CC BY
26
DOI: 10.23868/202011008
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА В МОДЕЛИ НА mSOD1 ТРАНСГЕННЫХ МЫШАХ
М.А. Мухамедьяров1, Е.О. Петухова1, И.И. Салафутдинов2, М.С. Кузнецов1, З.З. Сафиуллов1, Р.Р. Исламов1, А.Л. Зефиров1
1 Казанский государственный медицинский университет, Россия, Казань
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Россия, Казань
ANALYSIS OF EFFICACY OF COMBINED THERAPY OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS IN mSOD1 TRANSGENIC MICE MODEL
M.A. Mukhamedyarov1, E.O. Petukhova1, I.I. Salafutdinov2, M.S. Kuznetsov1, Z.Z. Safiullov1, R.R. Islamov1, A.L. Zefirov1
1 Kazan State Medical University, Russia, Kazan
2 Kazan (Volga Region) Federal University, Russia, Kazan
e-mail: maratm80@list.ru
Поступила: 01.12.2019 Принята к печати: 30.08.2020 Опубликована on-line: 15.12.2020
Боковой амиотрофический склероз — прогрессирующее, фатальное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся поражением мотонейронов головного и спинного мозга. Отсутствие эффективных методов лечения бокового амиотро-фического склероза является одной из важнейших проблем современной медицины. Целью данной работы стало исследование эффективности сочетанного применения антиоксидантного препарата эдаравон и генно-клеточной терапии мононуклеар-ными клетками пуповинной крови, продуцирующими сосудистый эндотелиальный фактор роста, глиальный нейротрофи-ческий фактор и нейрональную молекулу адгезии, в модели бокового амиотрофического склероза на тБ0й1 трансгенных мышах. Анализ динамики выживаемости тБ0й1 трансгенных мышей показал, что генно-клеточная терапия является более эффективной, чем терапия эдаравоном либо комбинированная терапия. При проведении поведенческих тестов было установлено, что все виды использованной терапии способны поддерживать показатели горизонтальной активности и теста силы хватки тБ0й1 мышей в течение 8 недель после начала терапии на уровне, соответствующем мышам дикого типа.
Проведенное исследование дает основание сделать вывод о том, что генно-клеточная терапия с применением мононукле-арных клеток пуповинной крови, экспрессирующих гены ^ЕБР, БВЫР и ЫСАМ, обладает более высокой эффективностью, чем антиоксидантная терапия эдаравоном или комбинированная (антиоксидантная и генно-клеточная) терапия. Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов лечения бокового амиотрофического склероза.
Ключевые слова: боковой амиотрофический склероз, нейродегенеративные заболевания, генно-клеточная терапия, эдаравон.
Amyotrophic lateral sclerosis is a progressive, fatal neurodegenerative disease characterized by damage of the motor neurons of the brain and spinal cord. The lack of effective methods of therapy of amyotrophic lateral sclerosis is one of the most important problems of contemporary medicine. The aim of this work was to study the effectiveness of combined use of the antioxidant drug edaravone and gene-cell therapy with umbilical cord blood mononuclear cells producing vascular endothelial growth factor, glial cell-derived neurotrophic factor and neural cell adhesion molecule in the model of amyotrophic lateral sclerosis on mSODI transgenic mice. Analysis of survival dynamics of mSODI transgenic mice showed that gene-cell therapy is more effective than edaravone therapy or combined therapy. Conducting of behavioral tests showed that all types of used therapy are able to support the parameters of horizontal activity and grip strength test of mSODI mice during 8 weeks from beginning of the therapy at the level corresponding to wild type mice.
Conducted study showed that gene-cell therapy with use of umbilical cord blood mononuclear cells producing vascular endothelial growth factor, glial cell-derived neurotrophic factor and neural cell adhesion molecule is more effective than antioxidant therapy with edaravone or combined (antioxidant and gene-cell) therapy. These findings could be used in studies aimed on development of treatment of amyotrophic lateral sclerosis.
Keywords: amyotrophic lateral sclerosis, neurodegenerative diseases, gene-cell therapy, edaravone.
Введение
Боковой амиотрофический склероз (БАС) — прогрессирующее, фатальное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся поражением мотонейронов головного и спинного мозга. По мере прогрессирования болезнь захватывает практически все скелетные мышцы, включая диафрагму; в большинстве клинических случаев смерть пациентов наступает от паралича дыхательных мышц через 3-5 лет после постановки диагноза. К ключевым процессам, лежащим в основе нейротоксичности и гибели мотонейронов при БАс, относятся окислительный стресс, аномальная белковая аггрегация, митохондриальная дисфункция, эксайтотоксичность, воспалительные реакции, нарушение липидного метаболизма, дефицит факторов роста, нарушения цитоскелета и аксонного транспорта, синаптическая дисфункция, глиальная патология [1, 2].
Отсутствие эффективных методов терапии БАС — одна из важнейших проблем современной медицины.
В настоящее время имеются два препарата, одобренных для лечения БАС в США — рилузол и эдаравон, однако и тот, и другой имеют весьма ограниченную эффективность [3]. В связи с этим продолжаются интенсивные исследования по разработке новых способов лечения БАС. Одним из наиболее перспективных способов нейро-протекции является применение генно-клеточной терапии, при которой в организм больного вводят стволовые или прогениторные клетки, предварительно генетически модифицированные с помощью экспрессионного вирусного или плазмидного вектора, сверхэкспрессирующего поддерживающие выживание нейронов факторы [4]. Ранее нами был показан положительный эффект применения мононуклеарных клеток пуповинной крови (МКПК), продуцирующих рекомбинантные сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБЭР), глиальный нейротрофический фактор (6131\Р) и нейрональную молекулу адгезии (1\1САМ), в модели БАС на трансгенных
мышах [5, 6]. При комбинировании нескольких терапевтических подходов, нацеленных на коррекцию различных патогенетических звеньев заболевания, можно ожидать повышение эффективности лечения.
Целью данной работы стало исследование эффективности сочетанного применения генно-клеточной терапии и антиоксидантного препарата эдаравон в модели БАС на трансгенных мышах.
Материал и методы
Дизайн исследования
Эффективность комбинированной терапии БАС — сочетанного применения антиоксидантного препарата эдаравон и генно-клеточной терапии МКПК — оценивали в модели БАС на трансгенных мышах генотипа B6SJL-Tg(SOD1 -G93A)dl1 Gur/J (mSODI мыши), экспрес-сирующих мутантный человеческий ген, кодирующий цитозольный фермент Cu/Zn-супероксиддисмутазу SOD1 (Gly93 замещён на аланин в позиции 93). mSODI-мыши становятся парализованными на одну или более конечностей, начиная с 6-7 мес. возраста, продолжительность их жизни с момента появления симптомов составляет около 2 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария, все необходимые манипуляции выполняли в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/ЕС по экспериментам на животных, Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (2003) и были одобрены этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 06.10.2015).
Животные одного возраста были разделены на 5 групп:
1) мыши дикого типа, не получавшие терапию — контроль № 1 (n=8, группа WT)
2) mSOD1-мыши, не получавшие терапию — контроль № 2 (n=8, группа ALS)
3) mSOD1 мыши, получавшие МКПК, продуцирующие VEGF, GDNF, NCAM (n=9, группа VGN)
4) mSOD1 мыши, получавшие эдаравон (n=6, группа EDN)
5) mSOD1 мыши, получавшие комбинированную терапию (n=8, группа COMBO).
Для определения эффективности примененных видов терапии изучали выживаемость мышей и их поведенческие реакции в течение 15 недель с момента начала лечения.
Создание генно-клеточных конструкций
Заготовку пуповинной крови проводили после получения информированного согласия у беременной и дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток. Кровь собирали в пластиковые контейнеры CPDA-1 250 GG (Terumo, Япония) и доставляли в Банк стволовых клеток КГМУ, где из неё выделяли мононуклеарную фракцию (МКПК) в градиенте плотности фиколла (ПанЭко, Россия) по стандартной методике [5]. Полученные МКПК ресуспензировали в среде DMEM, к которой были добавлены сыворотка крови плодов коровы (10%), L-глутамин (2 мМ), смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (1%) (Sigma, США). Для генетической модификации клетки трансду-цировали рекомбинантными аденовирусами, несущими ген глиального нейротрофического фактора (Ad5-GDNF), ген сосудистого эндотелиального фактора роста (Ad5-VEGF165) и ген нейрональной молекулы адгезии (AÓ5-NCAM) (10 бляшко-образующих единиц на клетку).
МКПК культивировали 14-16 ч. в 10 см культуральных чашках при 37 °С в условиях термостатирования с поддержанием 5% уровня С02 во влажной атмосфере.
Протокол терапии
Ксенотрансплантацию МКПК животным групп VGN и COMBO проводили одновременно, однократно в количестве 2 млн. клеток на 1 животное в ретроорбитальный венозный синус, на стадии заболевания с ранней симптоматикой (средний возраст мышей 36,7 ± 0,2 недели, клиническая симптоматика у большинства животных проявлялась в виде пареза конечностей). Через 4 сут. после трансплантации МКПК мышам групп EDN и COMBO ежедневно внутрибрюшинно вводили эдаравон (3-Methyl-1 -phenyl-2-pyrazol¡ne-5-one, Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мг/кг до окончания эксперимента.
Оценка эффективности терапии
Выживаемость мышей оценивали с помощью графика, отражающего еженедельную динамику изменения количества выживших животных в процентах от общего количества животных в группе.
Двигательную активность мышей в ходе эксперимента оценивали стандартными методами при помощи поведенческих тестов — «открытое поле» и «тест силы хватки», детально описанные ранее [7]. Для тестирования в установке «открытое поле» (НПК Открытая Наука, Москва, Россия) мышь на 3 мин. помещали внутрь арены и подсчитывали количество пересечённых ею линий на полу (горизонтальная активность). Для проведения «теста силы хватки» мышам, удерживая их за хвост, позволяли вцепиться всеми лапками в горизонтально расположенную металлическую решётку. После этого решетку медленно переворачивали таким образом, что мыши оказывались висящими на решетке животом кверху. При проведении теста фиксировали время, в течение которого животное удерживалось на решётке. Мышей всех экспериментальных групп начинали тестировать за 7-10 сут. до начала терапии и продолжали после терапии с периодичностью 2 раза в неделю. Для сравнения динамики изменения поведенческой активности мышей различных групп, исследуемые показатели были нормализованы: за 100% были приняты средние значения, полученные до терапии. В статье описаны показатели поведенческой активности мышей на 4 и 8 неделях после начала терапии; после 8 недели количество животных было недостаточным для получения статистически значимых результатов.
Статистический анализ
результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Для анализа выживаемости (частоты наступления летальных исходов) использовали точный тест Фишера. Статистическую значимость различий изучаемых показателей поведенческой активности оценивали при помощи U-критерия Манна-Уитни. Для оценки различий показателей поведенческой активности в разные временные промежутки применяли тест Уилкоксона. отличия считали статистически значимыми (достоверными) при P<0,05.
Результаты
У мышей группы COMBO, как и у мышей групп VGN и EDN, отсутствовали негативные побочные эффекты терапии (на основе визуального анализа и оценки
Неделя
Рис. 1. Динамика выживаемости трансгенных mSODI мышей в течение 15 нед. после использования различных видов терапии. Количество выживших трансгенных mSODI мышей указано в процентах от общего числа мышей в каждой экспериментальной группе: ALS — mSODI-мыши, не получавшие терапию; VGN — mSODI мыши, получавшие МКПК, продуцирующие VEGF, GDNF, NCAM; EDN — mSODI мыши, получавшие эдаравон; COMBO — mSODI мыши, получавшие комбинированную терапию. *различия статистически значимы при сравнении с группой ALS
клинической симптоматики). Животные хорошо переносили терапию, что свидетельствует об адекватных применяемых дозах препаратов.
Через 6 недель после начала терапии в живых осталось 37,5% животных группы COMBO, 77,7% животных группы VGN, 33,3% животных группы EDN и 12,5% животных группы ALS (рис. 1). Статистический анализ выявил, что показатель выживаемости мышей группы VGN (но не показатели групп EDN и COMBO) достоверно отличался от показателя выживаемости мышей группы ALS, при этом показатель выживаемости мышей группы VGN также достоверно отличался от показателей у мышей групп EDN и COMBO. Через 10 недель после начала терапии в группе ALS не осталось живых животных. Через 15 недель после начала терапии выживаемость в группах VGN и EDN оказалась равной и составила 33,3% (достоверно больше по сравнению с группой ALS), а в группе COMBO — 12,5%; при этом статистически значимые отличия группы COMBO от групп VGN и EDN отсутствовали.
Таким образом, анализ динамики выживаемости mSOD1 трансгенных мышей показал, что наиболее эффективной является терапия МКПК, продуцирующими VEGF, GDNF и NCAM, по сравнению с терапией эдаравоном либо комбинированной терапией. При сравнении эффективности эдаравона и комбинированной терапии было обнаружено, что, начиная с 10 недели от начала лечения терапия эдаравоном достоверно улучшала выживаемость mSOD1 мышей, тогда как комбинированная терапия не вызывала достоверного улучшения выживаемости.
У мышей группы WT до начала терапии горизонтальная активность и показатель теста силы хватки составили 56,5 ± 17,4 и 77,2 ± 16,9, соответственно; статистически значимые отличия данных показателей для мышей остальных групп по сравнению с мышами группы WT отсутствовали.
Горизонтальная активность мышей группы WT достоверно не изменялась в течение 8 недель от начала терапии.
В группе ALS мышей с 4 недели эксперимента осталась в живых только одна мышь, в связи с чем статистическую значимость отличий поведенческих показателей от других групп на этих сроках тестирования установить не удалось. На 4 и 8 неделях статистически значимые отличия показателя горизонтальной активности между мышами остальных экспериментальных групп отсутствовали.
Показатель теста силы хватки у мышей группы WT достоверно не изменялся в течение 8 недель от начала терапии. На 4 и 8 неделях статистически значимые отличия показателя теста силы хватки между мышами групп WT, VGN, EDN, COMBO отсутствовали.
таким образом, в группах mSOD1 мышей, получавших различные виды терапии, показатели моторной активности на сроках до 8 недели после начала терапии достоверно не отличались от таковых у мышей группы WT.
Обсуждение
Применение стволовых и прогениторных клеток в качестве носителей для доставки нейротрофических факторов в пораженные участки мозга активно исследуется в целях разработки лечения ишемических и нейро-дегенеративных заболеваний. Преимуществами МКПК является их пригодность для алло- и аутотрансплантации у человека, низкая иммуногенность, простота получения и хранения, а также отсутствие законодательных и этических запретов их применения [4-7]. Ранее нами было доказано, что трансплантированные клетки способны выживать и продуцировать нейротрофические факторы (VEGF, GDNF, nCaM) в ткани спинного мозга mSOD1 мышей в течение более 2 мес. после трансплантации [5, 6]. В настоящей работе нами было установлено, что генно-клеточная терапия с применением МКПК, экспрессирующих гены VEGF, GDNF и NCAM, оказывает наиболее выраженный позитивный эффект на выживаемость mSOD1 трансгенных мышей на симптомной
стадии заболевания в сравнении с антиоксидантной терапией эдаравоном и комбинированной (генно-клеточ-ной и антиоксидантной) терапией. Анализ результатов поведенческих тестов показал отсутствие статистически значимых отличий показателей моторной активности между мышами групп VGN, EDN, COMBO; показатели моторной активности у мышей данных групп не отличались от таковых, полученных у мышей группы WT.
Эдаравон является нейропротекторным препаратом, принцип действия которого основан на активном связывании свободных радикалов, что защищает от окислительного стресса и апоптоза нейронов [8, 9]. Препарат был выведен на рынок компанией Мицубиси Фарма (Япония) в 2001 г. В 2015 г. эдаравон был одобрен в качестве препарата для лечения БАС в Японии, а в 2017 г. — в США. Клинические исследования эдара-вона показали его эффективность при БАС у пациентов с умеренной симптоматикой [10]. В настоящей работе при оценке выживаемости mSOD1 мышей терапия эдаравоном обладала меньшей эффективностью по сравнению с генно-клеточной терапией; при этом через 15 недель после начала терапии процентная доля выживших мышей в группах VGN и EDN оказалась равной.
Наше предположение о возможности потенциации лечебных эффектов при комбинировании генно-клеточ-ной терапии МКПК, экспрессирующими гены VEGF, GDNF, NCAM, с применением эдаравона не подтвердилось
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Brown R.H. Jr., Al-Chalabi A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. N. Engl. J. Med. 2017; 377(16): 1602.
2. Мухамедьяров М.А., Петров А.М., Григорьев П.Н. и др. Боковой амиотрофический склероз: современные представления о патогенезе и экспериментальные модели. Журнал высшей нервной деятельности имени И.П. Павлова 2018; 68(5): 551-67. [Mukhamedyarov M.A., Petrov A.M., Grigoryev P.N. et al. Amyotrophic lateral sclerosis: Modern views on the pathogenesis and experimental models. Journal of higher nervous activity named after I.P. Pavlov 2018; 68(5): 551-67].
3. Jaiswal M.K. Riluzole and edaravone: A tale of two amyotrophic lateral sclerosis drugs. Med. Res. Rev. 2018; 39(2): 733-48.
4. Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Гусева Д.С. и др. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(3): 29-38. [Islamov R.R., Rizvanov A.A., Guseva D.S. et al. Gene and cell therapy of neurodegenerative diseases. Cell transplantology and tissue engineering 2007; 2(3): 29-38].
5. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Mukhamedyarov M.A. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neural cell adhesion molecule. Current Gene Therapy 2015; 15(3): 266-76.
(по крайней мере, в условиях нашего эксперимента). Процентная доля выживших животных в группе COMBO достоверно не отличалась от таковой в группе ALS. Полученный результат, вероятно, можно объяснить тем, что сочетание выбранных нами двух терапевтических подходов не позволило осуществить коррекцию большего числа патогенетических механизмов заболевания, чем каждый из данных способов терапии по отдельности.
Таким образом, при изучении эффективности различных терапевтических стратегий для лечения БАС на mSODI мышах анализ динамики выживаемости mSODI трансгенных мышей показал, что генно-клеточ-ная терапия с применением МКПК, экспрессирующих гены VEGF, GDNF и NCAM, является более эффективной, чем терапия эдаравоном либо комбинированная (анти-оксидантная и генно-клеточная) терапия. Полученные результаты имеют как фундаментальный, так и прикладной характер, и могут быть использованы в исследованиях по разработке новых способов лечения БАс.
Благодарности
Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (грант № 14-15-00847). Работа частично выполнялась в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.
6. Islamov R.R., Rizvanov A.A., Fedotova V.Y. et al. Tandem Delivery of Multiple Therapeutic Genes Using Umbilical Cord Blood Cells Improves Symptomatic Outcomes in ALS. Molecular Neurobiology 2017; 54(6): 4756-63.
7. Мухамедьяров М.А., Ризванов А.А., Сафиуллов З.З. и др. Анализ эффективности генно-клеточной терапии у трансгенных мышей с фенотипом бокового амиотрофического склероза. Клеточные технологии в биологии и медицине 2012; 4: 215-9. [Mukhamedyarov M.A., Rizvanov A.A., Safiullov Z.Z. et al. Analysis of the efficiency of gene-cell therapy in transgenic mice with amyotrophic lateral sclerosis phenotype. Cell technologies in biology and medicine 2012; 4: 215-9].
8. Watanabe T., Tanaka M., Watanabe K. et al. Research and development of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotectant. Yakugaku Zasshi 2004; 124(3): 99-111.
9. Bhandari R., Kuhad A., Kuhad A. Edaravone: a new hope for deadly amyotrophic lateral sclerosis. Drugs Today (Barc) 2018; 54(6): 349-60.
10. Abe K., Itoyama Y., Sobue G. et al. Confirmatory double-blind, parallel-group, placebo-controlled study of efficacy and safety of edaravone (MCI-186) in amyotrophic lateral sclerosis patients. Amyotroph. Lateral Scler. Frontotemporal Degener. 2014; 15(7-8): 610-7.
