CC BY
10© Коллектив авторов, 2021 Вопросы онкологии, 2021. Том 67, № 6
УДК 616.006:08-035
DOI 10.37469/0507-3758-2021-67-6-815-828
А.Б. данилова, т.л. нехаева, н.А. Ефремова, А.В. новик, А.Ю. Зозуля, г.и. гафтон,
и.А. Балуева
Оценка эффективности использования тумороидов для индивидуального подбора лекарственной терапии
солидных опухолей
ФБГУ «НМИЦ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава россии, Санкт-Петербург
Подход к лечению злокачественных новообразований, направленный на определение эффективных терапевтических стратегий для каждого пациента, определяет необходимость разработки и использования модельных систем, которые воспроизводят структуру и биологию солидных опухолей человека. В трехмерных культурах сфероидов/туморои-дов, представляющих из себя многоклеточные агрегаты малигнизированных клеток, можно создавать интересующие межклеточные взаимодействия, градиенты питательных веществ и кислорода, а также клеточную полярность, которая отсутствует в традиционной двухмерный монослойной системе.
Данная работа посвящена сравнительному исследованию in vitro жизнеспособности и ин-вазивных свойств клеток солидных опухолей пациентов под действием химиопрепаратов и их комбинаций с целью оценки эффективности использования 3D-клеточной модельной системы в контексте трансляционной персонализированной медицины.
Основой для создания 3D-клеточных моделей служили культуры клеток солидных опухолей пациентов, которые проходили лечение в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова в 2015-2021 гг. Фрагменты опухолевой ткани были получены интраоперационно: 1 — лей-омиосаркома (ЛМС), 1 — рабдомиосаркома (РМС), 1 — синовиальная саркома (СС), 2 — миксофибросаркома (МФс), 2 — остеогенная саркома (ОС), 1 — меланома кожи (МК), 1 — рак молочной железы (РМЖ), (n=9).
Проведенный индивидуальный анализ сравнения эффективности воздействия хи-миотерапевтических препаратов in vitro на опухолевые клетки, имеющие различное происхождение и культивируемые в 2D и 3D-модельных системах, с реально наблюдаемой клинической ситуацией подтверждает, что монослойная культура как тест-система подходит в меньшей степени для подбора и индивидуализации лечения больных злокачественными новообразованиями: трехмерная
клеточная система оправдала себя в 77,7% случаев, а монослойная культура — в 44,4% случаев. Комбинация препаратов доксоруби-цин/ифосфамид и паклитаксел существенно ингибировали подвижность в матригеле клеток сфероидов, но не влияли на жизнеспособность опухолевых клеток, что наблюдали во всех случаях, кроме ОС #921 и МК #929.
Культивирование опухолевых клеток в виде сфероидов/тумороидов позволяет использовать их как более адекватную доклиническую модель в качестве индивидуальной предиктивной тест-системы, позволяющей производить персонализированный подбор терапии.
Ключевые слова: злокачественные опухоли, сфероиды, тумороиды, химиорезистент-ность, доксорубицин, ифосфамид, паклитак-сел
Прецизионная онкология — это подход к лечению злокачественных новообразований, который направлен на определение эффективных терапевтических стратегий для каждого пациента [1]. Разработка и использование модельных систем, которые воспроизводят структуру и биологию солидных опухолей человека, необходимы для лучшего понимания патофизиологии процессов, протекающих в опухоли, и разработки новых персонализированных противоопухолевых методов лечения. К сожалению, для многих типов неоплазий традиционные методики культивирования клеток не позволяют адекватно моделировать биологию нативной опухоли. Высокая частота неудач доклинических испытаний в клинических исследованиях ясно демонстрирует ограничения существующих доклинических моделей [2]. В то же время процесс разработки лекарств требует дальнейшего совершенствования в отношении скрининга противоопухолевых терапевтических средств, чтобы сделать этот процесс более экономически эффективным и исключить малоэффективные соединения на самой ранней стадии [3].
В настоящее время существует достаточное разнообразие клеточных систем, воспроизводящих микроокружение солидных опухолей [4]. В SD-культурах сфероидов, представляющих собой многоклеточные агрегаты малигнизированных клеток, можно создавать интересующие межклеточные взаимодействия, градиенты питательных веществ и кислорода, а также клеточную полярность, которая отсутствует в традиционной двухмерный монослойной системе [5, 6]. Сфероиды отражают гетерогенность опухолей и содержат зоны пролиферирующих, покоящихся и погибающих клеток, которые также присутствуют в малигнизированной ткани человека, и обладают разной чувствительностью к противоопухолевым препаратам [4, 7]. Кроме того, в стандартных 2D-моделях клетки всегда культивируют на поверхности с более высокой жесткостью (пластиковая чашка Петри — 105 кПа) по сравнению с более низкой жесткостью опухолевого микроокружения мягких тканей (1-25 кПа), что оказывает влияние на организацию компонентов цитоскелета, и, следовательно, на клеточную полярность, метаболизм и экспрессию белков [8].
Миграция опухолевых клеток является ключевым признаком злокачественности, который ассоциирован с прогрессированием от первично локализованного опухолевого очага к инвазивно-му и/или метастатическому фенотипу. В традиционных методах оценки миграции опухолевых клеток in vitro обычно используют двухмерные гомогенные культуры, где не принимают во внимание гетерогенность опухоли, межклеточные контакты между малигнизированными клетками и клетками стромы опухоли, а также взаимодействия с белками внеклеточного матрикса [9]. Трехмерный анализ миграции на основе туморо-идов, который более точно отражает микросреду солидной опухоли, учитывая клеточные и внеклеточные взаимодействия, может быть использован для оценки эффективности воздействия лекарственных препаратов [10].
таким образом, использование трехмерных моделей клеточных культур вносит значительный вклад в процесс открытия и разработки лекарственных средств, являясь важным промежуточным этапом между традиционными однослойными культурами in vitro и дорогостоящими исследованиями на животных in vivo, позволяющим минимизировать затраты на доклинические испытания. Кроме того, SD-модели могут быть эффективным инструментом для оценки и выбора наиболее адекватной индивидуальной терапии для злокачественных новообразований определенных нозологий.
мы представляем исследование in vitro жизнеспособности и инвазивных свойств клеток солидных опухолей, выделенных из интраопе-
рационного материала пациентов, проходивших лечение в ФБГУ «НМИЦ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, в SD-системе под действием химиопрепаратов и их комбинаций, которые применялись для лечения этих больных, с целью оценки эффективности использования SD-клеточной модельной системы в контексте трансляционной персонализированной медицины.
Материалы и методы
Основой для создания 3Б-клеточных моделей служили культуры клеток солидных опухолей пациентов, которые проходили лечение в НМИЦ онкологии им. H.H. Петрова в 2015-2021 гг. Фрагменты опухолевой ткани были получены интраоперационно: 1 — лейомиосаркома (ЛМС), 1 — рабдомиосаркома (РМС), 1 — синовиальная саркома (СС), 2 — миксофибросаркома (МФС), 2 — остеогенная саркома (ОС), 1 — меланома кожи (МК), 1 — рак молочной железы (РМЖ) (n=9). Протокол исследования был одобрен этическим комитетом, от всех пациентов было получено информированное согласие, а образцы тканей хранили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и использовали в соответствии с Законом о тканях человека от 2004 г. Клиническая характеристика пациентов, гистологическая верификация опухолей и их локализация представлены в табл. 1.
Монослойные клеточные культуры. После механической дезагрегации тканевых образцов в Медимашине (Dako) клеточную суспензию пропускали последовательно через систему фильтров Filcon 70 и 50 мкм (BD Bioscience, США), после чего помещали в полную питательную среду DMEM/F12, содержащую 20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС), глутамин (365 мг/л), инсулин (5 мкг/мл), трасферрин (5 мкг/мл), селен (5 нг/мл) (Invirtrogen, США), пенициллин (100 ед/ мл), стрептомицин (100 мкг/мл) (Sigma, США), и непрерывно культивировали при 5% CO2, 100% влажности в пластиковых флаконах (BD Bioscience, США) по методу Freshney [11] с собственными модификациями [12]. После достижения монослоя клетки пересевали, используя раствор, состоящий из равных долей 0,25% трипсина и 0,02% версена (Биолот, РФ). Культуры опухолевых клеток были получены во всех случаях, клетки культивировали непрерывно не менее 10 пассажей.
опухолевые сфероиды. Для получения сфероидов применяли метод культивирования на низкоадгезивных поверхностях (Liquid overlay technique) с использованием 96-луночных планшетов Ultra-Low Attachment Surface (Corning, США). Клетки помещали в лунки планшета в посевной концентрации 1*105 в 200 мкл полной питательной среды. Сфероиды культивировали 3-8 сут в зависимости от клеточной линии в СО2-инкубаторе «Heracel» (Thermo Electron LTD GmbH, ФРГ) при 37 °С, во влажной атмосфере с 5% уровнем СО2. В процессе культивирования на 3-4 сут проводили смену среды в лунках планшета. По окончании культивирования изъятые сфероиды отмывали в фосфатно-солевом буфере, после чего проводили последующие манипуляции.
Химиопрепараты и их комбинации. Выбор химиотера-певтических агентов и их комбинаций для экспериментов in vitro был осуществлен в соответствии со схемой лечения пациентов, из образцов злокачественных новообразований которых были приготовлены культуры опухолевых клеток (см. табл. 1). В процессе терапии пациенты имели несколько линий химиотерапии с применением препаратов таксано-вого ряда, антрациклиновых антибиотиков, алкилирующих
Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов, из операционного материала которых были получены культуры опухолевых клеток для экспериментальных исследований
# Пациент, пол, возраст, диагноз Локализация образца Лечение до получения опухолевого материала Эффект лечения по системе RECIST Лечение после получения опухолевого материала Эффект лечения по системе RECIST ОВ1, мес.
728 П., м, 62 г, миксофибро- саркома Метастаз в мягкие ткани 1 линия: AD2 SD3 2 линия: Циклофосфан+Метотрек-сат в метрономном режиме в сочетании с дКв4 SD 40,4
982 А., ж, 66 л., миксофибро- саркома Рецидив 1 линия: AI5 SD Не проводилось 4,8
2 линия: GD6 PD7
793 Р., ж, 42 г, злокачественная гигантокле-точная опухоль мягких тканей Метастаз в легкое 1 линия: Дакарбазин+Док-сорубицин+Циклофосфамид PD 6 линия: ДКВ PD 4,9
2 линия: Цисплатин+ Циклофосфамид+ Вин-кристин PD
3 линия: TC8 PD
4 линия: IE9 PD
5 линия: GD PD
921 Д., ж, 13 л., остеосаркома Метастаз в легкое 1 линия: Доксо- рубицин+Цисплатин+Мето- трексат SD не проводилось 1,3
2 линия: ICE10 PD
716 М., ж, 48 л., синовиальная саркома Рецидив 1 линия: AI PR11 4 линия: Гемцитабин PD 10,6
2 линия: ДКВ PD 5 линия: Пазопаниб SD
3 линия: CyVADIC12 SD
699 М., ж, 28 л., лейомиосар-кома Метастаз в легкое 1 линия: GD PD 3 линия: Трабектидин PD 56
2 линия: AI PR 4 линия: ДКВ PD
5 линия: Дакарбазин PD
862 К., м, 12 л., рабдомиосар- кома Метастаз в легкое 1 линия: Винкристин+Ифос фамид+Этопозид+Карбопла тин+Эпирубицин SD не проводилось 2,7
2 линия: Винкристин+ Топо-текан +Циклофосфамид PR
3 линия: ICE SD
4 линия: ДКВ PD
929 С., ж, 29 л., меланома кожи Метастаз в легкое 1 линия: Вемурафениб+ Кобиметиниб+Ниволумаб SD Не проводилось 2,0
2 линия: ТС12+Ипилимумаб PD
973 К., ж., 40 л., трижды негативный рак молочной железы Первичная опухоль 1 линия: АС13 PD Не проводилось 2,0
2 линия: ТС PD
3 линия: Эрибулин+Капецитабин PD
Примечания/1 Общая выживаемость (ОВ) от даты получения опухолевого материала до смерти; 2 химиотерапия по схеме Доксорубицин+Дакарбазин (AD); 3 Stable Disease (SD); 4 дендритно-клеточная вакцина (ДКВ); 5 химиотерапия по схеме Доксорубицин+Ифосфамид (AI); 6 химиотерапия по схеме Гемцитабин+Доцетаксел (GD); 7 Progressive Disease (PD); 8 химиотерапия по схеме Паклитаксел+Карбоплатин (ТС); 9 химиотереапия по схеме Ифосфамид+Этопозид (IE); 10 Ифосфамид+Карбоплатин+Этопозид (ICE); 11 Partial Response (PR); 12 химиотерапия по схеме Циклофосфан, Винкристин, Адриамицин (CyVADIC); 13 химиотерапия по схеме Доксорубицин+Циклофосфамид (АС).
Таблица 2. Фармакокинетические характеристики исследуемых химиопрепаратов
Название препарата Пик концентрации препарата в плазме крови, мкг/мл 10% от пика концентрации препарата в плазме крови, мкг/мл Период полувыведения из организма, ч
Доксорубицин 0,5 0,05 20
Ифосфамид 222 22,2 15
Паклитаксел 2,17 0,217 13
Цисплатин 2,5 0,25 2
средств: паклитаксел, цисплатин, доксорубицин, ифосфа-мид. В системе in vitro были использованы концентрации этих препаратов в соответствии с их фармокинетическими свойствами: паклитаксел (Новалек Фармасьютикалс, Индия) (пик концентрации в плазме крови (ПК) — 2,17 мкг/ мл; 10%ПК — 0,217 мкг/мл), цисплатин (Цисплатин-Тева, Израиль) (ПК — 3 мкг/мл, 10%ПК — 0,3 мкг/мл), комбинация доксорубицин (Лэнс-фарм, Россия)+ифосфамид (Холоксан, Бакстер онкология гмбх, Германия) (ПК — 1,0/440 мкг/мл; 10%ПК — 0,1/44 мкг/мл) в соответствии со схемой химиотерапии AI. Для расчета действующей концентрации препарата использовали информацию о пике его концентрации в плазме крови согласно указаниям Salmon S.E. и соавт. (1980) [13]. В данном руководстве рекомендовано принимать in vitro в качестве эквивалента терапевтической дозы концентрацию, равную 10% от пика концентрации препарата в плазме крови. Время инкубации в условиях С02-инкубатора (+37 °С, 5-6,5% CO2) с химио-препаратом соответствовало времени его полувыведения из организма человека (табл. 2).
определение жизнеспособности опухолевых клеток. Для оценки химиорезистентности и жизнеспособности опухолевых клеток был использован МТТ-тест. МТТ-тест обнаруживает NAD(P)H-зависимую клеточную оксидо-редуктазную активность, которая ассоциирована с жизнеспособностью клеток. Этот фермент восстанавливает тетразолиевый краситель МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтенилтетразолия бромида до нерастворимого формазана. Сфероиды и монослойные культуры помещали в 96-луночные планшеты и инкубировали с химиопрепаратами. Затем в лунки вносили по 10 мкл метаболита MTT (Roche, Швейцария) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течении 4 ч (для монослойных культур) и в течении 24 ч (для ту-мороидов) в условиях С02-инкубатора. Далее добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и инкубировали дополнительно в течение часа. Для тумороидов содержимое лунок переносили в эппендорфы, центрифугировали, удаляли супернатанты и добавляли 100 мкл DMSO. Затем раствор снова переносили в 96-луночный планшет.
Оптическую плотность (ОП) полученных растворов измеряли на фотометре для микропланшет iMark (Bio-Rad
Laboratories, США) при длине волны 595 нм. Для перевода единиц оптической плотности (E) в проценты жизнеспособности использовали формулу: (E -E )х100%.
т: г J J \ опыт контроль'
оценка инвазивного потенциала опухолевых клеток. Исследование инвазивных свойств тумороидов осуществляли в трехмерной среде — матригеле (Corning, США) под влиянием цитостатиков с помощью автоматической аналитической системы наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (CM Technologies Oy, Финляндия). Опухолевые сфероиды отмывали фосфатно-солевым буфером, после чего высаживали в ячейки 48-луночного планшета, предварительно покрытого полимеризованным матригелем, с добавлением 700 мкл полной питательной среды, содержащей исследуемые химиопрепараты в соответствующих концентрациях.
Анализ изменения диаметра и площади тумороидов осуществляли с помощью программного обеспечения Cell-IQ® AnalyserTM (CM Technologies Oy, Финляндия), которое автоматизирует процесс количественного измерения нескольких параметров клеток на основе фазового контраста. Инвазивный потенциал опухолевых клеток в 3D-системе оценивали по изменению площади, занимаемой сфероидом.
Статистическая обработка. Проводили статистическую обработку данных с использованием W-критерия Уилкоксона для связных выборок. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Хранение, обработку, статистический анализ данных и визуализацию результатов осуществляли с использованием Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corporation, США) и с помощью R v. 4.0.1. [14].
Результаты
После дезагрегации опухолевых фрагментов были получены культуры ЛМС #699, РМС #862, СС #716, МФС #728, #982, ОС #793, #921, МК #929, РМЖ #973. Морфологически все выделенные опухолевые клетки, культивируемые в виде монослоя, отличались высокой гетерогенностью, в том числе в пределах одного гистологического типа, и формировали сфероиды (рис. 1).
Таблица 3. Результаты сравнительного анализа эффективности воздействия химиотерапевтических агентов на жизнеспособность и инвазивные свойства клеток солидных опухолей, культивируемых в 2D и 3D-системах
Клетки Жизнеспособность (% по отношению к контролю) Инвазия (скорость изменения площади сфероида, (мкм2/ч)х103)
AI Паклитаксел AI Паклитаксел Контроль
ПК 10%ПК ПК 10%ПК ПК 10%ПК ПК 10%ПК
2D 3D 2D 3D 2D 3D 2D 3D
МСФ #728 27,1 79,0 34,2 81,8 93,0 92,1 90,7 85,6 0,5 6,06 0,85 1,23 7,54
МСФ #982 59,6 82,5 75,6 83,2 79,2 73,1 79,8 98,9 3,6 4,97 2,76 3,26 9,16
РМС #862 26,2 84,2 30,3 86,9 92,3 97,6 92,4 98,8 3,58 4,53 2,69 3,87 6,39
ЛМС #699 - - - - 54,1 106,3 66,0 101,9 - - 0,41 0,35 11,8
СС #716 80,5 99,3 99,4 94,8 91,7 92,2 99,1 86,7 1,03 8,75 3,5 7,44 12,7
ОС #793 49,8 102,0 60,9 98,0 66,2 94,6 94,9 104,0 1,51 1,21 1,78 2,07 7,49
ОС #921 88,1 88,9 82,5 90,0 92,5 90,0 89,7 89,1 11,02 12,7 10,79 10,79 13,09
РМЖ #973 - 58,1 - 79,3 - 64,4 - 79,5 1,3 4,69 1,49 1,74 7,64
Цисплатин Паклитаксел Цисплатин Паклитаксел Контроль
ПК 10%ПК ПК 10%ПК ПК 10%ПК ПК 10%ПК
2D 3D 2D 3D 2D 3D 2D 3D
МК #929 92,6 89,6 86,0 90,6 137,0 123,4 98,7 108,3 13,25 13,54 9,12 9,51 13,39
Примечания. А1 — доксорубицин+ифосфамид; ПК — пик концентрации препарата в плазме крови, мкг/мл; 10%ПК — 10% от пика концентрации препарата в плазме крови, мкг/мл; МФС — миксофибросаркома; РМС — рабдомиосаркома; ЛМС — лейомиосаркома; СС — синовиальная саркома; ОС — остеосаркома; РМЖ — рак молочной железы; МК — меланома кожи.
Рис. 1. Монослойные культуры и сфероиды, полученные из фрагментов солидных опухолей пациентов. 1, 2 — культура клеток синовиальной саркомы #716; 3, 4 — культура клеток лейомиосаркомы #699; 5, 6 — культура клеток рабдомиосаркомы #862; 7, 8 — культура клеток миксофибросаркомы #728; 9, 10 — культура клеток миксофибросаркомы #982; 11, 12 — культура клеток остеосаркомы #921; 13, 14 — культура клеток остеосаркомы #793; 15, 16 — культура клеток меланомы кожи #929; 17, 18 — культура клеток рака молочной железы #973. Инвертированный микроскоп, фазовый контраст. Масштабная линейка для монослойных культур — 200 мкм,
для сфероидов — 100 мкм
Были изучены жизнеспособность и инвазив-ные свойства клеток солидных опухолей в 2D-и 3D-системе под действием химиопрепаратов и их комбинаций, применяемых для лечения пациентов. Так как число наблюдений было невелико, использовали индивидуальный анализ каждой культуры. Во всех случаях клетки, культивируемые в виде 2D-монослоя, были менее резистентны к воздействию химиотерпев-тических агентов по сравнению с клетками в тумороидах (табл. 3). Комбинация препаратов доксорубицин+ифорсфамид (А1) и паклитак-сел существенно ингибировали подвижность в
матригеле клеток сфероидов, за исключением остеосаркомы #921 и меланомы #929, на которые препараты практически не оказали воздействия.
Индивидуальный анализ продемонстрировал, что поведение опухолевых клеток, культивируемых в трехмерных системах, воспроизводит реальную клиническую ситуацию, наблюдаемую при терапии пациентов. При этом в 5 случаях из 9 опухолевые клетки, культивируемые в 3D-формате, сохраняли жизнеспособность, но их инвазивные свойства подвергались существенным изменениям.
Рис. 2. Воздействие химиопрепаратов на культуру МФС #728, 44 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, А — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. Общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. Ув. 100
Рис. 3. Воздействие химиопрепаратов на культуру МФС #982, 34 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, А — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. Общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. Ув. 100
Так, клетки МФС #728 и #982 демонстрировали высокий инвазивный потенциал, скорость изменения площади сфероида составила 7,54 и 9,16 (мкм2/ч)*103 соответственно (см. табл. 3). Воздействие комбинации AI или паклитаксела оказало ингибирующее действие на подвижность опухолевых клеток: скорость распространения сфероидов в матригеле при концентрации препаратов 10% ПК составила 6,06 и 4,97; 1,23 и 3,26 (мкм2/ч)*103 соответственно (рис. 2, 3). При этом клетки МФС сохраняли в значительной степени жизнеспособность в сфероидах, в то время как процент живых клеток по отношению к контролю был существенно ниже в монослойных культурах: 2D/3D — 34,2/81,8% и 75,6/83,2% при воздействии 10% ПК комбинации доксорубицин/ ифосфамид, и в случае 10%ПК паклитаксела для культуры #982 — 79,8/98,9%, в то же время клетки культуры #728 сохраняли резистентность к этому препарату в обоих случаях. таким образом, под влиянием паклитаксела, и, в меньшей степени, комбинации препаратов AI, клетки мик-софибросарком #728 и #982 в системе 3D сохраняли жизнеспособность, но частично теряли инвазивные свойства. Наблюдаемая картина коррелировала с клинической картиной заболевания пациентов, у которых на фоне данной терапии наблюдали непродолжительное время стабилизацию заболевания: время до прогрессирования от момента забора опухолевого материала для приготовления клеточной культуры составило 7,2 и 3,3 мес. соответственно (см. табл. 1).
Сходную картину выявили при изучении поведения клеток ЛМС #699 в 2D- и 3D-системах культивирования под воздействием паклитаксе-ла, который был использован для терапии пациента м. Клетки ЛмС в сфероидах сохраняли жизнеспособность, но теряли подвижность под влиянием паклитаксела. На фоне терапии ЛМС пищевода комбинацией гемцитабин+доцетаксел у данного больного наблюдали частичный регресс и, далее, разнонаправленную динамику опухолевых очагов.
При культивировании клеток РМС #862 па-клитаксел почти не влиял на жизнеспособность опухолевых клеток: в присутствии 10% ПК па-клитаксела жизнеспособность образцов моно-слойных культур составила 92,4%, сфероидов — 98,8%. Была обнаружена химиочувствительность опухолевых клеток к комбинации AI: при добавлении 10%ПК данных препаратов наблюдали уменьшение жизнеспособности малигнизирован-ных клеток в тумороидах до 86,9% от контроля.
тумороиды #862 в условиях без воздействия изучаемых химиопрепаратов проявляли значительный инвазивный потенциал: занимаемая площадь тумороида за 48 ч наблюдения увеличивалась почти в 8 раз: с 44*103 мкм2 до
351*103 мкм2 (рис. 4). Инвазивные свойства опухолевых клеток этой культуры были блокированы при культивировании с паклитакселом: при дозе ПК площадь сфероидов увеличивалась с 42*103 мкм2 только до 172*103 мкм2, при культивировании с комбинацией AI — с 44*103 мкм2 до 216*103 мкм2. Данный эффект наблюдали также при дозе 10%ПК. Феномен уменьшения жизнеспособности опухолевых клеток и угнетения их способности к инвазии соотносится с клиническим результатами лечения пациента К, когда на фоне трех линий химиотерапии с включением в схему лечения препаратов эпи-рубицин, паклитаксел и ифосфамид наблюдали частичный регресс опухолевого очага.
Из операционного материала пациента М. с СС, который получил курс комбинированной химиотерапии, включающей схему AI, была получена культура #716. Эксперименты in vitro продемонстрировали, что клетки СС в монослое и сфероидах оказались практически не чувствительными к действию химиопрепаратов: при добавлении паклитаксела жизнеспособность снижалась не более чем на 5%, а при добавлении AI не снижалась. В контроле при культивировании в матригеле наблюдали высокую скорость инвазии: через 48 ч площадь, занимаемая туморои-дом, увеличилась в 12,6 раз: с 52,3*103 мкм2 до 660*103 мкм2 (рис. 5). Минимальное изменение площади сфероида было отмечено при культивировании в среде с ПК комбинации AI: от 40*103 мкм2 до 89,1*103 мкм2 и при добавлении 10% ПК той же комбинации химиопрепаратов: с 63,7*103 мкм2 до 483*103 мкм2. Эффект угнетения инвазивных свойств наблюдали и при добавлении обеих концентраций паклитаксела: за 48 ч площадь тумороида увеличивалась с 59х103 мкм2 до 228х103 мкм2 и с 59х103 мкм2 до 416*103 мкм2, соответственно. Картина, наблюдаемая in vitro, в данном случае коррелирует с ответом на лечение — частичным регрессом злокачественного новообразования.
Снижение жизнеспособности опухолевых клеток почти в два раза под влиянием комбинации AI и паклитаксела в монослойных культурах и отсутствие эффекта в сфероидах наблюдали в случае ОС #793 (рис. 6). При этом происходило ингибирование инвазивных свойств клеток данной культуры. Скорость распространения сфероидов в матригеле уменьшилась с 7,49 до 1,21 и 2,07 (мкм2/ч)*103 при воздействии 10% ПК AI и пакли-таксела, соответственно. Клинически у больной р. отмечали непрерывное прогрессирование опухолевого процесса на фоне проводимого лечения при использовании схем химиотерапии дакарбазин+д оксорубицин+циклофосфамид, цисплатин+цикло фосфамид+винкристин, синдаксел+карбоплатин, ифосфамид+этопозид, гемцитабин+доцетаксел.
рис. 4. Воздействие химиопрепаратов на культуру рМС #862, 45 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, а — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. ув. 100
1 1 U ч[ А • В^яВ Н (J Ф 2 i 2 1SM i«i :4 ч j • Ш \шк 44, # ч t f <*
• # • • • \ш L—----- 1 [« Е Кя л
• • # • • р] •1 ■ •
3
I?
s \ м
М
* о
-t-№ -it
- 3D li^lii
«мш> №vno 1 (МВД)
| ШИ ; ж«
I JOOCOO
IMCW 0
и Л К i*
k|)rv< ч
r ^J S J
- п^н ri. 17
'v.- I
lyJAiClVFff*.» * 44 *лнт/мл\
| \ R^rrwi ■ W M+r^NVl
рис. 5. Воздействие химиопрепаратов на культуру СС #716, 27 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, А — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. ув. 100
А
3
1 • • Ф 44 -1 1 • • 2 Сч. • 13ч: • »и Ф 11Ч1 Ф
г ^ V ^ ( ) О * 1 ч^^н '•е—у Щ Д О
ф • ф\ ¡т Щ Щ О
♦
- ПЛЧ.ЧПЛКС1 * Л 7
- пмлпт* I7Л '
НМД [I + 440
м/тл/ял)
¡|№Лк
рис. 6. Воздействие химиопрепаратов на культуру СС #793, 36 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, А — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. ув. 100
I» 90 ас
60
4
зо 24
ю
5
'аовей
з КРОСС
а вдвд
| 1№Н0
щ ->эо Л №№)
)СООСС
—*—л> 1НМ»
А а
|Р ЦТ
- п М
^ы^д 11 * ■г ■ 440
1ПЧПК
пн
рис. 7. Воздействие химиопрепаратов на культуру СС #921, 10 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием комбинации доксорубицин/ифосфамид; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, а — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. ув. 100
3
3
но
г 1"
о &
5
Ч 1»
81
- •
»---- -—
-•- 20
-•-¡о
■-
-щ—10
А
-г- Пл I 7 10.3
ччг/чл I -Ицмии О Ш/иЩ
Ю*ЛН
ПК
3
И 1] К
1|МШ 4
рис. 8. Воздействие химиопрепаратов на культуру МК #929, 56 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием цисплатина; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, А — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 2D и 3D-системах, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч.
Фазовый контраст. ув. 100
ф ■74 к. ' 2 4 * ф |Щ ф щ'
У Ль » Л 5 \ т Ф # * Ф
# 11 ¿рз* "Н ■ * 1 ■ ЛЬ- г.я Н щ & № '
1<№1Ш
-»-ЮТ (ЮЛ
«■г/ш]
г-нТ1ч<* л 13,' Т Н/ш]
> ¿4 чп/иЛ)
Б
рис. 9. Воздействие химиопрепаратов на культуру рмж #973, 27 пассаж. 1 — изменение площади сфероида под воздействием цисплатина; 2 — изменение площади сфероида под воздействием паклитаксела; 3, а — влияние препаратов на жизнеспособность опухолевых клеток в 3D-системе, 3, Б — цифровое выражение влияния препаратов на инвазию опухолевых клеток. По оси абсцисс — время наблюдения, ч. общее время наблюдения 72 ч. Фазовый контраст. ув. 100
Для культуры ОС #921 МТТ-тест продемонстрировал, что незначительную чувствительность к ПК и 10%ПК комбинации AI проявляют монослойные культуры, тогда как тумороиды оказались нечувствительны к данной комбинации препаратов в этих концентрациях. Отсутствие цитотоксического эффекта наблюдали также при действии паклитаксела (рис. 7).
В контроле сфероиды #921 демонстрировали высокую скорость распространения в матриге-ле: через 48 ч площадь, занимаемая туморои-дом, увеличилась в 7,9 раза: с 91*103 мкм2 до 719*103 мкм2. При этом имело место отсутствие ответа на комбинацию AI и паклитаксел в обеих концентрациях. Инвазивные свойства малигни-зированных клеток под воздействием химиопре-паратов не отличались от свойств контрольной группы. Через 48 ч опухолевые сфероиды занимали всё поле зрения микроскопа, их площадь увеличивалась в 7 раз по сравнению с исходной. таким образом, данная культура продемонстрировала резистентность высокой степени к воздействию исследуемых химиотерапевтических агентов. Клинически у больной Д. отмечали кратковременную стабилизацию опухолевого процесса на фоне терапии комбинацией доксоруб ицин+цисплатин+метотрексат. В дальнейшем — прогрессирование на фоне терапии комбинацией ифосфамид+карбоплатин+этопозид.
Для лечения пациента С. с мК применяли BRAF- и MEK-ингибиторы, ниволумаб, комбинацию паклитаксел+карбоплатин и на фоне лечения наблюдали быстрое прогрессирование заболевания. В рамках нашего исследования культура мК #929, полученная из биологического материала этого больного, была использована как пример опухоли с высокой резистентностью к химиотерапии. Ко всем подобранным комбинациям химиопрепаратов наблюдали in vitro отсутствие ответа малигнизированных клеток, составляющих сфероид (рис. 8). Более того, в присутствии паклитаксела происходила стимуляция пролиферации опухолевых клеток: при ПК и 10%ПК процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю в тумороидах и монослое составил 123,4 и 137%, 108,3 и 98% соответственно. Не наблюдали изменения инва-зивных свойств опухолевых клеток под действием изучаемых химиотерапевтических агентов. В данном случае имела место четкая корреляция отсутствия клинического эффекта на фоне лечения и поведением сфероидов in vitro.
Культура клеток РМЖ #793 была получена из первичной опухоли, при этом заболевание имело крайне агрессивное течение. In vitro данная культура имела полусуспензионный характер роста со склонностью к спонтанному образованию сфероидов, клетки которых обладали чув-
ствительностью к обеим концентрациям пакли-таксела и комбинации AI: наблюдали снижение жизнеспособности опухолевых клеток до 58,1 и 79,3%, 64,4 и 79,5% соответственно (рис. 9).
В контроле при культивировании в матригеле имел место высокий инвазивный потенциал: через 48 ч площадь, занимаемая опухолевым сфероидом, увеличилась в 4,7 раза: с 100*103 мкм2 до 467*103 мкм2 (см. рис. 9). Наблюдали эффект угнетения скорости распространения сфероида при добавлении в среду 10%ПК комбинации AI — 4,69 против 7,64 (мкм2/ч)*103 в контроле. Процесс ингибирования инвазивных свойств тумороидов обнаруживался при культивировании в среде с 10%ПК паклитаксела, в этом случае максимальная площадь сфероида составила 153*103 мкм2. В этом эксперименте химиопрепараты в дозах, соответствующих терапевтическим, in vitro ингибировали пролиферативную активность и инвазивный потенциал клеток РМЖ #973. В то же время клинически наблюдали выраженное прогресси-рование опухолевого процесса непосредственно на фоне проводимой химиотерапии: 1 линия АС (доксорубицин+циклофосфамид); 2 линия ТР (доцетаксел+карбоплатин); 3 линия — эрибулин+капецитабин.
Обсуждение
Химиотерапия, по-прежнему, остается важным методом лечения различных злокачественных новообразований, особенно их метастатических форм. Однако до сих пор нет значительного прогресса в результатах лечения онкологических больных, хотя за последние 50 лет было введено в клиническое использование большое количество химиотерапевтических препаратов. Поскольку злокачественные новообразования представляют собой группу гетерогенных заболеваний, реакция на один и тот же химиотера-певтический агент может быть различна даже у пациентов с опухолями одного гистологического фенотипа, что делает необходимым индивидуальный подход к терапии. Этот подход основан на функциональной биологии опухоли и известен как анализ химиочувствительности опухоли [15]. Для достижения этой цели важно разрабатывать более сложные клеточные модели, которые лучше имитируют физиологические ткани в контексте микроокружения опухоли. Это может быть достигнуто с помощью методов трехмерного культивирования клеток [16].
Недостатком скрининга лекарственных средств с использованием монослойных клеточных моделей является часто наблюдаемое отсутствие корреляции между результатами, полученными в экспериментальных условиях,
и реальными клиническими результатами лечения. Полученные нами тумороиды являются патофизиологически значимыми доклиническими моделями для исследования инвазивных фенотипов опухолей.
В настоящее время опухолевые клеточные трехмерные модели in vitro начали активно применять для прогностической оценки противоопухолевых методов лечения, таких как химиотерапия, радиотерапия, фотодинамическая терапия, генная терапия и иммунотерапия.
Как известно, в реальной клинической ситуации концентрация лекарств, кислорода и питательных веществ уменьшается к центру опухоли. Эффективность лекарственного препарата in vivo во многом зависит от его дозы, фар-мокинетических свойств, молекулярной массы, заряда, растворимости в воде и липидах, диффузии, барьеров в микроокружении, связывания с мишенью, метаболизма и секвестрации. Создавая сфероиды, моделируют физиологические параметры, присутствующие в организме пациента, а именно, сложную многоклеточную архитектуру, барьеры для переноса массы веществ, внутренний градиент питательных веществ, кислорода и метаболитов, что позволяет их использовать in vitro для исследований ци-тотоксичности противоопухолевых препаратов, патофизиологических градиентов и процессов их диффузии. В частности, S.L'Espérance и со-авт. (2008) исследовали химиорезистентность с помощью сфероидов, полученных из шести клеточных линий рака яичника, обработанных 10,0 мкМ цисплатина, 2,5 мкМ паклитаксела или 5,0 мкМ топотекана в течение 72 ч [17]. Они провели профилирование экспрессии ряда генов, связанных с ростом и пролиферацией клеток, со сборкой и организацией цитоске-лета, с гибелью клеток, контролем клеточного цикла и передачей сигналов в клетках, и отметили, что опухолевые клетки в сфероидах быстро приобретают химиорезистентность к препаратам за счёт сверхэкспрессии генов, ответственных за остановку клеточного цикла, а также за репарацию и репликацию ДНК (BRCA1, BRCA2, DDB2, FANCA). При этом подобную сверхэкспрессию генов не наблюдали в монослойных культурах. Согласно мнению многих исследователей сфероиды оказались особенно ценной моделью в исследовании ответа опухолевых клеток на химиотерапию и радиотерапию [18].
T. Puls и соавт. (2018) разработали трёхмерные модели рака поджелудочной железы в совокупности с опухолеассоциированными фибробластами и исследовали инвазивный потенциал клеток в матригеле при добавлении в среду гемцитабина [19]. Авторам удалось
найти эффективную дозу, при которой клетки из опухолевого сфероида не прони кали в окружающий его матригель, а также показать, что гемцитабин не индуцировал гибель опухолевых клеток, а лишь изменял их инвазивные характеристики и ингибировал пролиферацию. В представленном нами исследовании были получены аналогичные результаты при изучении химиочувствительности сфероидов другого происхождения (СМТ/ОС, РМЖ). С помощью мтт-теста при определении чувствительности тумороидов и монослойных культур к химио-препаратам и их комбинациям, которые были использованы в лечении пациентов в клинике, было обнаружено, что в SD-системе опухолевые клетки проявляют устойчивость к противоопухолевым препаратам, тогда как в монослойных культурах наблюдали цитотоксический эффект. Было отмечено, что в среде с химиопрепара-тами сфероиды перестают активно набирать опухолевую массу, но тем не менее клетки не погибают или погибают в незначительном количестве. Это было характерно для культур МСФ, РМС, ЛМС, СС, ОС #79S, РМЖ, но не ОС #921 и МК.
В большинстве случаев мы установили взаимосвязь между клинической эффективностью лекарственной терапии опухолевого заболевания (прогрессирование, стабилизация заболевания, частичный регресс) и эффектом химиотерапевтических агентов in vitro, что позволяет считать тумороиды адекватной предиктивной моделью, дающей возможность индивидуализировать лечебный процесс. В нашем ретроспективном исследовании трехмерная клеточная система оправдала себя в 7 из 9 случаев. При этом интересно отметить, что практически все культуры опухолевых клеток были получены из метастазов, сформировавшихся в результате прогрессирования процесса после проведенного лечения, поэтому расхождение клинических наблюдаемых результатов (кратковременная стабилизация заболевания на фоне проводимой терапии) и экспериментальных результатов in vitro, когда клетки оказались резистентны к выбранным химиопрепаратам, было вполне ожидаемым.
тем не менее мы предполагаем, что первичный скрининг химиотерапевтических препаратов на моделях гомосфероидов, созданных из опухолевых клеток пациентов, может способствовать конкретизации выбираемой тактики лечения, так как почти все исследования инвазивных характеристик опухолевых клеток в трёхмерной системе проводят на постоянных клеточных линиях [20].
Для изучения опухолевого процесса в доклинических исследованиях крайне важно подобрать адекватную модель. Моделирование
in vitro должно предшествовать и дополнять исследования in vivo [21]. Адекватность моделирования злокачественных новообразований in vivo зависит от точности воспроизведения онкологического заболевания, включающего равные гистопатологические особенности перевиваемых образцов, стадийность, физиологические и системные эффекты. Кроме того, ответ организма как системы должен быть максимально достоверным при применении специфического лечения для точного прогноза терапевтической эффективности [22, 23]. Созданные нами тумороиды, воспроизводящие ключевые характеристики опухолевого очага, могут служить доклинической моделью для тестирования противоопухолевых препаратов. В перспективных исследованиях сфероиды/ту-мороиды могут быть использованы в качестве индивидуальной предиктивной тест-системы, оценивающей функциональные характеристики клеток опухоли и иммунной системы больных злокачественными новообразованиями.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии в статье конфликта интересов.
Финансирование
Исследование поддержано грантом РФФИ #18-29-09014 мк.
ilMTEPATyPA
1. Pauli C et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine // Cancer Discov. 2017;7(5):462-477. doi: 10.1158/2159-8290.CD-16-1154
2. Kitaeva KV, Rutland CS, Rizvanov AA, Solovyeva VV. Cell Culture Based in vitro Test Systems for Anticancer Drug Screening // Front Bioeng Biotechnol. 2020;8. doi: 10.3389/fbioe.2020.00322
3. Han SJ, Kwon S, Kim KS. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase // Cancer Cell Int. 2021;21(1). doi: 10.1186/s12935-021-01853-8
4. Pinto C, Estrada MF, Brito C. In Vitro and Ex Vivo Models — The Tumor Microenvironment in a Flask // Adv Exp Med Biol. 2020;1219:431-443.
5. Tsuruno Y Okubo K, Fujiwara T et al. An in vitro model for determining tumor cell migration under metabolic gradients // Adv Exp Med Biol. 2018;1072:201-205.
6. Bhattacharya S, Calar K, De La Puente P. Mimicking tumor hypoxia and tumor-immune interactions employing three-dimensional in vitro models // J Exp Clin Cancer Res. 2020;39(1). doi: 10.1186/s13046-020-01583-1
7. Zanoni M, Pignatta S, Arienti C et al. Anticancer drug discovery using multicellular tumor spheroid models // Expert Opin Drug Discov. 2019;14(3):289-301. doi:10.1 080/17460441.2019.1570129
8. Bassi G, Grimaudo MA, Panseri S, Montesi M. Advanced multi-dimensional cellular models as emerging reality to reproduce In Vitro the human body complexity // Int J Mol Sci. 2021;22(3):1-28. doi: 10.3390/ijms22031195
9. Kuen J, Darowski D, Kluge T, Majety M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model // PLoS One. 2017; 12(7). doi: 10.1371/ journal.pone.0182039
10. Liu X et al. A novel simpledrop chip for 3d spheroid formation and anti-cancer drug assay // Micromachines. 2021;12(6). doi: 10.3390/mi12060681
11. Freshney RI. Culture of Animal Cells. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2010.
12. Danilov AO et al. An improved procedure for autologous gene-modified vaccine preparation for active specific immunotherapy of disseminated solid tumors // Vopr. Onkol. 2004.
13. Salmon SE. Cloning of Human tumor stem cells: background and overview // Prog. Clin. Biol. Res. 1980;48:3-13.
14. Everitt BS, Pickles A. Statistical Aspects of the Design and Analysis of Clinical Trials. PUBLISHED BY IMPERIAL COLLEGE PRESS AND DISTRIBUTED BY WORLD SCIENTIFIC PUBLISHING CO., 2004.
15. Ulukaya E, Karakas D, Dimas K. Tumor chemosensitivity assays are helpful for personalized Cytotoxic treatments in cancer patients // Medicina (Kaunas). 2021;57(6). doi: 10.3390/medicina57060636
16. Cui X, Hartanto Y Zhang H. Advances in multicellular spheroids formation // J R Soc Interface. 2017;14(127). doi: 10.1098/rsif.2016.0877
17. S. L'Espérance SL, M. Bachvarova M, B. Tetu B et al. Global gene expression analysis of early response to chemotherapy treatment in ovarian cancer spheroids // BMC Genomics. 2008;9. doi: 10.1186/1471-21649-99
18. F. Hirschhaeuser F, H. Menne H, C Dittfeld C et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again // J. Biotechnol. 2010;148(1):3-15. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.01.012
19. Puls TJ, Tan X, Husain M et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening // Sci. Rep. 2018;8(1). doi:10.1038/s41598-018-31138-6
20. Jensen C, Teng Y Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture? // Front Mol Biosci. 2010;7. doi:10.3389/fmolb.2020.00033
21. Rebecca VW, Somasundaram R, Herlyn M. Pre-clinical modeling of cutaneous melanoma // Nat Commun. 2020;11(1). doi:10.1038/s41467-020-15546-9
22. Pabiarzhyn VV, Pashinskaya ES, Semenov VM, Hancharou AY Methodological aspects of setting up oncological models under experimental conditions // Vestn. Vitebsk State Med. Univ. 2018;17(6):32-45. doi: 10.22263/23124156.2018.6.32
23. Gilazieva Z, Ponomarev A, Rutland C et al. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine // Cancers. 2020;12(10):1-19. doi: 10.3390/cancers12102727
Поступила в редакцию 1S.09.2021 г.
A.B. Danilova, T.L. Nehkaeva, N.A. Efremova, A.V Novik, A.U.Zozula, G.I. Gafton, I.A. Baldueva
Assessment of the effectiveness of the use of tumoroids for personalized drug therapies for solid tumors
N.N. Petrov National Medicine Research Center of oncology, St Petersburg, Russia
The approach to the management of malignant tumors, which aims to define the effective curative strategies in each patient, defines the requirement for the elaboration and use of modelling systems that replicate the structures and the biology of human solitary tumors. Three-dimensional cultures of spheroids/tumoroids, which are multi-cell aggregates of malig-nized cells, can create the intercellular connections of interest, gradients of the nutrients and oxygen, and cell polarity, all of which are absent in the conventional two-dimensional single-layer system.
The present work is dedicated to a comparison study of in vitro viability and invasiveness of solid tumor cells of patients under the effect of chemopreparations and their combinations in view of evaluating the efficacy of the 3D-cell modelling system in the translational personalized medicine context.
Cell cultures of patients who were treated at the N.N. Petrov National Medicine Research Center (NMRC) of oncology were used as a basis for the development of 3D-cell models. N.N. Petrov NMRC in 2015-2021. Tumor tissue pieces were acquired intraoperatively: 1 — leiomyosarcoma (LMS),
1 — rhabdomyosarcoma (RMS), 1 — synovial sarcoma (SS),
2 — myxofibrosarcoma (MFS), 2 — osteogenic sarcoma (OS), 1 — skin melanoma (MC), 1 — breast cancer (BC) (n=9).
Our individual comparison of the effectiveness of in vitro chemotherapeutic agents against tumor cells of various origins cultivated in 2D and 3D-model systems with real clinically relevant cases confirmed that the monolayer culture as the test system was less adequate for selecting and personalizing the treatment of malignant tumor patients: the 3D cell system proved itself in 77.7% of cases, and the monolayer culture — in 44.4% of cases. The combination of doxorubicin/iforsfamide and paclitaxel significantly suppressed the motility in the matrigel of spheroid cells, but did not affect tumor cell viability, which was seen in all but OS #921 and MK #929 cases.
The cultivation of tumor cells in form of spheroids/tumor-oids allows to utilize them as more adequate pre-clinical model as individual predictive test-system, enabling the personalized selection of therapy.
Key words: malignant tumors, spheroids, tumoroids, che-moresistance, doxorubicin, isophosphamide, paclitaxel
