CC BY
0
УДК 615.273.52
DOI 10.31684/25418475-2023-3-36
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕМОСТАТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТРОМБИНА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ «IN VIVO» И «IN VITRO»
:ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, г. Москва
125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4
2Алтайский филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, г. Барнаул
656024, Алтайский край, г. Барнаул, ул. Ляпидевского, 1
3Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова, г. Москва
127473, Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1
Кабак В.А.1, Белозерская Г.Г.1, Момот А.П.2, Неведрова О.Е.1, Логвинова Ю.С.1, Калелова А.В.1, Акопян Л.В.3
Резюме
Проведение оценки гемостатического действия тромбина в монокомпонентных лекарственных формах и в составе комбинированных покрытий на основе природного полимера - бактериальной целлюлозы, явилось для нас важным этапом в разработке новых гемостатических средств локального действия. Были проведены исследования «in vivo» и «in vitro» препарата тромбина в формах порошка и раствора в различных дозах (150, 375, 750 и 1500 ед. NIH), а также покрытий на основе бактериальной целлюлозы с введением в их структуру тромбина. Установлено, что все проанализированные монокомпонентные порошковые составы тромбина обладают высокими гемостатическими свойствами. Увеличение дозировки тромбина, начиная от 375 ед. NIH - в 2 и 4 раза, не приводило к значительному повышению гемостатической активности, а ге-мостатический эффект растворов был ниже, чем порошков с аналогичным содержанием данного фермента. Введение в структуру покрытий тромбина статистически значимо не повышает их гемостатическую активность, однако, на основании данных, полученных в экспериментах «in vitro», вызывает гиперкоагуля-ционный сдвиг.
Ключевые слова: гемостатическая активность, тромбин, бактериальная целлюлоза, кровотечение.
EVALUATION OF THE EFFECTIVENESS OF THE HEMOSTATIC ACTION OF THROMBIN IN EXPERIMENTS «IN VIVO» AND «IN VITRO»
1National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia 125167, Moscow, Novy Zykovsky Proezd, 4
2Altai Branch of the National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia, Barnaul, Russia
656024, Altai Krai, Barnaul, Lyapidevskogo Str., 1
3Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Moscow, Russia 127473, Moscow, Delegatskaya Str., 20, bld. 1
Kabak V.A.1, Belozerskaya G.G.1, Momot A.P.2, Nevedrova O.E.1, Logvinova Yu.S.1, Kalelova A.V.1, Akopyan L.V.3
Abstract
Evaluation of the hemostatic effect of thrombin formulated in monocomponent dosage forms and combined coatings based on a natural polymer, bacterial cellulose, was an important stage for us in the development of new local hemostatic agents. In vivo and in vitro studies of thrombin preparation in powder and solution forms in various doses (150, 375, 750, and 1500 NIH units), as well as coatings based on bacterial cellulose and thrombin administered into their structure, were conducted. All monocomponent powder formulations of thrombin analyzed were found to have high hemostatic properties. Increasing the dosage of thrombin 2 and 4 times, starting with 375 NIH units, did not lead to a significantly increased hemostatic activity, and the hemostatic effect of the solutions was less than that of powders with a similar level of this enzyme. Thrombin administered to the structure of the coatings does not significantly increase their hemostatic activity; however, it causes a hypercoagulation change according to the findings of in vitro experiments.
Keywords: hemostatic activity, thrombin, bacterial cellulose, bleeding.
Введение около 5,0 млн человек во всем мире умирают
Согласно данным, опубликованным в Jour- от травматических и нетравматических кро-
nal of Emergency Medicine (JEMS), ежегодно вотечений [1]. Для их остановки используются
различные методы, но наиболее щадящим является применение гемостатических средств локального действия в различных лекарственных формах. Одним из наиболее действенных локальных гемостатиков является тромбин. Последний представляет собой фермент, который выступает ключевым фактором свертывания крови, и, кроме непосредственного участия в фибринообразовании, активирует тромбоциты. Из-за опасности возникновения тромбоза, тромбин применяется только местно - в виде раствора или порошка. Порошковая форма тромбина является эффективным локальным гемостатическим средством для остановки капиллярно-паренхиматозных кровотечений (при черепно-мозговых травмах, операциях на внутренних органах, кровотечениях из костных пазух, желудочно-кишечного тракта, дёсен) [2]. В современной медицине используют бычий, человеческий и рекомбинантный тромбин. К недостаткам первого из них относится прежде всего высокая вероятность образования антитром-биновых антител [3]. Рекомбинантный тромбин имеет последовательность белка, идентичную естественной аминокислотной последовательности человека, что ограничивает риск иммуно-генности [4, 5], но стоимость его довольно велика, что делает его малодоступным. Препараты на основе человеческого тромбина, получаемого из плазмы крови, в отличие от препаратов на основе бычьего, имеют более низкий риск возникновения иммунных реакций. Тромбин применяется не только в качестве монокомпонентного гемостатика, но и как активная добавка в комбинированных препаратах [6-9]. Кроме того, можно отметить, что число исследований гемоста-тических свойств раневых покрытий на основе полимеров, в том числе и с внесением активных добавок, в последнее время резко возросло [10, 11]. Признается, что одним из наиболее перспективных для применения в медицине полимеров является бактериальная целлюлоза (БЦ). К ее уникальным свойствам относятся высокая прочность, кристалличность, биосовместимость, био-разлагаемость, пластичность, позволяют использовать ее в качестве основы для создания новых гемостатических покрытий [12-14]. В настоящее время нехватка недорогих и надежных кровоостанавливающих препаратов является проблемой для отечественной медицины. Поэтому создание современных импортонезависимых монокомпонентных и комбинированных гемо-статических средств локального действия представляется весьма актуальной задачей.
Цель исследования
Оценка эффективности гемостатического действия тромбина человека в различных фармакологических формах в остром эксперименте на животных «in vivo» и исследованиях «in vitro».
Материал и методы
В качестве исследуемых образцов использовали порошок тромбина человека, предоставленный ООО фирма «Технология Стандарт», г. Бар-
наул (патент на изобретение РФ № 2457248). Монокомпонентные порошки и растворы на основе тромбина были исследованы в различных дозах (150, 375, 750 и 1500 ед. NIH).
Для более детального исследования кровоостанавливающих свойств препарата тромбина использовалось несколько способов его нанесения на экспериментальную раневую поверхность: 1) монокомпонентный порошок тромбина помещался непосредственно на рану; 2) порошок тромбина наносился на рану и фиксировался на ней при помощи марлевого тампона (МТ) и 3) на раневую поверхность прикладывался МТ, пропитанный 2,0 мл раствора тромбина (активностью 75, 187,5, 375 и 750 ед. NIH/мл) в дистиллированной воде.
Образцы покрытий в форме губки на полимерной основе получали по специальной техно-логии1 из гель-пластин БЦ, культивированной в ИПХЭТ СО РАН (г. Бийск), в опытно-производственном отделе глубокой переработки плазмы ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, г. Москва. Образцы покрытий на основе БЦ с тромбином получали путем спонтанного пропитывания гель-пластин размером 0,5x0,5x0,4 см раствором тромбина, активностью 3,75 ед. NIH/мл.
Для исследований «in vivo» покрытия нарезали на части стандартной формы (цилиндр), поэтому объём каждого образца вычисляли по формуле 1:
V0 = nr02d0
CD,
где r0, см — радиус верхней/нижней грани цилиндра (1,25 см); d0, см — толщина цилиндра, измеряемая при помощи цифрового лабораторного штангенциркуля CD-15CPX (Mitutoyo Corp, Япония).
Экспериментальная часть работы по оценке местной гемостатической эффективности исследуемых образцов «in vivo» проводилась на 23 кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 3,0-4,5 кг со средним значением темпа кровотечения 1,0 г/мин согласно методике, описанной в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть первая. М.: Гриф иК, 2012 [15]. Эксперимент выполнялся с введения животного в состояние тиопенталового наркоза. Затем выполнялась тотальная срединная лапа-ротомия, в образовавшуюся рану выводилась передняя поверхность печени. При помощи пластмассового ограничителя производилась резекция лезвием выступившей части печени. В результате образовывалась равномерно кровоточащая рана. В каждом опыте размер и форма срезанного сегмента оставались неизменными. Для сравнительной оценки гемостатических свойств исследуемого образца и контроля на доле печени одновременно производились два вышеописанных среза. В качестве контроля использовался МТ. Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путём нанесения на рану того или иного исследуемого образца. При этом контрольный МТ и образец
1 Савченко В.Г., Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Неведрова О.Е., Бычичко Д.Ю. и др. Раневое покрытие, обладающее гемостатическим действием, и способ его получения. Патент РФ № 2624242 С1. 2016.
полностью покрывали раневую поверхность. Эксперимент завершался внутривенным введением троекратной дозы тиопентала натрия, что обеспечивало гуманную эвтаназию животного.
Время остановки кровотечения (т) определялось при помощи секундомера.
Оценка объёма кровопотери (P) основывалась на измерении гравиметрическим методом массы истечённой крови из раны. Для облегчения пересчёта массы в объём было принято допущение, что плотность крови составляет 1,0 г/ мл. Исследуемый образец, предварительно взвешенный на аналитических лабораторных весах с приборной погрешностью ±0,1 мг, равномерно наносился на всю площадь раневой поверхности. Пропитанный кровью образец снимался с раны и повторно взвешивался после остановки кровотечения. Объём кровопотери (P) определялся по формуле 2:
где Мо — первоначальная масса исследуемого образца (г), Мк — масса образца с кровью (г), р — плотность крови.
Основным критерием эффективности образцов в форме губки в экспериментах in vivo была принята гемостатическая активность (ГА). ГА по времени остановки кровотечения (ВОК) и объёму кровопотери для контрольного МТ составляла 0%.
ГА экспериментальных образцов по ВОК (ГА(/ %) определяли по формуле 3:
хюо% (3),
где с — ВОК при наложении образца; с — ВОК при наложении МТ. ГА по объёму кровопотери (ГАу %) определяли по формуле 4:
V? ,
X 100 % (4),
ГАУ =
где У2, мл — объём кровопотери при наложении образца; мл — объём кровопотери при наложении МТ.
ГА определяли, как среднее арифметическое значение между ГА по ВОК и по объёму кровопотери (формула 5):
В связи с различной анатомической локализацией контрольных и опытных участков ге-моррагий могли возникнуть существенные отклонения в значениях измеряемых параметров. Но постоянная смена положения наносимых срезов позволяла в значительной степени нивелировать эти отклонения.
Для проведения исследований «in vitro» были использованы разработанные нами ранее технологии2,3. С целью исключения структур-
ных повреждений губки и активных компонентов исследуемые образцы покрытий получали непосредственно в микропробирках типа Еп-пендорф, 1,5 мл (МиниМед, Россия). Для создания таких образцов использовали в качестве основы гель-пластины БЦ размером 0,5x0,5x0,4 см, которые помещали непосредственно в микропробирки. Тромбин вводился в структуру образцов путем их спонтанного пропитывания используемым раствором данного фермента. В результате получали образцы, идентичные по структуре покрытиям, используемым в экспериментах «in vivo».
Сравнение гемостатических параметров крови после контакта с материалом покрытия во всех тестах «in vitro» проводилось с аналогичными параметрами крови, не контактировавшей с покрытием, но подвергшейся циркуляцион-но-вибрационному воздействию (контроль). Последнее проводилось воздействием на кровь, осуществляемым с помощью шейкера «Вортекс MSV-3500» (фирмы «Biosan») на платформе SV/8 в произвольно выбранном непрерывном режиме (1200 об/мин с амплитудой 4 мм, в течение 1 мин).
Анализ результатов тестов при исследованиях «in vitro» включал в себя: подсчёт количества тромбоцитов в крови с помощью гематологического анализатора MEK-7222 J/K (Nihon Kohden, Япония); определение концентрации фибриногена в плазме крови по Clauss набором реагентов Тех-Фибриноген-тест (ООО фирма «Технология-Стандарт», Россия) на автоматическом коагулометре Sysmex CA-1500 (Sysmex Corporation, Япония); интегральную оценку системы гемостаза по параметрам тромбоэласто-метрии (ТЭМ), а также теста генерации тромбина (ТГТ).
ТЭМ проводили в кюветах со стабилизированной цитратом натрия кровью с применением 4-канального тромбоэластометра Rotem Gamma (Tem Innovations GmbH, Германия) и реагента star-TEM (Pentapharm GmbH, Германия), в режиме Natem. Определяемые в эксперименте параметры (здесь и далее по тексту): CT, с — время для достижения амплитуды в 2,0 мм (активация факторов свёртывания крови); угол а, град — скорость образования сгустков фибрина; MCF, мм — максимальная амплитуда (максимальная плотность сгустка); CFT, с — время от амплитуды в 2,0 до 20 мм (время превращения фибриногена в фибрин); А10, мм — амплитуда (плотность сгустка) на 10 мин. Для выполнения ТГТ использовался планшетный флюориметр Fluoroskan Ascent (ThermoFisher SCIENTIFIC, США), оснащённый диспенсером, с программным обеспечением Thrombinoscope 3.0.0.26 (Thrombinoscope BV, Нидерланды). Коагуляцию исследуемой плазмы крови осуществляли в присутствии 5 пмоль тканевого фактора и 4 мкмоль фосфолипидов (набор реагентов: PPP-Reagent 5 pM, Thrombin Calibrator, FluCa-Kit того же производителя). Генерацию тром-
2 Белозерская Г.Г., Кабак В.А., Голубев, Е.М., Широкова Т.И., Момот А.П., Белозеров Д.Е. и др. Тест-система для проведения исследований гемостатических свойств локальных раневых покрытий in vitro. Патент РФ № 2695075. 2019.
3 Белозерская Г.Г., Кабак В.А., Голубев Е.М., Широкова Т.И., Момот А.П., Белозеров Д.Е. и др. Способ получения искусственных губок в микропробирках для проведения лабораторных исследований in vitro. Патент РФ № 2701195. 2019. 38
бина в бедной тромбоцитами плазме крови регистрировали по измерению сигнала флуо-рогенного субстрата (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). Исследовали следующие параметры ТГТ (здесь и далее по тексту): Lagtime, мин — время запаздывания (начало образования тромбина, в количестве, достаточном для образования первых нитей фибрина); ETP, нмоль/мин — эндогенный тромбиновый потенциал (площадь под кривой генерации тромбина, учитывающая особенности инактивации этого фермента); Peak Thrombin, нмоль/л — максимальная концентрация тромбина; ttPeak, мин — время достижения максимальной концентрации тромбина [16].
Статистическая обработка данных
Для анализа полученных результатов, поиска зависимостей, построения диаграмм использовали программное обеспечение Excel 2010, версия 14.0.7248.5000, Microsoft Office стандартный 2010 (Microsoft Corporation, США). Все расчеты проводили в соответствии с методами вариационной статистики, используя параме-
трический t-критерий (критерий Стьюдента), а также применяли U-критерий (критерий Манна-Уитни) для остальных выборок. Проверка гипотезы о нормальном распределении осуществлялась при использовании критериев Д'Агностино-Пирсона, Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова (для малых выборок). Различия между сравниваемыми величинами считали достоверными при уровнях значимости p < 0,05. Полученные результаты представлены в таблицах и графиках в формате M ± а (где M - среднее арифметическое из результатов отдельных измерений каждого параметра, а -стандартное квадратичное отклонение), доверительных интервалов и числа экспериментов. Все измерения проводили в 6 повторах (n=6).
Результаты
На начальном этапе работы проводили исследования ГА монокомпонентного порошка тромбина «in vivo», взятого в различных дозах (150, 375, 750 и 1500 ед. NIH). Результаты представлены в таблице 1.
Таблица1
Сравнительная оценка локальной ГА монокомпонентного порошка тромбина в различных дозировках и способах нанесения на раневую поверхность при дозированной травме
№ п/п Описание образца Дозировка тромбина ед. NIH т, с P, мл ГА, %
1 Порошок тромбина 150 Смывается кровотоком
2 Порошок тромбина 375 Смывается кровотоком
3 Порошок тромбина 750 Смывается кровотоком
4 Порошок тромбина 1500 Смывается кровотоком
5 Порошок тромбина с прижатием МТ 150 80,1±9,2* 0,71±0,06* 67,3±2,9
6 Порошок тромбина с прижатием МТ 375 29,7±3,5* 0,49±0,07* 77,4±4,7
7 Порошок тромбина с прижатием МТ 750 21,9±3,7* 0,32±0,04* 85,3±3,7
8 Порошок тромбина с прижатием МТ 1500 19,1±2,9* 0,28±0,03* 87,1±2,5
9 МТ, пропитанный 2,0 мл раствора тромбина 75/мл 139,2±12,3* 1,57±0,11* 27,7±3,0
10 МТ, пропитанный 2,0 мл раствора тромбина 187,5/мл 84,6±7,7* 1,12±0,07* 48,4±5,4
11 МТ, пропитанный 2,0 мл раствора тромбина 375/мл 57,3±4,5* 0,76±0,08* 65,0±4,1
12 МТ, пропитанный 2,0 мл раствора тромбина 750/мл 43,2±4,4* 0,64±0,03* 70,5±3,4
13 Контроль, с использованием лишь МТ - 240,1±16,1 2,17±0,09 0,0±0,0
Примечание: * — различия статистически значимы по отношению к контрольным данным при р < 0,05, п=6. Условные обозначения: МТ — марлевый тампон; ед. ЫГН — единицы активности тромбина, установленные департаментом здравоохранения США; т — время остановки кровотечения; Р — объём кровопотери; ГА — гемостатическая активность.
Установлено, что все проанализированные монокомпонентные порошковые составы тромбина обладают высокими гемостатическими
свойствами. Увеличение дозировки тромбина, начиная от 375 ед. №Н - в 2 и 4 раза, не приводило к значительному повышению гемостати-
ческой активности, а гемостатический эффект растворов был ниже, чем порошков с аналогичным содержанием данного фермента в печени в экспериментах «in vivo».
После помещения порошка тромбина непосредственно на раневую поверхность было установлено, что данный препарат вне зависимости от дозировки смывался с раневой поверхности током крови в первые секунды его нанесения и фермент не успевал проявить свою гемостатическую активность. Однако в случае принудительной фиксации порошка тромбина к раневой поверхности при помощи МТ гемо-статический эффект присутствовал и зависел от дозы используемого тромбина. Максимальная ГА была зафиксирована у тромбина, применяе-
мого в дозах 750 и 1500 ед. №Н. Следовательно, фиксация порошка МТ к раневой поверхности позволяла тромбину весьма эффективно сдерживать раневое кровотечение.
Гемостатический эффект МТ, содержащего в себе раствор тромбина, был заметно менее значим. ГА при максимально используемой дозе тромбина в растворе (1500 ед. №Н или 750 ед. №Н/мл) и при фиксации на раневой поверхности 150 ед. №Н тромбина в форме порошка практически совпадали по значениям (70,5±3,4 и 67,3±2,9 %, соответственно).
Сравнение ГА порошков тромбина, нанесенных на МТ, и ГА растворов тромбина с пропитыванием МТ показано на рисунках 1 и 2.
Рисунок 1. Сравнительный анализ ГА порошков тромбина различной активности, нанесенных на МТ. Здесь, а также на рисунках 2 и 3 обозначения: * - различия статистически значимы
Рисунок 2. Сравнительный анализ ГА растворов тромбина (в объеме 2,0 мл) различной активности с пропитыванием МТ
Таким образом, при сравнительном анализе ГА порошков тромбина, нанесенных на МТ, и растворов тромбина с пропиткой МТ было определено, что ГА всех образцов порошков статистически достоверно была выше ГА растворов с той же активностью коагуляционно активного фермента.
Следующей задачей настоящего исследования было изучение гемостатических свойств комби-
нированных полимерных покрытий с введением и без него в их структуру тромбина. В рамках этой задачи было проведено сравнение ГА влажных гель-пластин БЦ (контроль) и покрытий в форме губки на основе чистой БЦ, а также с введением в ее структуру тромбина. Полученные результаты представлены на рисунке 3.
100
so
60
40
20
-20
Гелевая пластина БЦ
Губка на основе чистой БЦ
Губка на основе БЦ с тромбином
Рисунок 3. Сравнительная оценка ГА разных препаратов бактериальной целлюлозы
Определено, что гидратированная гель-пластина БЦ имела низкую ГА (8,6±15,2%), «плавала» на раневой поверхности и не фиксировалась в области раны. В отличие от этого губки на основе как чистой БЦ, так и с введением в ее структуру тромбина, имели в 8,6-9,3 более высокую ГА (73,6±6,6% и 80,4+9,1%, соответственно) и хорошо адгезировали к раневой поверхности. Введение в структуру губки тромбина статистически значимо не повышало ГА, однако была отмечена тенденция к ее увеличению.
Для оценки влияния образцов покрытий в форме губки на параметры системы гемостаза были проведены две серии отдельных экспериментов «in vitro». Для этого гель-пластины были помещены в микропробирки и лиофиль-но высушены. Результаты соответствующих исследований, по данным статистического анализа 5 повторных определений представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Оценка параметров системы гемостаза после взаимодействия образцов губок с кровью «in vitro»
Наименование исследования Контроль Покрытие на основе чистой БЦ
Оценка основных Тромбоциты, х109/л 165,3±5,3 153,8±6,2*
субстратов гемокоагуляции Фибриноген, г/л 2,30±0,14 2,35±0,14
CT, с 755,2±154,2 772,8±145,5
угол а, град 40,0±4,7 38,0±6,3
Тромбоэластометрия MCF, мм 45,6±2,6 45,6±4,4
CFT, с 328,2±54,9 355,2±78,6
A10, мм 31,4±2,9 30,6±4,4
Lagtime, мин 3,33±0,00 3,44±0,46
Измерение интенсивности ETP, нмоль/мин 1371,3±235,0 1415,2±267,6
генерации тромбина Peak Thrombin, нмоль/л 142,6±35,9 160,8±34,0
ttPeak, мин 8,74±0,79 8,85±0,84
Примечание: * - статистически значимо по отношению к контролю
Результаты исследований показали, что взаимодействие образцов покрытий на основе чистой БЦ с кровью практически не повлияло на показатели ТЭМ и ТГТ, но привело к уме-
ренному (на 7,0%), статистически значимому снижению числа тромбоцитов в крови. Показатели интегральных тестов также не выявили каких-либо сдвигов.
Таблица 3
Оценка параметров системы гемостаза после взаимодействия образцов губок с кровью «in vitro»
Наименование исследования Контроль Покрытие на основе БЦ с добавлением тромбина
Оценка основных Тромбоциты, х109/л 157,3±16,1 154,6±12,4
субстратов гемокоагуляции Фибриноген, г/л 2,30±0,28 2,43±0,23
CT, с 816,3±152,6 614,8±152,9
угол а, град 38,8±4,5 55,8±10,9*
Тромбоэластометрия MCF, мм 42,7±4,5 53,5±9,4
CFT, с 348,3±58,30 194,8±78,0*
A10, мм 29,7±3,2 41,0±13,0
Lagtime, мин 4,36±0,37 4,09±0,36
Измерение ETP, нмоль/мин 1467,1±250,1 1604,9±298,4
интенсивности генерации тромбина Peak Thrombin, нмоль/л 189,0±39,6 203,2±42,0
ttPeak, мин 9,27±0,54 9,17±1,07
Примечание: * - статистически значимо по отношению к контролю
Контакт с кровью покрытий на основе БЦ, содержащей тромбин, в свою очередь, не отразился на содержании как тромбоцитов, так и фибриногена, что, на наш взгляд, является отдельным, нуждающимся в исследовании событием. Однако при проведении тромбоэласто-метрии в этом случае отмечено сокращение в 1,8 раза времени формирования сгустка (по показателю CFT), увеличение скорости образования сгустка фибрина по углу а - на 43,8% и нарастание амплитуды (плотности сгустка) на 38,1% по показателю А10.
При сравнении результатов, полученных в ходе изучения обоих образцов губок найдено, что при всем сходстве эффектов их влияния на гемостаз при тромбоэластометрии губка с тромбином показала статистически значимое более раннее образование фибрина в крови (по показателю CFT) и более высокие плотностные характеристики сгустка (по углу а).
Обсуждение
В экспериментах «in vivo» было установлено, что все монокомпонентные порошки тромбина обладали высокой ГА. Усиление активности тромбина, начиная от 375 ед. NIH в 2 и 4 раза, не приводило к значительному повышению ГА. С другой стороны, гемостатический эффект растворов был ниже, чем порошков с аналогичной активностью тромбина. При исследовании ГА гель-пластин и покрытий на основе БЦ было выяснено, что первые практически не обладают гемостатическим эффектом, а при переводе их в форму губки гемостатическая активность резко возрастает. В работе установлено, что введение в структуру покрытий тромбина статистически значимо не повышает их гемостатиче-скую активность, но прослеживается тенденция к ее увеличению. Снижение числа тромбоцитов 42
и усиление процессов фибринообразования исследованных образцов «in vitro» указывает на то, что тромбин, введенный в состав бактериальной целлюлозы, формирует особую агломерацию, направленную на максимальное уменьшение кровопотери при дозированной травме печени. При этом, данное воздействие оказывает малое воздействие на окружающую кровь.
Заключение
Оценка эффективности гемостатическо-го действия монокомпонентных порошков и растворов тромбина показала, что значительное повышение его активности незначительно влияет на изменение гемостатической активности, а в связи с высокой стоимостью тромбина применение его в больших дозах нерационально. Комплексный анализ гемостатических свойств комбинированных с тромбином раневых покрытий на полимерной основе «in vivo» и «in vitro» позволит выбрать пути к наиболее эффективным и экономически выгодным композициям в рамках продолжения разработки современных, эффективных импортонезависи-мых гемостатических средств.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы
1. Thrombin Market Size, Share and Industry Analysis By Product (Bovine Thrombin, Human Thrombin, Recombinant Thrombin), By Dosage Form (Powder Form, Solution Form), By End user (Hospitals, Diagnostics Centers & Clinics, Academics and Research Institutes) [Internet]. (Accessed 12/01/2023). Available from: https://www. fortunebusinessinsights.com/industry-reports/ thrombin-market-100170
2. Lu Y., Chen Y.-I., Barkun A. Endoscopic Management of Acute Peptic Ulcer Bleeding. Gastroenterol Clin North Am. 2014;43(4):677-705. https://doi. org/10.1016/j.gtc.2014.08.003
3. Петлах В.И. Результаты применения местных гемостатиков в медицине катастроф. Медицина катастроф. 2014;4(88):21-4.
4. Huls C.K. Cesarean Hysterectomy and Uterine-Preserving Alternatives. Obstet Gynecol Clin North Am. 2016;43(3):517-38. https://doi. org/10.1016/j.ogc.2016.04.010
5. Singla N.K., Gasparis A.P., Ballard J.L., Baron J.M., Butine M.D., Pribble J.P., et al. Immunogenic-ity and Safety of Re-Exposure to Recombinant Human Thrombin in Surgical Hemostasis. J Am Coll Surg. 2011;213(6):722-7. https://doi.org/10.1016/]. jamcollsurg.2011.08.019
6. Shigeta K., Matsumoto K., Abe T., Komatsuda A., Takeda T., Mizuno R., et al. The efficacy of the TachoSil binding suturing technique in laparoscopic partial nephrectomy to prevent the development of pseudoaneurysm. Asian J Surg. 2020;43(6):668-75.
7. Hateichristodoulou G. Evolution of the surgical sealing patch TachoSil® in Peyronie's disease reconstructive surgery: technique and contemporary literature review. World J Urol. 2020;38(2):315-21. https://doi.org/10.1016/j.asjsur.2019.09.002
8. Виноградов В.В., Алексеев Д.Е., Свистов Д.В. Исследование адгезивных свойств гемо-статической пластины "Тахокомб" при использовании с протезами твердой оболочки головного мозга. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2021;23(4):195-202. https:// doi.org/10.17816/brmma63800
9. Липатов В.А., Северинов Д.А., Саакян А.Р. Локальные гемостатики в хирургии XXI века (обзор литературы). Научный электронный журнал Innova. 2019;1(14):16-22. https://doi. org/10.21626/innova/2019.1/03
10. Khan A., Alamry K.A., Asiri A.M. Multifunctional Biopolymers-Based Composite Materials for Biomedical Applications: A Systematic Review. ChemistrySelect. 2021;6(2):154-76. https://doi. org/10.1002/slct.202003978
11. Arlov 0., Rutsche D., Asadi Korayem M., Ozturk E., Zenobi-Wong M. Engineered sulfated polysaccharides for biomedical applications. Adv Funct Mater. 2021;31(19):Article ID 2010732. https:// doi.org/10.1002/adfm.202010732
12. Bian J., Bao L., Gao X., Wen X., Zhang Q., Huang J., et al. Bacteria-engineered porous sponge for hemostasis and vascularization. J Nanobio-technology. 2022;20(1):47. https://doi.org/10.1186/ s12951-022-01254-7
13. Сакович Г.В., Скиба Е.А., Гладышева Е.К., Будаева В.В., Алешина Л.А. Химические аспекты бактериальной наноцеллюлозы. Журнал сибирского федерального университета серия: химия. 2018;11(4):531-42. https://doi.org/10.17516/1998-2836-0097
14. Swingler S., Gupta A., Gibson H., Kowalczuk M., Heaselgrave W., Radecka I. Recent Advances and Applications of Bacterial Cellulose in Biomed-icine. Polymers (Basel). 2021;13(3):412. https://doi. org/10.17516/1998-2836-0097
15. Миронов А.Н., (ред.) Руководство по проведению доклинических исследований лекар-
ственных средств. Часть первая. Москва, Россия: Гриф и К; 2012.
16. Hemker H.C., Giesen P., Al Dieri R., Reg-nault V., de Smedt E., Wagenvoord R., et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysi-ol Haemost Thromb. 2003;33(1):4-15. https://doi. org/10.1159/000071636
References
1. Thrombin Market Size, Share and Industry Analysis By Product (Bovine Thrombin, Human Thrombin, Recombinant Thrombin), By Dosage Form (Powder Form, Solution Form), By End user (Hospitals, Diagnostics Centers & Clinics, Academics and Research Institutes) [Internet]. (accessed 12/01/2023). Available from: https://www. fortunebusinessinsights.com/industry-reports/ thrombin-market-100170
2. Lu Y., Chen Y.-I., Barkun A. Endoscopic Management of Acute Peptic Ulcer Bleeding. Gastroenterol Clin North Am. 2014;43(4):677-705. https://doi. org/10.1016/j.gtc.2014.08.003
3. Petlakh V.I. Results of use of local hemo-statics in disaster medicine. Disaster medicine. 2014;4(88):21-4. (In Russ).
4. Huls C.K. Cesarean Hysterectomy and Uterine-Preserving Alternatives. Obstet Gynecol Clin North Am. 2016;43(3):517-38. https://doi. org/10.1016/j.ogc.2016.04.010
5. Singla N.K., Gasparis A.P., Ballard J.L., Baron J.M., Butine M.D., Pribble J.P., et al. Immunogenic-ity and Safety of Re-Exposure to Recombinant Human Thrombin in Surgical Hemostasis. J Am Coll Surg. 2011;213(6):722-7. https://doi.org/10.1016/]. jamcollsurg.2011.08.019
6. Shigeta K., Matsumoto K., Abe T., Komatsuda A., Takeda T., Mizuno R., et al. The efficacy of the TachoSil binding suturing technique in laparoscop-ic partial nephrectomy to prevent the development of pseudoaneurysm. Asian J Surg. 2020;43(6):668-75. https://doi.org/10.1016/j.asjsur.2019.09.002
7. Hateichristodoulou G. Evolution of the surgical sealing patch TachoSil® in Peyronie's disease reconstructive surgery: technique and contemporary literature review. World J Urol. 2020;38(2):315-21. https://doi.org/10.1007/s00345-019-02792-w
8. Vinogradov V. V., Alekseev D.E., Svistov D. V. The adhesive properties of the "Tachocomb" hemostatic plate with prostheses of the brain dura mater. Bull Russ Mil Med Acad. 2021;23(4):195-202. (In Russ). https://doi.org/10.17816/brmma63800
9. Lipatov V.A., Severinov D.A., Saakyan A.R. Local applicational blood reestablishing instruments in surgery of the XXI century (literary review). Innova. 2019;(1):16-22. (In Russ). https://doi. org/10.21626/innova/2019.1/03
10. Khan A., Alamry K.A., Asiri A.M. Multifunctional Biopolymers-Based Composite Materials for Biomedical Applications: A Systematic Review. ChemistrySelect. 2021;6(2):154-76. https://doi. org/10.1002/slct.202003978
11. Arlov 0., Rütsche D., Asadi Korayem M., Oztürk E., Zenobi-Wong M. Engineered sulfated polysaccharides for biomedical applications. Adv Funct Mater. 2021;31(19):Article ID 2010732. https:// doi.org/10.1002/adfm.202010732
12. Bian J., Bao L., Gao X., Wen X., Zhang Q., Huang J., et al. Bacteria-engineered porous sponge for hemostasis and vascularization. J Nanobio-technology. 2022;20(1):47. https://doi.org/10.1186/ s12951-022-01254-7
13. Sakovich G.V., Skiba E.A., Gladysheva E.K., Budaeva V.V., Aleshina L.A. Chemical Aspects of Bacterial Nanocellulose. Journal of Siberian Federal University Chemistry. 2018;11(4):531-42. (In Russ). https://doi.org/10.17516/1998-2836-0097
14. Swingler S., Gupta A., Gibson H., Kowalczuk M., Heaselgrave W., Radecka I. Recent Advances and Applications of Bacterial Cellulose in Biomed-icine. Polymers (Basel). 2021;13(3):412. https://doi. org/10.3390/polym13030412
15. Mironov A.N., (Ed.). A guide to preclinical drug research. Part one. Moscow; 2012. (In Russ.)
16. Hemker H.C., Giesen P., Al Dieri R., Reg-nault V., de Smedt E., Wagenvoord R., et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysi-ol Haemost Thromb. 2003;33(1):4-15. https://doi. org/10.1159/000071636
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Кабак Валерий Алексеевич, ведущий специалист и младший научный сотрудник лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. E-mail: Kabak.V@blood.ru Тел.: +7 (925) 594-38-65. Тел. лаборатории: +7 (495) 614-76-11.
Информация об авторах
Белозерская Галина Геннадьевна, д.м.н., заведующая лабораторией патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России.
125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. E-mail: Belozerskaya.G@blood.ru
Момот Андрей Павлович, д.м.н., профессор ФГБОУ ВО АГМУ, директор Алтайского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России.
656045, г. Барнаул, ул. Ляпидевского, д. 1. E-mail: xyzan@yandex.ru
Неведрова Ольга Евгеньевна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. Email: Nevedrova.O@blood.ru
Логвинова Юлия Сергеевна, к.м.н., старший научный сотрудник и биохимик лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. Email: Logvinova.Y@blood.ru
Калелова Алина Витальевна, биохимик и лаборант-исследователь лаборатории патологии и
фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4. Email: Kalelova.A@blood.ru
Акопян Людмила Владимировна, к.м.н., ассистент кафедры оториноларингологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России. 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. E-mail: valeri@rambler.ru
Contact information Corresponding author: Valeriy A. Kabak, Leading Specialist and Junior Researcher, Laboratory of Pathology and Pharmacology of Hemostasis, National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia. 125167, Moscow, Novy Zykovsky pr. 4. E-mail: Kabak.V@blood.ru
Tel.: +7 (925) 594-38-65. Tel. of Laboratory: +7 (495) 614-76-11.
Author information
Galina G. Belozerskaya, Dr. Sci. (Med.), Head of Laboratory of Pathology and Pharmacology of He-mostasis, National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia. 125167, Moscow, Novy Zykovsky proezd, 4. E-mail: Belozerskaya.G@blood.ru
Andrey P. Momot, Dr. Sci. (Med.), Professor, Director of Altai Branch of National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia. 656045, Barnaul, Lyapidevskogo Str., 1. E-mail: xyzan@yandex.ru
Olga E. Nevedrova, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Laboratory of Pathology and Pharmacology of Hemostasis, National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia.
125167, Moscow, Novy Zykovsky proezd, 4. Email: Nevedrova.O@blood.ru
Yulia S. Logvinova, Cand. Sci. (Med.), Senior Researcher, Laboratory of Pathology and Pharmacology of Hemostasis, National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia.
125167, Moscow, Novy Zykovsky proezd, 4. Email: Logvinova.Y@blood.ru
Alina V. Kalelova, Biochemist and Laboratory Researcher, Laboratory of Pathology and Pharmacology of Hemostasis, National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia.
125167, Moscow, Novy Zykovsky proezd, 4. Email: Kalelova.A@blood.ru
Ludmila V. Akopyan, Cand. Sci. (Med.), Teaching Assistant at the Department of Otorhinolaringolo-gy, Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry of the Ministry of Health of Russia.
127473, Moscow, Delegatskaya Street, 20, str. 1. E-mail: Kabak.V@blood.ru
Поступила в редакцию 16.05.2023 Принята к публикации 04.07.2023 Для цитирования: Кабак В.А., Белозерская Г.Г., Момот А.П., Неведрова О.Е., Логвинова Ю.С., Калелова А.В., Акопян Л.В. Оценка эффективности гемостатического действия тромбина в экспериментах in vivo и in vitro. Бюллетень
медицинской науки. 2023; 3(31): 36-45. https://doi. org/10.31684/25418475-2023-3-36
Citation: Kabak V.A., Belozerskaya G.G., Momot A.P., Nevedrova O.E., Logvinova Yu.S., Kalelova A.V., Akopyan L.V. Evaluation of the effectiveness of the hemostatic action of thrombin in experiments in vivo and in vitro. Bulletin of Medical Science. 2023; 3(31): 36-45. https://doi. org/10.31684/25418475-2023-3-36 (In Russ.)
