CC BY
4
ОЦЕНКА ДОЗОЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКОВ ЖЕЛЕЗА НА БАЛАНС ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ КРОВИ ЖИВОТНЫХ
А.К. Мартусевич1,2, К.Б. Шумаев3, Л.К. Ковалева4, А.В. Давыдюк1
гФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород
2ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия», Нижний Новгород 3ФИЦ биотехнологии РАН, Москва
4ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Краснодар
Abstract
The purpose of the study was to clarify the presence of a dose-dependent antioxidant effect of a physiological no donor in vivo. The experiment was performed on 60 male Wistar rats divided into 6 equal groups. The first group of animals was intact. The rats included in the other groups were given intraperitoneal administration of 1 ml. of 0.9% sodium chloride solution daily for 10 days. In addition, dinitrosyl iron complexes with glutathione ligands (concentration - 0.15; 0.30; 0.45 and 0.60 mM, respectively). In the blood of all groups of rats, the intensity of lipoperoxidation, total antioxidant activity, and the level of malondialdehyde were studied. In general, the conducted studies allow us to conclude that there is an antioxidant effect in glutathione-containing dinitrosyl iron complexes, and the severity of these properties demonstrates a nonlinear dependence on their dose with an optimum lying in the range of 0.3-0.45 mM.
Key words: blood, oxidative metabolism, dinitrosyl iron complexes
Целью исследования служило уточнение наличия дозозависимого антиоксидантного эффекта физиологического донора NO in vivo. Эксперимент выполнен на 60 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 6 равных по численности групп. Первая группа животных была интактной. Крысам, включенным в остальные группы, в течение 10 дней ежедневно осуществляли внутрибрюшинное введение 1 мл. 0,9% раствора хлорида натрия. При этом животным третьей-шестой групп во вводимый раствор дополнительно добавляли динитрозильные комплексы железа с глутатионовыми лигандами (концентрация - 0,15; 0,30; 0,45 и 0,60 мМ соответственно). В крови крыс всех групп изучали интенсивность липопероксидации, общую антиоксидантную активность и уровень малонового диальдегида. В целом, проведенные исследования позволяют заключить о наличии антиоксидантного эффекта у
глутатион-содержащих ДНКЖ, причем выраженность этих свойств демонстрирует нелинейную зависимость от их дозы с оптимумом, лежащим в диапазоне 0,3-0,45 мМ.
Ключевые слова: кровь, окислительный метаболизм, динитрозильные комплексы железа
Наши экспериментальные данные, полученные в исследованиях in vitro, а также сведения, опубликованные другими авторами (Тимошин А.А. с соавт., 2009; van Faassen E., Vanin A.F., 2007), дают основание полагать наличие у динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) выраженных антиоксидантных свойств. Эта гипотеза была подтверждена нами при моделировании окислительного стресса in vitro (путем введения в образцы биологической жидкости озонированного физиологического раствора в высокой концентрации) и in vivo (при моделировании термической травмы у крыс). С другой стороны, указанные сведения нуждаются в подтверждении in vivo (у здоровых животных). В связи с этим целью исследования служило уточнение наличия дозозависимого антиоксидантного эффекта физиологического донора NO in vivo.
Материал и методы исследования
Эксперимент выполнен на 60 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 6 равных по численности групп. Первая группа животных была интактной (без каких-либо манипуляций). Крысам, включенным в остальные группы, в течение 10 дней ежедневно осуществляли внутрибрюшинное введение 1 мл. 0,9% раствора хлорида натрия. При этом животным третьей-шестой групп во вводимый раствор дополнительно добавляли динитрозильные комплексы железа с глутатионовыми лигандами (концентрация агента - 0,15; 0,30; 0,45 и 0,60 мМ соответственно). У животных всех групп проводили получение образцов крови, причем у крыс первой (интактной) группы - однократно, а у представителей остальных групп - двукратно (до и сразу по завершении курса воздействий).
Динитрозильные комплексы железа с глутатионовыми лигандами (ДНКЖ) синтезировали по методике А.Ф. Ванина (2009). Концентрация соединения в физиологическом растворе, определяемая спектрофотометрически по известной экстинкции при длинах волны 310 и 360 нм, составляла 3,1 ммоль/л.
В плазме крови крыс методом Fe^-индуцированной биохемилюминесценции (аппарат БХЛ-06, Нижний Новгород) изучали активность про- и антиоксидантных систем. В качестве оценочных параметров использовали светосумму биохемилюминесценции за 30 с, рассматриваемую как критерий интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также тангенс угла наклона кинетической кривой хемилюминесценции tg 2а, традиционно отождествляемый с суммарной активностью антиоксидантных систем (АОА). Уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах оценивали по методу В.Г. Сидоркина, И.А. Чулошниковой (1993).
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с
использованием критерия Шапиро--Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.
Результаты исследования Первым компонентом анализа метаболического статуса крови крыс и характера влияния на него внутрибрюшинного введения ДНКЖ с глутатионовыми лигандами явилась оценка баланса про- и антиоксидантным систем плазмы. Согласно полученным результатам, инфузии здоровым животным физиологического раствора, не содержащем изучаемого вещества, не оказывают значимого действия как на интенсивность перекисного окисления липидов в плазме крови, так и на ее общую антиоксидантную активность (рис. 1). Напротив, все используемые дозы физиологического донора оксида азота модифицировали уровень указанных параметров. В частности, интенсивность липопероксидации демонстрировала выраженную, но нелинейную зависимость от концентрации вводимых ДНКЖ. Так, при введении животным минимальной дозы соединения (1 мл 0,15 мМ раствора) не наблюдали значимых отклонений показателя.
у120 NN
>4
* 100 *
NN
>4 =
Н
В «
н =
=
№ =
И о
а
^
н о
о4
п
80
60
40
20
интактные контроль
0,15 мМ
0,3 мМ
0,45 мМ
0,6 мМ
ДНКЖ
Рис. 1. Интенсивность процессов липопероксидации в плазме крови крыс в зависимости от количества введенного раствора динитрозильных комплексов
железа
В случае увеличения концентрации вещества в растворе (0,3 мМ и выше) отмечали снижение интенсивности процессов липопероксидации, достигающее минимума при проведении курса инфузий 0,45 мМ раствора ДНКЖ ф<0,05 для всех концентраций соединения). Дальнейшее увеличение дозы вводимого донора NO оказывает менее выраженное действие на уровень параметра, что может быть обусловлено формированием избытка вещества за счет частичного разрушений
комплексов с высвобождением оксида азота и трансформацией последнего в пероксинитрит, один из наиболее сильных окислителей-биорадикалов.
Сонаправлена изменениям перекисного окисления липидов и динамика общей антиоксидантной активности плазмы крови (рис. 2). В частности, не наблюдали существенных сдвигов показателя у крыс, получавших инфузии только физиологического раствора, тогда как при добавлении в него ДНКЖ в любой из изученных концентраций отмечали нарастание значения указанного параметра. В наименьшей степени данная тенденция была выражена для минимальной дозы соединения (0,15 мМ), однако сохранялся нелинейный характер дозозависимости. Так, в диапазоне 0,15-0,45 мМ ДНКЖ регистрировали прогрессивное увеличение общей антиоксидантной активности плазмы: для концентраций 0,15; 0,30 и 0,45 мМ оно составило 1,08; 1,24 и 1,31 раза соответственно ф<0,1 - для наименьшей концентрации и p<0,05 - для остальных).
4
а
ы
и
х
ь «
н X X
к X и о а
Н О
а4'
140 120 100 80 60 40 20 0
Рис. 2 Общая антиоксидантная активность плазмы крови крыс в зависимости от количества введенного раствора динитрозильных комплексов железа
Дальнейшее нарастание количества вводимого соединения (до 0,6 мМ) обеспечивало обратный эффект: общая антиоксидантная активность в этом случае возрастала лишь на 13% относительно здоровых животных ф<0,05). По нашему мнению, механизм этих сдвигов аналогичен представленному для модификации процессов липопероксидации рассматриваемым донором оксида азота.
Результаты биохемилюминесцентного анализа, характеризующие компоненты окислительного метаболизма, были дополнительно верифицированы путем оценки концентрации стабильного продукта перекисного окисления
липидов - малонового диальдегида (МДА) в плазме крови животных сформированных групп (рис. 3).
а 120
и 100
2 а
н ы <я а а к а еа о
а
^
н о
П
80
60
40
20
интактные
контроль
0,15 мМ
0,3 мМ
0,45 мМ
0,6 мМ
ДНКЖ
0
Рис. 3. Уровень малонового диальдегида в плазме крови животных при введении им растворов с различной концентрацией динитрозильных комплексов железа
В частности, по данному параметру не выявлено существенной динамики у крыс, получавших инъекции только физиологического раствора. Также незначительные сдвиги показателя были зафиксированы в группе животных, которым вводили минимальную концентрацию ДНКЖ (-4%; р>0,1). В то же время двукратное увеличение действующей концентрации соединения (до 0,3 мМ) существенно усиливает степень снижения уровня малонового диальдегида в плазме крови (-14%; р<0,05 по сравнению со здоровыми особями). Аналогичная динамика отмечена и при использовании концентрации 0,45 мМ (-12%; р<0,05). При этом дальнейшее увеличение дозы ДНКЖ (до четырехкратной минимальной) способствовало менее выраженному падению уровня изучаемого конечного метаболита перекисного окисления липидов (-7%; р<0,05).
Заключение
В целом, проведенные исследования позволяют заключить о наличии антиоксидантного эффекта у глутатион-содержащих ДНКЖ, причем выраженность этих свойств демонстрирует нелинейную зависимость от их дозы с оптимумом, лежащим в диапазоне 0,3-0,45 мМ (доза агента - 2,86-4,29 мкг/г массы животного).
Исследование поддержано грантом РФФИ№19-015-00444_а.
Список литературы
1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестник РАМН. 2000. №4. с. 3-5.
2. Ванин А.Ф., Мартусевич А.К., Перетягин С.П., Давыдюк А.В. Оценка действия динитрозильных комплексов железа на некоторые физико-химические показатели крови in vitro // Медицинский альманах. - 2013. - №3. - С. 37-38.
3. Ванин А.Ф., Писаренко О.И., Студнева И.М. с соавт. Действие динитрозильного комплекса железа на метаболизм и клеточные мембраны ишемизированного сердца крысы // Кардиология. 2009. №12. с. 43-49.
4. Ванин А.Ф., Чазов Е.И., Капелько В.И. с соавт. Участие активных форм кислорода в модуляции гипотензивного эффекта динитрозильных комплексов железа // Кардиологический вестник. 2007. №2. С. 31-37.
5. Костюк В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: БГУ, 2004.
6. Мартусевич А.К., Перетягин С.П. Молекулярная стереотипия в реализации эффекта некоторых лечебных физико-химических факторов: роль NO // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2012. - №2., Ч. 3. - С. 205-210.
7. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Давыдюк А.В. Влияние динитрозильных комплексов железа на метаболические параметры крови животных с экспериментальной термической травмой // Биофизика. - 2014. - Т. 59, Вып. 6. - С. 1173-1179.
8. Перетягин С.П., Мартусевич А.К., Ванин А.Ф. Молекулярно-клеточные механизмы трансформации гомеостаза биосистем активными формами кислорода и азота // Медицинский альманах. - 2013. - №3. - С. 80-81.
9. Borodulin R.R., Kubrina L.N., Mikoyan V.D. et al. Dinitrosyl iron complexes with glutathione as NO and NO+ donors // Nitric oxide Biol. Chem. 2013. Vol. 29. P. 4-16.
10. Giliano N.Y. et al. Dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands and apoptosis: studies with HeLa cells // Nitric Oxide Biol. Chem. 2011. N24. P. 151159.
11. Kalyanaraman B. Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students: oxidants, antioxidants and disease mechanisms // Redox biology.
2013. N1. P. 244-257.
12. Kumar P. et al. Use of inhaled nitric oxide in preterm infants // Pediatrics.
2014. Vol. 133, N1. P. 164-170.
13. Manukhina E.B., Downey H.F., Mallet R.T. Role of nitric oxide in cardiovascular adaptation to intermittent hypoxia // Exp. Biol. Med. 2006. Vol. 231. p. 343-365.
14. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application / Ed. R.J. Gryglewsky, P. Minuz. Amsterdam; Berlin; Oxford; Tokyo; Washington: IOS Press, DC, 2001.
15. Opländer C., Römer A., Paunel-Görgülü A. et al. Dermal application of nitric oxide in vivo: kinetics, biological responses, and therapeutic potential in humans // Clin. Pharmacol. Ther. 2012. Vol. 91, N6. P. 1074-1082.
16. Vanin A.F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide Biol. Chem. 2009. Vol. 21. P. 136-149.
BHopagHKa^w u AHTHOKCHgaHTbi. 2019 TOM 6, №4
37
17. Vanin A.F., Chazov E.I. Prospects of desingning medicines with diverse therapeutic activity on the basis of dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands // Biophysics. 2011. Vol. 56, N2. P. 268-275.
18. Young I.S., Woodside J.V. Antioxidant in health and disease // J. Clin. Pathol. 2001. Vol. 54. P. 176-186.
