Human Welfare Protection, 630559, Kol'tsovo, Novosibirsk region, Russian Federation
Abstract
The aim of the study - comparative evaluation of chicken (IgY) and mouse monoclonal (IgG) antibodies against human IgG as a probe for ELISA and dot immunoassay test systems in the diagnosis of tick-borne encephalitis.
Material and methods. Experiments were conducted to compare the ability of conjugates of mouse IgG and chicken IgY antibodies against human IgG, as well as proteins A and G associated with horseradish peroxidase and colloidal gold to determine human immunoglobulins of different classes, as well as to detect IgG in human sera specific to the tick-borne encephalitis virus (TBEV). A recombinant analogue of domain III of TBEV glycoprotein E was used as a capture reagent in ELISA and dot analysis. The studies were performed in comparison with the commercial VectoTBEV-IgG kit using panels of blood sera containing antibodies to tick-borne encephalitis, yellow fever and dengue viruses, as well as samples from healthy donors.
Results and discussion. It was shown that the designed experimental kits for ELISA and dot analysis adequately identify positive and negative samples and allow one to differentiate antibodies to TBEV from antibodies to other flaviviruses. Peroxidase and colloidal gold conjugates provide similar detection limits for IgG, and chicken antibody probes exhibit stronger optical signals and sensitivity advantages over mouse IgG conjugates.
Conclusion. The data obtained allow us to consider conjugates based on chicken antibodies as promising reagents for immunoassays.
Funding. The study was carried out as part of the fulfilment of the state assignment of the Federal Service for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Poltavchenko A.G.; conducting experiments - Ersh A.V., Ushkalenko N.D., Kolosova E.A., Shanshin D.V., Shcherbakov D.N.; data analysis and interpretation - Poltavchenko A.G., Ersh A.V., Filatov P.V.; text preparation -Poltavchenko A.G.; Ushkalenko N.D.; Filatov P.V.
For citation: Poltavchenko A.G., Ersh A.V., Ushkalenko N.D., Filatov P.V., Kolosova E.A., Shanshin D.V., Shcherbakov D.N. Efficiency of applying chicken IgY antibody conjugates against human IgG in ELISA and dot immunoassay. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2024; 13 (1): 6-14. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2024-13-1-6-14 (in Russian) Received 01.11.2023. Accepted 29.12.2023.
Keywords:
IgY; IgG;
tick-borne
encephalitis;
conjugates;
immunodiagnostics;
dot-immunoassay;
ELISA
Выбор эффективного иммунореагента детекции - белка, используемого для изготовления зонда (конъюгата с легко выявляемой меткой), является важным этапом при создании иммунохимического теста, поскольку от правильного выбора во многом зависит успешность анализа. В серологических тестах при выявлении антител в качестве детекторных белков используют вторичные иммунореа-генты - моно- и поликлональные антитела к выявляемым иммуноглобулинам или белки, связывающиеся с константными фрагментами (Fc) антител: протеин А из Staphylococcus aureus (SpA) и протеин G, выделяемый из стрептококков (SpG). Их качество зависит от способа получения и хранения [1] и может значительно различаться в продуктах из разных источников. Выбор наиболее подходящего компонента, как правило, проводят на основе сравнительных экспериментов. Критериями выбора служат чувствительность и специфичность выявления целевого аналита, эффективность связывания с меткой, а также доступность и стоимость детекторного
белка. В последнее время значительный интерес вызывают выделяемые из желтка куриных яиц антитела ^ как альтернатива антителам млекопитающих [2]. Интерес к использованию ^-технологии объясняется биоэтическими преимуществами [3], возможностью получения большого количества высокоактивных и специфичных антител с относительно низкими затратами [4], простотой и эффективностью выделения ^ из яиц [5], легкостью масштабирования производства антител в широком диапазоне [4], а также уникальными свойствами куриных антител, что определяет ихуспешное применение с диагностическими и иммунотера-певтическими целями [2, 4, 6, 7].
Подобно ^ млекопитающих, ^ состоит издвух тяжелых (Н) и двух легких полипептидных цепей, которые организованы в Y-образную характерную «единицу» и содержат 2 идентичных активных центра связывания антигена. Однако структура и физико-химические характеристики ^ отличаются от что приводит к различиям в их свойствах
и оказывает значительное влияние на стабильность, имму-ногенность и биологическую активность [3, 6]. Известны примеры получения и эффективного применения зондов на основе антивидовых и специфичных к отдельным белкам ^ антител, связанных с пероксидазой [3, 8], коллоидным золотом [7, 9] и другими метками [7, 10]. Большинство полученных данных свидетельствует о том, что применение куриных антител в иммуноанализе способствует повышению чувствительности и минимизации ложных сигналов. В то же время некоторые авторы приводят случаи слабой иммуно-реактивности организма кур и низкой аффинности полученных антител при иммунизации некоторыми антигенами [10]. Отмечают низкую эффективность ^ в тестах иммуно-преципитации [8], меньшую чувствительность тест-систем на основе ^ по сравнению с тестами на основе ^ [11] и делают выводы о необходимости при создании методов с использованием желточных иммуноглобулинов проводить сравнения с методами, в которых используются иммуноглобулины млекопитающих [10].
Цель работы - сравнительная оценка куриных и мышиных моноклональных антител к ^ чело-
века в качестве зонда для тест-систем иммунофермент-ного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа при диагностике клещевого энцефалита.
Материал и методы
Проведено сравнительное экспериментальное исследование по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) с использованием экспериментальных наборов реагентов для проведения ИФА и дот-иммуноана-лиза.
Иммунореагенты
Реагенты захвата - мышиные моноклональные антитела (МКАТ) к ^ человека (14506), бактериальные белок А (Р6031) и белок G (08062) производства Sigma-АЫпс1п (США).
Аналиты1 - антитела 1дМ человека (Н 1тт), 1дА человека (Н 1аа), ^ человека (Н 1дд) производства «Имтек» (Россия).
Получение поликлональных антител ^ курицы к1дС человека и конъюгатов с пероксидазой хрена
Кур иммунизировали препаратом Иммуноглобулин человека нормальный (НПО «Микроген», Россия), смешанным в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда ^дша-АШпсИ, США), в дозе 500 мкг/животное. Препарат (100 мкг/мл) вводили внутримышечно в грудные мышцы птицы. Иммунизацию повторяли на 10, 22, 32, 44, 56 и 68-е сутки, используя неполный адъювант Фрейнда. Собранные от иммунизированных кур яйца хранили при 4 °С. Выделение антител из яиц проводили по ранее описанному способу [5]. Получение конъюгатов пероксидазы хрена
с поликлональными куриными IgY (HRP-Chicken IgY-a/Hum) и моноклональными мышиными IgG (HRP-Mouse IgG-a/Hum) проводили по методу Nakano и Kawaoi [12].
Получение зондов с коллоидным золотом
Определение дозы нагрузки и связывание золя золота (20 нм) с детекторными белками выполняли по ранее описанной методике [13]. Таким способом получены зонды коллоидного золота с протеином А (Au-SpA), протеином G (Au-SpG), МКАТ мыши к IgG человека (Au-Mouse IgG-a/Hum) и куриными антителами к IgG человека (Au-Chicken IgY-a/Hum).
Получение рекомбинантного аналога домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита
Синтез гена, кодирующего фрагмент оболочного белка E вируса КЭ, соответствующий домену III (EDIII-ВКЭ) штамма GLubinnoe/2004 [GenBank: DQ862460.1], выполняли в OOO «ДНК-Синтез» (Россия). Наработку, выделение и очистку белка проводили аналогично методике, приведенной в предыдущей работе [14].
В работе использовали: тетрахлорзолотую кислоту [ТХЗК (HAuCL4)], лимонную кислоту, твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), thimerosaL, казеин и натрия азид (Sigma-ALdrich, США); другие химические реактивы отечественного производства с квалификацией не ниже «ч.д.а.» («чистый для анализа». - Примеч. ред.). Для изготовления подложки иммуночипов применяли синтетический материал на основе ПВХ ZenofoL Print («Зенон», Россия).
Образцы сывороток крови
В экспериментах использовали пул сывороток крови человека, содержащий:
■ панель I из 20 образцов сывороток крови сотрудников ГНЦ ВБ «Вектор», привитых против клещевого энцефалита (КЭ). Отбор и использование сывороток крови одобрены на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора № 6 от 18.04.2023 и проведены в соответствии с информированным согласием;
■ панель II - панель образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ, включающую 20 серопозитив-ных сывороток крови больных или переболевших клещевым энцефалитом и 15 серонегативных образцов сывороток крови доноров, которые были предоставлены ООО «Имбиан-Лаб» (Россия);
■ панель III, включающую 10 сывороток крови, полученных от сотрудников ГНЦ ВБ «Вектор», вакцинированных против желтой лихорадки. Участие в исследовании одобрено на заседании этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора № 4 от 14.04.2022 и проведено в соответствии с их информированным согласием;
■ панель IV - верификационная панель для лихорадки денге, состоящая из 9 образцов сыворотки крови, содержащих антитела к вирусу денге (Dengue Fever Verification panel, KZMC028), производства ZeptoMetrix®, LLC (США).
1 Аналит - компонент, искомый или определяемый в пробе вещества или материала объекта аналитического контроля. - Примеч. науч. ред.
Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КУРИНЫХ ^ АНТИТЕЛ К ДО ЧЕЛОВЕКА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ И ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
При проведении экспериментов все образцы подвергались кодированию.
Иммуноферментный анализ
Определяемые аналиты (IgA, IgM и IgG) разводили в 0,01 М карбонатном буферном растворе (рН 9,4) до концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений от 400 до 3 нг/мл и выполняли их иммобилизацию в высокосорбционных планшетах Nest (Китай) в течение 20 ч, при температуре +4оС из объема 100 мкл. Рекомбинантный белок EDIII-ВКЭ с концентрацией 1 мкг/мл сорбировали в ячейках планшета таким же образом. ИФА выполняли по стандартной методике [14]. Результаты учитывали спектрофотометрически - оптическая плотность при длине волны 450 нм (ОП450).
Дот-иммуноанализ
В экспериментальных наборах дот-иммуноанализа твердой фазой являлась подложка из синтетической бумаги, на рабочую сторону которой дискретно каплями по 2,5 мкл наносили двукратные разведения аналитов (от 400 до 3 нг/мл) или белок EDIII-КЭ (2,6 мкг/мл) в 0,01 М боратном буферном растворе (рН 6,0). В качестве контроля работоспособности конъюгата на подложку наносили IgG человека в концентрации 2,5 мкг/мл в том же буферном растворе. Подложки инкубировали 12 ч при 4 °С и высушивали при 40 °С в течение 2 ч. Блокировку свободных от антигенов участков поверхности осуществляли 0,2% раствором казеина на 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,2) в течение 2 ч при комнатной температуре. Дальнейшую подготовку подложек и выполнение анализа проводили по ранее приведенной методике [15].
При учете результатов изображение матриц оцифровывали с помощью планшетного сканера и обрабатывали с использованием специальной компьютерной программы, оценивающей интенсивность окраски на местах нанесения соответствующих иммунореагентов в относительных единицах светопоглощения. За положительный результат принимали значение, превышающее отсекаемые значения оптической плотности отрицательного результата (ОПкрит).
Контрольная тест-система
Сравнительные эксперименты по оценке эффективности выявления в образцах сывороток крови специфических антител к ВКЭ выполняли с использованием коммерческого набора реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения IgG к ВКЭ ВектоВКЭ-IgG (D-1156) РУ № РЗН 2017/5605 от 04.2017 АО «Вектор-Бест».
Статистическая обработка
Все эксперименты выполняли в 5 повторах. При статистической обработке полученных данных с помощью программного продукта Microsoft Excel вычисляли: среднее (M), стандартное отклонение а, доверительный интервал (±Лх) для вероятности 95% (р=0,95, а=0,05), коэффициент вариации (К). Отсекаемые значения (ОПкрит) для каждого вида анализа высчитывали как M+Лх по всему пулу отрицательных донорских сывороток крови. Диагностические
чувствительность и специфичность теста оценивали по ГОСТ Р 53022.3-2008. Достоверность различий результатов, полученных с применением экспериментальных тестов и теста сравнения, оценивали путем расчета критерия х2 по методике Макнемара с использованием онлайн-ресурса medstatistic.ru/index.php. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Описанные ниже исследования проведены в рамках проекта по созданию автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям клещевых инфекций - клещевого энцефалита, боррелиоза, риккет-сиоза и др. Мультиплексный дот-иммуноанализ антител выполняется на плоских плотных подложках с дискретно нанесенными в определенном порядке антигенами возбудителей инфекционных заболеваний. При выполнении анализа матрицу последовательно инкубируют с исследуемым образцом крови и зондом - вторичным иммунореа-гентом, связанным с коллоидным золотом. Частицы золота, иммобилизованные на подложке за счет иммунного связывания, проявляют в кислом растворе, содержащем растворимую соль серебра и восстановитель (метол, гидрохинон и др.). Серебро из такого нестабильного раствора способно каталитически восстанавливаться на частицах золота. Учет результатов анализа основан на обнаружении темной окраски восстановленного серебра в определенных зонах на подложке [13].
В качестве иммунореагентов детекции используют вторичные антитела от разных животных, направленные против антител человека, или бактериальные протеины А и С, способные связываться с константной частью ^с-фрагмент) антител человека и некоторых животных. Эффективность таких конъюгатов зависит от качества реагентов детекции, успешности процедуры связывания этих реагентов с поверхностью частиц коллоидного золота и способности этих частиц восстанавливать серебро, не дестабилизируя проявитель. Изготовление «золотых» конъюгатов на основе 1дС млекопитающих хорошо проработано и широко используется в иммуноанализе. Однако установлено [4], что куриные ^ антитела обладают значительными отличиями от 1дС по молекулярной массе, структуре и физико-химическим свойствам, способными повлиять как на эффективность их связывания с частицами золя золота, так и на стабильность проявителя. Известны примеры получения зондов на основе ^ и коллоидного золота для иммунохроматографических тестов [11]. В отличие от этих тестов, использующих крупные (40 нм) частицы золота, в дот-анализе с проявлением применяют более мелкодисперсные (20 нм) золи, что может влиять на эффективность их связывания с белками и стабильность полученного зонда [16].
Для оценки применимости ^ в дот-анализе с проявлением по отработанному ранее для 1дС методу [13] изготовлены «золотые» зонды с использованием наиболее часто используемых вторичных иммунореагентов: бактериальных протеинов А и С, мышиных моноклональных (1дС) и куриных
антител к ^ человека и проведен эксперимент по сравнению их способности реагировать с иммуноглобулинами классов А, М и G человека.
Мышиные МКАТ ранее были выбраны в качестве реагента, обеспечивающего наибольшую чувствительность и специфичность теста [13]. В настоящем исследовании их использовали в качестве эталонного реагента сравнения. Параллельно выполняли эксперименты с перок-сидазными конъюгатами на основе тех же иммуноглобулинов. В качестве определяемых аналитов использовали доступные коммерческие препараты афинно-очищенных иммуноглобулинов человека, которые разводили в 0,01 М карбонатном, рН 9,0 (для ИФА) и боратном, рН 6,0 (для дот-анализа) буферных растворах до начальной концентрации 400 нг/мл, из которой готовили серии двукратных разведений на тех же растворах. Полученные образцы сорбировали в планшетах (для ИФА) или на подложках из синтетической бумаги (для дот-анализа) и выполняли анализ так, как описано в разделе «Материал и методы». Положительным результатом считали значение, превышающее ОПкрит. За лимит определения принимали концентрацию аналита в конечном разведении, дающем положительный результат. Результаты оценки реактивности зондов с разными классами иммуноглобулинов человека приведены в табл. 1.
Приведенные в табл. 1 данные показывают, что все использованные зонды выявляют ^ человека с порогом обнаружения в диапазоне 25-12 нг/мл. Зонды с бактериальными протеинами А и G реагировали с 1дМ и 1дА в концентрации 50 и 200 нг/мл соответственно, что согласуется с ранее опубликованными данными [17]. Зонды с мышиными МКАТ ^-а/Нит и куриными ^-а/Нит не реагируют с 1дМ и 1дА человека, при этом пероксидазные и «золотые» конъюгаты имели одинаковую эффективность выявления ^ человека, а зонды с куриными антителами обнаруживали более низкие концентрации ^ (см. табл. 1).
На следующем этапе сравнивали зонды на основе моно-клональных мышиных IgG-a/Hum и куриных IgY-a/Hum (как реагентов детекции, избирательно выявляющих иммуноглобулины класса G) при определении в образцах сыворотки крови человека IgG к ВКЭ. Проблемой серологической диагностики флавивирусов (ФВ) является выраженная перекрестная реактивность, поскольку гомология белков разных видов ФВ достигает 70-90% [18]. Для снижения перекрестных реакций в тест-системах для серодиагностики ФВ предпочтительно использование не цельных вирусов, а рекомбинантных антигенов [19, 20]. В проведенных модельных экспериментах в качестве реагента захвата использовали рекомби-нантный аналог домена III оболочечного гликопротеина Е ВКЭ (EDIII-ВКЭ), содержащий наибольшее число видоспе-цифичных эпитопов [20, 21]. С использованием этого белка и зондов на основе IgG и IgY созданы экспериментальные наборы для выявления специфических IgG к ВКЭ методами ИФА и дот-анализа. С использованием этих наборов проведен сравнительный анализ панелей образцов сывороток крови пациентов: вакцинированных против КЭ; больных или переболевших КЭ и непривитых доноров; а также панели образцов, содержащих антитела к возбудителям других ФВ инфекций -вирусам желтой лихорадки и денге (табл. 2).
Исследование выполнено в сравнении с коммерческой тест-системой для выявления антител к ВКЭ «ВектоВКЭ-IgG» производства АО «Вектор-Бест». Результаты тестирования панельных образцов сывороток крови с использованием экспериментальных наборов представлены в табл. 3.
Из данных табл. 3 следует, что образцы панели, включающей отрицательные сыворотки доноров и положительные образцы от больных или перенесших заболевание КЭ пациентов, правильно определяются всеми использованными наборами. В панели образцов сыворотки крови от вакцинированных против ВКЭ набор «ВектоВКЭ-IgG» дал положительный результат со всеми сыворотками крови, в то время как экспериментальные наборы не выявляли антитела
Таблица 1. Результаты сравнительной оценки лимита определения ^М и ^ человека зондами на основе детекторных белков с пероксидазой хрена и коллоидным золотом
Аналиты Лимит определения аналитов зондами, нг/мл
наименование производитель HRP-SpG HR Sp П HRP-Mouse IgG-a/Hum HRPChicken IgY-a/Hum Au-SpG Au-SpA Au-Mouse IgG-a/ Hum Au-Chicken IgY-a/Hum
IgG человека Sigma 25 12 25 12 12 12 25 12
IgM человека «Имтек» 50 50 0 0 50 50 0 0
IgA человека «Имтек» 200 200 0 0 200 200 0 0
Примечание. 0 - отрицательный результат при анализе всех разведений аналита. Таблица 2. Панели образцов сывороток крови, использованные для тестирования
Число образцов сывороток крови
Панель сывороток крови положительные отрицательные
образцы образцы
От пациентов, вакцинированных против КЭ (I)* 20 20 0
Содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ (II)* 35 20 15
От пациентов, вакцинированных против желтой лихорадки (III)* 10 0 10
Верификационная панель для лихорадки денге (IV)* 9 0 9
Примечание. * - номер панели сывороток крови; расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КУРИНЫХ IgY АНТИТЕЛ К IgG ЧЕЛОВЕКА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ И ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
Таблица 3. Результаты определения антител к вирусу клещевого энцефалита коммерческой тест-системой «ВектоВКЭ-IgG» и экспериментальными наборами для ИФА и дот-иммуноанализа с использованием зондов на основе моноклональных мышиных (Mouse IgG-a/Hum) и поликлональных куриных (Chicken IgY-a/Hum) антител к IgG человека
Результаты тестирования сывороток крови
Наименование диагностического набора панель I I панель II панель III панель IV
+ 1 ' +1 ' +1 ' +1 '
Коммерческая тест-система «ВектоВКЭ-IgG» 20 0 20 15 8 2 7 2
HRP-Mouse IgG-a/Hum 17 3 И 20 15 | 0 10 I 0 II 9
Экспериментальные наборы с зондами HRP-Chicken IgY-a/Hum 17 3 Ц 20 15 | 0 10 I 0 || 9
Au-Mouse IgG-a/Hum 17 3 1 20 15 | 0 10 1 0 || 9
Au-Chicken IgY-a/Hum 17 3 1 20 15 | 0 10 1 0 || 9
в 3 образцах этой панели. Такой результат может быть связан с высокой избирательностью эпитопов использованного в экспериментальных наборах антигена [20-22]. По результатам экспериментов была проведена оценка достоверности различий результатов определения положительных и отрицательных образцов коммерческим тестом и экспериментальными наборами. Для одной степени свободы и альфа-уровне теста 0,05 (5%) критическое значение критерия х2 составил 3,841. Полученные значения от 1,05 до 0,084 ниже этого уровня, что не позволяет опровергнуть нулевую гипотезу об отсутствии различий между данными тестами.
При анализе панелей, содержащих антитела к гетерогенным ФВ набор «ВектоВКЭ-^» позитивно определяет 7 из 9 образцов с антителами к вирусу денге и 8 из 10 образцов, содержащих антитела к вирусу желтой лихорадки. Следует отметить, что отрицательные результаты в панели денге показали образцы, которые, согласно паспорту, содержат не а другие маркеры лихорадки денге. Ранее проведенные другими авторами исследования сывороток от пациентов, перенесших лихорадку денге, с использованием набора «ВектоВКЭ-^» показали, что этот набор положительно определяет образцы
с высоким содержанием антител к вирусу лихорадки денге
[23]. При формировании панели с антителами к вирусу желтой лихорадки образцы отбирали у пациентов с подтвержденным наличием специфических антител к вирусу желтой лихорадки
[24], в анамнезе которых не было вакцинации или перенесенного КЭ. Следует отметить, что отрицательные результаты набор «ВектоВКЭ-^» показал с двумя сыворотками крови этой панели, имеющими минимальный уровень антител к вирусу желтой лихорадки. Все экспериментальные наборы показали отрицательный результат с образцами сывороток крови гетерогенных панелей, что согласуется с мнением других авторов [20, 22] о высокой специфичности использованного реагента захвата - рекомбинантного белка ЕDШ КЭ.
Чувствительность определения специфических антител использованными в предыдущем эксперименте наборами оценивали на двух положительных образцах из панели сывороток крови, содержащих антитела к ВКЭ. Готовили серии двукратных разведений указанных сывороток крови от 1:10 до 1:1280 на растворах для разведения образцов и выполняли тестирование в 5 параллелях с каждым набором. Результаты исследования приведены в табл. 4.
Зазведение Результаты ИФА Результаты дот-анализа
е (ОП450, М±Ах) (усл. ед., M±Ax/V)
з га р коммерческая экспериментальные наборы с зондами
б О тест-система HRP- Mouse IgG-a/ HRP-Chicken IgY-a/ Au- Mouse IgG-a/ Au-Chicken IgY-a/
«ВектоВКЭ-IgG» Hum Hum Hum Hum
1:10 3,774±0,112* 2,97%** 3,028±0,164 5,42% 3,279±0,471 14,36% 1341±69 5,15% 1391±63 4,53%
1:20 2,501±0,142 5,68% 2,562±0,183 7,14% 3,122±0,243 7,78% 1140±58 5,09% 1284±72 5,61%
1:40 1,661±0,032 1,93% 1,888±0,347 18,38% 2,872±0,309 10, 76% 773±77 9,96% 895±64 7,15%
1 1:80 0,945±0,069 7,30% 1,184±0,159 13,43% 2,631±0,174 6,61% 542±82 15,13% 561±75 13,37%
1:160 0,443±0,051 11,51% 0,596±0,072 12,08% 1,719±0,104 6,05% 336±27 8,04% 420±53 12,64%
1:320 0,209±0,016 7,66% 0,298±0,023 7,72% 1,004±0,029 2,89% 305±42 13, 77% 330±61 18,48%
1:640 0,078±0,017 21, 79% 0,162±0,044 27,16% 0,581±0,042 7,23% 172±27 15, 70% 272±17 6,25%
1:1280 0,065±0,013 20,00% 0,106±0,035 33,02% 0,225±0,041 18,32% 124±12 9,68% 154±18 11,69%
Таблица 4. Сравнительные результаты чувствительности определения специфических антител коммерческим набором «ВектоВКЭ-^» и экспериментальными наборами для иммуноферментного анализа (ИФА) и дот-иммуноанализа
Окончание табл. 4
Зазведение Результаты ИФА Результаты дот-анализа
J ш (ОП450> M±Ax) (усл. ед., M±Ax/V)
со га о. коммерческая экспериментальные наборы с зондами
ю О тест-система HRP- Mouse IgG-a/ HRP-Chicken IgY-a/ Au- Mouse IgG-a/ Au-Chicken IgY-a/
«ВектоВКЭ-IgG» Hum Hum Hum Hum
1:10 3,941±0,092 2,33% 3,250±0,253 7,78% 3,622±0,228 6,29% 1311±38 2,90% 1512±50 3,31%
1:20 2,407±0,162 6,73% 2,298±0,236 10,27% 3,306±0,206 6,23% 1194±36 3,02% 1411±63 4,46%
1:40 1,505±0,145 9,63% 1,266±0,304 24,01% 2,869±0,249 8,68% 682±46 6,74% 1120±36 3,21%
2 1:80 0,749±0,084 11,21% 0,738±0,201 27,24% 1,931±0,420 21, 75% 523±73 13,96% 995±51 5,13%
1:160 0,339±0,009 2,65% 0,309±0,039 12,62% 1,209±0,026 2,15% 351±62 17,66% 652±70 10, 74%
1:320 0,152±0,013 8,55% 0,178±0,014 7,87% 0,687±0,029 4,22% 293±58 19,80% 450±31 6,89%
1:640 0,085±0,008 9,41% 0,104±0,023 22,12% 0,402±0,044 10,95% 191±30 15,71% 286±15 5,24%
1:1280 0,059±0,013 22,03% 0,087±0,03 34,38% 0,233±0,015 6,14% 155±27 17,42% 161±26 16,13%
ОПКрИТ 0,300 0,300 0,300 250 250
Примечание. * - жирным шрифтом выделены положительные результаты анализа; ** - курсивом выделены коэффициенты вариации.
Из данных табл. 3 следует, что экспериментальные наборы с зондами на основе куриных антител формировали более интенсивный оптический сигнал по сравнению с конъ-югатами мышиных ^ при удовлетворительной воспроизводимости анализа положительных образцов (коэффициент вариации только в отдельных случаях превышал 12%). Зонды с коллоидным золотом обеспечивали сходную с пероксидаз-ными конъюгатами чувствительность выявления специфических антител, а зонды на основе куриных поликлональных антител демонстрировали преимущество в чувствительности перед зондами с мышиными МКАТ, что согласуется с данными ранее проведенных исследований [3, 7, 9]. Иммобилизованные на подложке в результате иммунной реакции «золотые» конъюгаты с мышиными и куриными антителами одинаково хорошо определялись при «золото-серебряном проявлении». Таким образом, связывание ^ с частицами золота не влияет на стабильность проявителя и эффективность проявления.
Заключение
Куриные IgY-a/Hum антитела могут быть успешно использованы для получения конъюгатов с пероксидазой и коллоидным золотом. Конъюгаты IgY с коллоидным золотом могут быть изготовлены по обычной технологии и не влияют на эффективность «золото-серебряного проявления». Чувствительность дот-иммуноанализа с применением конъюгата Au-IgY-a/Hum не уступает чувствительности ИФА с конъюгатами на основе мышиных и куриных антител. Использованный в экспериментах реагент захвата - реком-бинантный аналог домена III гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита обладает высокой специфичностью и позволяет дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к вирусам желтой лихорадки и денге. Полученные данные позволяют рассматривать антиген EDIII-ВКЭ и зонды на основе куриных антител, в качестве перспективных реагентов для разработки мультиплексного дот-иммуноана-лиза на плоских белковых матрицах.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Российская Федерация:
Полтавченко Александр Георгиевич (Alexander G. Poltavchenko) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
E-mail: poltav@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0003-2408-5611
Ерш Анна Васильевна (Anna V. Ersh) - кандидат биологических наук, научный сотрудник
E-mail: ersh_av@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0002-9220-1250
Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Филатов П.В., Колосова Е.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КУРИНЫХ IgY АНТИТЕЛ К IgG ЧЕЛОВЕКА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ И ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
Ушкаленко Никита Дмитриевич (Nikita D. Ushkalenko) - аспирант, младший научный сотрудник
E-mail: ushkalenko_nd@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0002-2171-7444
Филатов Павел Владимирович (Pavel V. Filatov)* - кандидат биологических наук, научный сотрудник
E-mail: filatov_pv@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0001-7763-3808
Колосова Евгения Андреевна (Evgeniia A. Kolosova) - младший научный сотрудник
E-mail: kurchanovaea@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-8967-4719
Шаньшин Даниил Васильевич (Daniil V. Shanshin) - младший научный сотрудник
E-mail: shanshin_dv@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0001-9985-1582
Щербаков Дмитрий Николаевич (Dmitry N. Shcherbakov) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
E-mail: scherbakov_dn@vector.nsc.ru
https://orcid.org/0000-0001-8023-4453
ЛИТЕРАТУРА
1. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. Multiplexed sandwich assays in microarray format // J. Immunol. Methods. 2004. Vol. 290, N 1. P. 107-120. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jim.2004.04.012
2. Wu R., Yakhkeshi S., Zhang X. Scientometric analysis and perspective of IgY technology study // Poult. Sci. 2022. Vol. 101, N 4. Article ID 101713. DOI: https://doi. org/10.1016/j.psj.2022.101713
3. Karachaliou C.E., Vassilakopoulou V., Livaniou E. IgY technology: methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection of biomolecules // World J. Methodol. 2021. Vol. 11, N 5. P. 243-262. DOI: https://doi. org/10.5662/wjm.v11.i5.243
4. Yakhkeshi S., Wu R., Chelliappan B., Zhang X. Trends in industrialization and commercialization of IgY technology // Front. Immunol. 2022. Vol. 13. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2022.991931
5. Amro W.A., Al-Qaisi W., Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2018. Vol. 16, N 1. P. 99-103. DOI: https://doi.org/10.1016/jjgeb.2017.10.003
6. Lee L. Samardzic K., Wallach M., Frumkin L.R., Mochly-Rosen D. Immunoglobulin Y for potential diagnostic and therapeutic applications in infectious diseases // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.696003
7. Suresh L.G., Indhuprakash S.T., Gandhi S., Diraviyam T. Amalgamation of nanotechnology with chicken IgY to enrich therapeutic and diagnostic applications: a systematic review // Immunotherapy. 2023. Vol. 15, N 11. P. 867-884. DOI: https:// doi.org/10.2217/imt-2022-0304
8. Sotiropoulou G., Pampalakis G., Prosnikli E., Evangelatos G.P., Livaniou E. Development and immunochemical evaluation of a novel chicken IgY antibody specific for KLK6 // Chem. Centr. J. 2012. Vol. 6, N 1. P. 148. DOI: https://doi. org/10.1186/1752-153X-6-148
9. Gasparyan V.K. Hen egg immunoglobulin Y in colloidal gold agglutination assay: comparison with rabbit immunoglobulin G // J. Clin. Lab. Anal. 2005. Vol. 19, N 3. P. 124-127. DOI: https://doi.org/10.1002/jcla.20065
10. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител кур и кроликов в конкурентном иммуноферментном методе определения коровьего р-казоморфина-7 // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55, № 6. C. 617-624. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060102
11. Печелюлько А.А. и др. Сравнительный анализ эффективности использования антител птиц и млекопитающих в сэндвич-методе определения HBsAg // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53, № 1. C. 104-114. DOI: https:// doi.org/10.7868/S055510991701013
12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22, N 12. P. 1084-1091. DOI: https://doi.org/10.1177/22.12.1084
13. Poltavchenko A.G. et al. The selection and optimization of the detection system for self-contained multiplexed dot-immunoassay // J. Immunoassay
Immunochem. 2016. Vol. 37, N 5. P. 540-554. DOI: https://doi.org/10.1080/153 21819.2016.1174134
14. Шаньшин Д.В. и др. Взаимодействие фрагментов оболочечного белка вируса зика с антителами сывороток людей, переболевших флавивирусными инфекциями // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 1. C. 73-82. DOI: https://doi. org/10.15789/2220-7619-AI0-805
15. Полтавченко А.Г. Ерш А.В., Филатов П.В., Баяндин Р.Б., Ушкаленко Н.Д. Разработка метода одновременного выявления серологических маркеров лихорадки денге // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 1. С. 75-83. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-1-75-83
16. Robinson N. Immunogold conjugation for IVD applications // IVD Technologies. 2002. Vol. 8, N 3. P. 33-36.
17. Bloom J.W., Wong M.F., Mitra G. Detection and reduction of Protein A contamination in immobilized Protein A purified monoclonal antibody preparations // J. Immunol. Methods. 1989. Vol. 117, N 1. P. 83-89. DOI: https:// doi.org/10.1016/0022-1759(89)90121-X
18. Pulkkinen L.I.A., Barrass S.V., Domanska A., Överby A.K. et al. Molecular organisation of tick-borne encephalitis virus // Viruses. 2022. Vol. 14, N 4. P. 792. DOI: https://doi.org/10.3390/v14040792
19. Ludolfs D., Reinholz M., Schmitz H. Highly specific detection of antibodies to tick-borne encephalitis (TBE) virus in humans using a domain III antigen and a sensitive immune complex (IC) ELISA // J. Clin. Virol. 2009. Vol. 45, N 2. P. 125-128. DOI: https://doi.org/10.1016/jjcv.2009.03.016
20. Барышникова В.С. и др. Рекомбинантный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита для создания дифференцирующей тест-системы // Биотехнология. 2022. Т. 38, № 6. C. 73-83. DOI: https://doi.org/10.56304/S0234275822060023
21. Holbrook M.R., Shope R.E., Barrett A.D. Use of recombinant E protein domain III-based enzyme-linked immunosorbent assays for differentiation of tickborne encephalitis serocomplex flaviviruses from mosquito-borne flaviviruses // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42, N 9. P. 4101-4110. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.42.9.4101-4110.2004
22. Kuno G. Serodiagnosis of flaviviral infections and vaccinations in humans // Advances in Virus Research. Vol. 61. The Flaviviruses: Detection, Diagnosis, and Vaccine Development / eds. T.J. Chambers et al. Oxford : Academic Press, 2003. P. 3-65. DOI: https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)61001-8
23. Терновой В.А. и др. Выявление маркеров лихорадки денге у пациентов после посещения эндемичных по денге стран // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019. Т. 37, № 3. C. 140-148. DOI: https://doi.org/10.17116/ molgen201937031140
24. Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В., Ушкаленко Н.Д. и др. Разработка способа выявления специфических антител к белку Е вируса желтой лихорадки (Flaviviridae: Flavivirus) методом иммуноферментного анализа // Вопросы вирусологии. 2022. Т. 67, № 4. C. 341-350. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-123
REFERENCES
1. Nielsen U.B., Geierstanger B.H. Multiplexed sandwich assays in microarray format. J Immunol Methods. 2004; 290 (1): 107-20. DOI: https://doi.Org/10.1016/j. jim.2004.04.012
2. Wu R., Yakhkeshi S., Zhang X. Scientometric analysis and perspective of IgY technology study. Poult Sci. 2022; 101 (4): 101713. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.psj.2022.101713
3. Karachaliou C.E., Vassilakopoulou V., Livaniou E. IgY technology: methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection
of biomolecules. World J Methodol. 2021; 11 (5): 243-62. DOI: https://doi. org/10.5662/wjm.v11.i5.243
4. Yakhkeshi S., Wu R., Chelliappan B., Zhang X. Trends in industrialization and commercialization of IgY technology. Front Immunol. 2022; 13. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2022.991931
5. Amro W.A., Al-Qaisi W, Al-Razem F. Production and purification of IgY antibodies from chicken egg yolk. J Genet Eng Biotechnol. 2018; 16 (1): 99-103. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.003
* Автор для корреспонденции.
6. Lee L., Samardzic K., Wallach M., Frumkin L.R., Mochly-Rosen D. Immunoglobulin Y for potential diagnostic and therapeutic applications in infectious diseases. Front Immunol. 2021; 12. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.696003
7. Suresh L.G., Indhuprakash S.T., Gandhi S., Diraviyam T. Amalgamation of nanotechnology with chicken IgY to enrich therapeutic and diagnostic applications: a systematic review. Immunotherapy. 2023; 15 (11): 867-84. DOI: https://doi. org/10.2217/imt-2022-0304
8. Sotiropoulou G., Pampalakis G., Prosnikli E., Evangelatos G.P., Livaniou E. Development and immunochemical evaluation of a novel chicken IgY antibody specific for KLK6. Chem Centr J. 2012; 6 (1): 148. DOI: https://doi.org/10.1186/1752-153X-6-148
9. Gasparyan V.K. Hen egg immunoglobulin Y in colloidal gold agglutination assay: comparison with rabbit immunoglobulin G. J Clin Lab Anal. 2005; 19 (3): 124-7. DOI: https://doi.org/10.1002/jcla.20065
10. Pechelyul'ko A.A., et al. Comparative analysis of the efficiency of chicken and rabbit antibodies in competitive enzyme linked immunoassay for the detection of bovine beta-casomorphin 7. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2019; 55 (6): 617-24. DOI: https://doi.org/10.1134/ S0555109919060102 (in Russian)
11. Pechelyul'ko A.A., et al. Comparative analysis of the efficiency of bird and mammalian antibodies in HBSAG sandwich assay. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2017; 53 (1): 104-14. DOI: https://doi.org/10.7868/S055510991701013 (in Russian)
12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J Histochem Cytochem. 1974 ; 22 (12): 1084-91. DOI: https://doi. org/10.1177/22.12.1084
13. Poltavchenko A.G., et al. The selection and optimization of the detection system for self-contained multiplexed dot-immunoassay. J Immunoassay Immunochem. 2016; 37 (5): 540-54. DOI: https://doi.org/10.1080/15321819.20 16.1174134
14. Shan'shin D.V., et al. An interaction of Zika virus envelope fragments with serum antibodies derived from subjects after flavivirus infections. Infektsiya i immunitet [Infection and Immunity]. 2020; 10 (1): 73-82. DOI: https://doi. org/10.15789/2220-7619-AIO-805 (in Russian)
15. Poltavchenko A.G., Ersh A.V., Filatov P.V., Bayandin R.B., Ushkalenko N.D. Method for simultaneous detection of serological dengue fever markers. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training].
2023; 12 (1): 75-83. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-1-75-83 (in Russian)
16. Robinson N. Immunogold conjugation for IVD applications. IVD Technologies. 2002; 8 (3): 33-36.
17. Bloom J.W., Wong M.F., Mitra G. Detection and reduction of Protein A contamination in immobilized Protein A purified monoclonal antibody preparations. J Immunol Methods. 1989; 117 (1): 83-9. DOI: https://doi. org/10.1016/0022-1759(89)90121-X
18. Pulkkinen L.I.A., Barrass S.V., Domanska A., Överby A.K., et al. Molecular organisation of tick-borne encephalitis virus. Viruses. 2022; 14 (4): 792. DOI: https:// doi.org/10.3390/v14040792
19. Ludolfs D., Reinholz M., Schmitz H. Highly specific detection of antibodies to tick-borne encephalitis (TBE) virus in humans using a domain III antigen and a sensitive immune complex (IC) ELISA. J Clin Virol. 2009; 45 (2): 125-8. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jcv.2009.03.016
20. Baryshnikova V.S., et al. Recombinant glycoprotein E of tick-borne encephalitis virus for a developing differentiated test system. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2022; 38 (6): 73-83. DOI: https://doi.org/10.56304/S0234275822060023 (in Russian)
21. Holbrook M.R., Shope R.E., Barrett A.D. Use of recombinant E protein domain III-based enzyme-linked immunosorbent assays for differentiation of tickborne encephalitis serocomplex flaviviruses from mosquito-borne flaviviruses. J Clin Microbiol. 2004; 42 (9): 4101-10. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.42.9.4101-4110.2004
22. Kuno G. Serodiagnosis of flaviviral infections and vaccinations in humans. In: T.J. Chambers, et al. (eds). Advances in Virus Research. Vol. 61. The Flaviviruses: Detection, Diagnosis, and Vaccine Development. Oxford: Academic Press, 2003: 3-65. DOI: https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)61001-8
23. Ternovoy V.A., et al. Identification of dengue infection markers in patients after visiting to dengue endemic countries. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology, Virology]. 2019; 37 (3): 140-8. DOI: https://doi.org/10.17116/molgen201937031140 (in Russian)
24. Krivosheina E.I., Kartashov M.Yu., Naidenova E.V., Ushkalenko N.D., et al. Development of a method for detection of specific antibodies to E protein of yellow fever virus (Flaviviridae: Flavivirus) by enzyme immunoassay. Voprosy virusologii [Problems of Virology]. 2022; 67 (4): 341-50. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-123 (in Russian)
