CC BY
61
УДК 617.713.-007.64
DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1658-1664
ОЦЕНКА ДОСТАТОЧНОСТИ ПОСТУПЛЕНИЯ РИБОФЛАВИНА В СТРОМУ РОГОВИЦЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ МОДИФИЦИРОВАННОЙ МЕТОДИКИ КРОССЛИНКИНГА РОГОВИЧНОГО КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО КЕРАТОКОНУСА
© Е.Г. Солодкова1*, В.П. Фокин1*, С.В. Балалин1*, Н.В. Блинцова2)
1) Волгоградский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России 400138, Российская Федерация, г. Волгоград, ул. Землячки, 80 E-mail: [email protected] 2) Волгоградский государственный медицинский институт Минздрава России 400131, Российская Федерация, г. Волгоград, площадь Павших Борцов, 1 E-mail: [email protected]
В работе проведена оценка насыщения роговицы раствором «Декстралинк» при выполнении стандартной и модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена. Степень насыщения роговиц раствором рибофлавина оценивалась с помощью методов фотометрического и колориметрического анализа в двух группах по 10 кадаверных кроличьих глаз. Количество рибофлавина в роговице при выполнении стандартной и модифицированной методики КРК составило 0,21 и 0,25 мг соответственно (t = 1,15, p > 0,05). Значения показателей по системе RGB при стандартной методике составили 157:124:46, при модифицированной методике - 157:127:48 (p > 0,05). Результаты работы подтвердили одинаковое проникновение рибофлавина в строму роговицы как при проведении стандартной, так и модифицированной методики КРК. Ключевые слова: кератоконус; кросслинкинг роговичного коллагена; Декстралинк
ВВЕДЕНИЕ
Кератоконус является прогрессирующим, невоспалительным, двусторонним (но обычно асимметричным) заболеванием роговицы, которое характеризуется истончением, ослаблением и эктазией ее парааксиальных зон, что приводит к искажению роговичной поверхности [1-2].
Наиболее востребованным, на сегодняшний день, способом лечения, применяемым на начальных стадиях заболевания, и составляющим альтернативу кератопластике, является кросслинкинг роговичного коллагена (КРК), предложенный в конце 1990-х гг. группой авторов из Дрезденского университета. Данный способ заключается в перекрестном связывании коллагена роговицы, что достигается путем фотополимеризации ее стромальных волокон при комбинированном воздействии фотосенсибилизатора - 0,1 % раствора рибофлавина и ультрафиолетового (УФ) излучения с длиной волны 365 нм. Кросслинкинг роговичного коллагена выполняется путем полной механической деэпителиза-ции зоны роговицы диаметром 7-9 мм, что обеспечивает глубокое проникновение рибофлавина в строму роговицы [3-7]. «Минусами» классической методики КРК, выполняемой по т. н. «Дрезденскому протоколу», являются: 1) длительный болевой синдром в раннем послеоперационном периоде; 2) риск развития инфекционных кератитов за счет нарушения эпителиального барьера роговицы; 3) различные нарушения процесса реэпителизации (замедление реэпителизации, гипертрофия эпителия, длительная эпителиопатия и т. д.),
что приводит к длительному снижению работоспособности, увеличению числа случаев непереносимости контактной коррекции у данной категории пациентов в дальнейшем; 4) отсутствие возможности проведения КРК у пациентов с толщиной роговицы менее 400 мкм вследствие возможного проявления цитотоксического эффекта УФ-излучения на эндотелий роговицы.
По настоящее время исследователями ведется поиск возможных путей усовершенствования классической методики КРК, чтобы улучшить переносимость ее пациентами, повысить ее эффективность [8-11]. Важным шагом в направлении оптимизации стандартного способа кросслинкинга явилось предложение модифицированной методики КРК, с частичной деэпителиза-цией роговицы, позволяющей уменьшить болевой синдром и ускорить реэпителизацию роговицы в раннем послеоперационном периоде, обеспечивающей полное пропитывание стромы роговицы раствором рибофлавина [12]. Наши исследования были продолжены в направлении индивидуализации этапа деэпителизации роговицы при проведении операции КРК.
С 2014 г. в Клинике Волгоградского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» помимо классической, проводится методика кросслинкинга роговичного коллагена с дозированной эксимерлазерной деэпителизацией, выполняемой на глубину эпителиального слоя по данным оптической когерентной томографии (ОКТ) роговицы под контролем интраоперационной онлайн пахиметрии [13-14]. Также оптимизирован этап насыщения роговицы раствором «Декстралинк» путем использования
1658
для насыщения пластиковой воронки, устанавливаемой на поверхность глазного яблока. При этом сокращается продолжительность этапа насыщения, улучшается его качество, а также исключается контакт деэпителизиро-ванной роговицы с воздухом, что снижает выраженность роговичного синдрома у пациента в процессе операции и облегчает субъективную переносимость процедуры. Одним из условий, обеспечивающих безопасность проведения операции КРК, является достижение достаточного уровня насыщения роговицы раствором рибофлавина.
В данном исследовании использовались фотометрический метод определения концентрации растворов, а также колориметрический метод оценки насыщения роговицы раствором «Декстралинк». Фотометрический метод основан на сравнении поглощения при пропускании света через себя стандартным и исследуемым растворами (в данном случае раствором рибофлавина), колориметрический анализ основан на оценке цветовых компонентов - красного, зеленого и синего - фотоизображений роговиц, подвергнутых как стандартной, так и модифицированной методике кросслинкинга ро-говичного коллагена.
Цель работы: оценить достаточность насыщения роговицы раствором «Декстралинк» с помощью методов фотометрического и колориметрического анализа при выполнении модифицированной методики кросс-линкинга роговичного коллагена в сравнении со стандартной методикой.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проводилось на 20 свиных кадавер-ных глазах (давность забора - 2 часа).
Кадаверные глаза были распределены в 2 группы:
1-я группа (10 глаз) - глаза, подвергшиеся стандартной методике КРК;
2-я группа (10 глаз) - глаза, подвергшиеся модифицированной методике КРК.
В ходе эксперимента каждый глаз помещали в держатель для создания необходимого уровня тургора глазного яблока (рис. 1), после чего в 1-й группе эпителий удаляли механически в центральной оптической
а)
б)
Рис. 2. Фото роговиц кадаверных глаз после проведения точечной эксимерлазерной деэпителизации
Рис. 1. Фото кадаверного свиного глаза, закрепленного в держателе
Рис. 3. Фото кадаверного глаза с установленной пластиковой воронкой на поверхности
1659
зоне диаметром 8 мм, во 2-й группе проводили точечную эксимерлазерную абляцию с использованием описанного инструмента на глубину эпителиального слоя (50 мкм), под контролем интраоперационной онлайн пахиметрии (опция эксимерного лазера «Schwind -Amaris 500») (рис. 2).
Далее в обеих группах на поверхность глазного яблока устанавливалась пластиковая воронка, которую заполняли 1,0 мл раствора «Декстралинк» (рис. 3). Продолжительность этапа насыщения составила 15 минут во всех случаях.
С помощью измерительной лабораторной пипетки (5 мл), градуированной до 0,1 мл, производился забор оставшегося раствора рибофлавина с точностью до 0,1 мл. Оставшийся раствор помещался в отдельные пробирки.
Степень поглощения света исследуемых растворов измеряли с помощью фотоэлектроколориметра КФК -2МП. В качестве «нулевого» раствора использовалась дистиллированная вода. Оптическая плотность дистиллированной воды составила D = 0,05.
Все фотоколориметры снабжены светофильтрами -окрашенными средами (стеклами, пленками или растворами), пропускающими лучи только определенной области спектра. Подбор необходимого светофильтра проводился с использованием справочной таблиц [1516]. В нашем случае был подобран синий светофильтр (^тах = 445 нм). Определение концентрации рибофлавина в исследуемых растворах проводилось с помощью калибровочного графика. Принцип построения калибровочного графика состоит в следующем: готовятся несколько стандартных растворов (5-7) с известным содержанием определяемого вещества. В каждом стандартном растворе измеряется его оптическая плотность с помощью фотоколориметра КФК - 2МП. По результатам измерений строится график, где по оси ординат откладывается оптическая плотность раствора, измеренная фотоколориметром, а по оси абсцисс - соответствующая ей концентрация рибофлавина.
В нашем случае в ряд из 7 пробирок помещали по 1,0 мл стандартного образца раствора рибофлавина, содержащего 1,0 мг лекарственного вещества в 1,0 мл раствора. В первую пробирку добавили 1,0 мл дистиллированной воды, во вторую и последующие пробирки -дистиллированную воду в объеме на 0,5 мл превышающем предыдущий. Растворы перемешивались. После этого из каждой пробирки отбирали пробы объемом 2,0 мл, помещали в кювету с толщиной слоя 10,0 мм, измеряли их оптическую плотность с помощью фотоколориметра в синем светофильтре (Imax = 445 нм).
Для проведения колориметрического анализа роговицы кадаверных глаз, принимавших участие в эксперименте, были изолированы. Колориметрический анализ насыщения роговицы раствором рибофлавина проводили по системе RGB (red, green, blue) с помощью программы Колориметр Digital Color версии 5.10 операционной системы OS X Capitan (10.11.2). Для исключения фотоизображений с различным уровнем яркости и освещенности проводили фоторегистрацию одновременно сразу двух исследуемых изолированных роговиц, расположенных рядом относительно друг друга, после их насыщения раствором рибофлавина при выполнении операции КРК по стандартной и по модифицированной методике, а также исследовалась интактная роговица, не окрашенная раствором рибофлавина (кон-
трольная группа). В каждой группе было по 10 када-верных свиных глаз.
Колориметрический анализ каждого глаза проводился трижды в оптической зоне роговицы с определением средних значений показателей RGB.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Данные по концентрации рибофлавина и оптической плотности представлены в табл. 1. На рис. 4 представлен калибровочный график для определения концентрации рибофлавина в исследуемых растворах.
Оптическая плотность исследуемых растворов находится в линейной зависимости от концентрации вещества в растворе. Об этом свидетельствует закон Бу-гера-Ламберта-Бера:
D = к-C,
где D - оптическая плотность раствора; к - коэффициент, характеризующий взаимодействие поглощающего растворенного вещества со светом с длиной волны X; С - концентрация вещества. Исходя из этого, калибровочный график аппроксимировался прямой. Для определения концентрации рибофлавина в исследуемых растворах использовалась следующая формула:
C = 1,65-D - 1,97,
где С - концентрация рибофлавина в исследуемом растворе; D - оптическая плотность исследуемого раствора.
Количество рибофлавина в растворе, оставшемся при выполнении как стандартной, так и модифицированной методики, представлено в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что различие между средними значениями полученных показателей в группах статистически недостоверны (t < 2,0; P > 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о равноценной насыщаемости роговицы раствором рибофлавина как по стандартной, так и по модифицированной методике (рис. 5).
На рис. 6 в качестве примера представлены результаты одного измерения насыщения роговицы раствором рибофлавина по системе RGB.
На рис. 7 представлена степень насыщения роговицы раствором рибофлавина по стандартной и модифицированной методике с учетом полученных средних значений показателей R, G, B.
Результаты фотоколориметрического анализа представлены в табл. 3.
Таблица 1
Данные для построения калибровочного графика
№ пробирки Оптическая плотность, D Концентрация рибофлавина, С, мг/мл
1 1,485 0,5
2 1,438 0,4
3 1,414 0,33
4 1,381 0,2857
5 1,358 0,25
6 1,333 0,22
7 1,3 0,2
1660
О
■Q I-
u О X I-
о е; с
к го
S£ U
<и т S I-
с О
0,00
0,10
0,50
0,20 0,30 0,40 Концентрация С, мг/мл
Рис. 4. Калибровочный график для определения концентрации рибофлавина в исследуемых растворах
0,60
g (мг)
0,300
0,251 мг
■ Стандартный КРК ■ Модифицированный КРК
Рис. 5. Диаграмма - количество рибофлавина в растворе после насыщения роговицы при стандартной и модифицированной методике КРК
Таблица 2
Количество рибофлавина в растворе после насыщения роговицы при стандартной и модифицированной методике КРК
Методика кросслинкинга D, оптическая плотность C (мг/мл), концентрация рибофлавина g (мг), рибофлавина
M ± m M ± m M ± m
Стандартная 1,288 0,006 0,142 0,007 0,21 0,015
Модифицированная 1,284 0,003 0,143 0,006 0,25 0,032
t 0,59 0,59 1,15
P >0,05 >0,05 >0,05
Рис. 6. Результаты одного измерения насыщения роговицы раствором рибофлавина по системе RGB
1661
Стандартная методика (RGB 157:124:46)
Модифицированная методика (RGB 157:127:48)
Рис. 7. Степень насыщения роговицы раствором рибофлавина по стандартной и модифицированной методике с учетом полученных средних значений показателей R, G, В
Таблица 3
Средние значения показателей RGB после насыщения роговицы раствором рибофлавина при стандартной и модифицированной методике (10 глаз)
Методика кросслинкинга роговичного коллагена Показатели RGB
R G B
M ± m M ± m M ± m
Стандартная 157,3 1,4 123,5 2,5 46,3 1,3
Модифицированная 157,5 1,9 127,4 2,4 48,1 1,8
t 0,08 1,1 0,8
P >0,05 >0,05 >0,05
Из табл. 3 видно, что различие между средними значениями колориметрических показателей R, G, B статистически недостоверны (t < 2,0; P > 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о равноценной насыщаемости роговицы раствором рибофлавина как по стандартной, так и по модифицированной методике.
ВЫВОДЫ
Результаты экспериментального этапа работы подтвердили одинаковое проникновение рибофлавина в строму роговицы как при проведении стандартной, так и модифицированной методике КРК. В результате эксперимента было установлено, что концентрация рибофлавина в растворе, оставшемся после насыщения роговицы в обеих группах, одинаковая, а также окрашивание роговиц раствором «Декстралинк» в результате проведения обеих методик наблюдалось одинаковым, что при исходных равных условиях эксперимента говорит об одинаковом проникновении рибофлавина в строму роговиц при проведении обеих методик.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Фейнбаум К. Современные аспекты этиопатогенеза и лечения кератоконуса // Офтальмохирургия. 2011. № 3. С. 80-83.
2. Rabinowitz Y.S. Keratokonus // Survey of ophthalmology. 1998. № 42. P. 297-319.
3. Spoerl E., Schreiber J., Hellmund K., Seiler T., Knuschke P. Crosslink-ing Effects in the cornea of Rabbits // Ophthalmol. 2000. V. 97. P. 203206.
4. Spoerl E., Wollensak G., Dittert D., Seiler T. Thermomechanical Behavior of Collagen - Crosslinked Porcine Cornea // Ophthalmologica. 2004. V. 218. P. 136-140.
5. Spoerl E., Wollensak G., Seiler T. Inceased Resistance of Crosslinkinked Cornea against Enzymatic Digestion // Current Eye Research. 2004. V. 29. № 1. P. 35-40.
6. Wollensak G., Spoerl E., Seiler T. Riboflavin/Ultraviolet-A Induced Collagen - Crosslinking for the Treatment of Keratokonus // Am. J. Oftalmol. 2003. V. 135. P. 620-627.
7. Wollensak G., Wilsch M., Spoerl E., Seiler T. Collagen Fiber Diameter in the Rabbit Cornea after Collagen - Crosslinking by Riboflavin/UVA // J. Cornea. 2004. V. 23. P. 503-507.
8. Солодкова Е.Г., Борискина Л.Н., Ремесников И.А. Сравнительный анализ способов лечения кератоконуса // 6 Всероссийская научная конференция молодых ученых в рамках научно-практической конференции «Федоровские чтения - 2011»: c6. тез. М., 2011. С. 229231.
9. Солодкова Е.Г., Ремесников И.А. Анализ отдаленных результатов кросслинкинга роговичного коллагена при лечении прогрессирующего кератоконуса // Практическая медицина. 2012. Т. 1. С. 118-120.
10. Kaya V., Utin C.A., Yilmaz O.F. Efficacy of Corneal Collagen Cross-linking Using a Custom Epithelial Debridement Technique in Thin Corneas: A confocal Microscopy Study // J. of Refract. Surg. 2011. V. 27. № 6. P. 444-450.
11. Pinelli R. C3-R treatment opens new frontiers for keratoconus and corneal ectasia // Eyeworld. 2007. № 34. P. 36-39.
12. Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Шацких А.В., Мерзлов Д.Е. и др. Экспериментальное обоснование эффективности различных методов доставки рибофлавина в строму роговицы как начального этапа выполнения УФ-кросслинкинга // Офтальмохирургия. 2014. № 1. С. 24-29.
13. Борискина Л.Н., Блинкова Е.С., Солодкова Е.Г. Способ лечения кератоконуса. Патент РФ. № 2556791. Заявл. 09.06.2014. Опубл. 20.07.2015 // Бюл. 2015. № 20.
14. Борискина Л.Н., Ремесников И.А., Блинкова Е.С., Солодкова Е.Г. Способ лечения кератоконуса. Патент РФ. № 2487691. Заявл. 12.04.2012. Опубл. 20.07.2013 // Бюл. 2013. № 20.
15. Коренман И.М. Фотометрический анализ. М.: Химия, 1970. 343 с.
16. Логинова Н.В., Полозов Г.И. Введение в фармацевтическую химию: учеб. пособие. Мн.: БГУ, 2003. 250 с.
Поступила в редакцию 20 февраля 2016 г.
1662
UDC 617.713.-007.64
DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1658-1664
SUFFICIENCY OF OVOFLAVIN ADMISSION ESTIMATION INTO CORNEAL STROMA WHILE CARRYING OUT MODIFIED METHODS OF CORNEAL COLLAGEN CROSSLINKING FOR EVOLVING KERATIKONUS
© E.G. Solodkova1*, V.P. Fokin1*, S.V. Balalin1*, N.V. Blintsova2)
^ Academician S.N. Fyodorov FSAI IRTC "Eye Microsurgery", Volgograd branch of Ministry of Health of Russia 80 Zemlyachki St., Volgograd, Russian Federation, 400138 E-mail: [email protected] 2) The Volgograd State Medical University of Ministry of Health of Russia 1 Pavshikh Bortsov Sq., Volgograd, Russian Federation, 400131 E-mail: [email protected]
The work carried out assessment of corneal saturation solution "Dekstralink" in the performance of standard and modified methods of corneal collagen crosslinking. The degree of saturation of corneas riboflavin solution was evaluated by photometric methods and colorimetric analysis of the two groups of 10 eyes rabbit cadaver. The amount of riboflavin into the cornea in the performance of standard and modified methods of CRC was 0.21 and 0.25 mg, respectively (t = 1.15, p > 0.05). RGB values of the indicators on the system at a standard technique were 157:124:46, with a modified technique - 157:127:48 (p > 0.05). The results confirmed the same penetration of riboflavin into the stroma of the cornea like during standard and modified methods of AAC.
Key words: keratoconus; corneal collagen crosslinking; Dekstralink
REFERENCES
1. Feynbaum K. Sovremennye aspekty etiopatogeneza i lecheniya keratokonusa. Oftal'mokhirurgiya — The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2011, no. 3, pp. 80-83.
2. Rabinowitz Y.S. Keratokonus. Survey of ophthalmology, 1998, no. 42, pp. 297-319.
3. Spoerl E., Schreiber J., Hellmund K., Seiler T., Knuschke P. Crosslinking Effects in the cornea of Rabbits. Ophthalmol., 2000, vol. 97, pp. 203-206.
4. Spoerl E., Wollensak G., Dittert D., Seiler T. Thermomechanical Behavior of Collagen-Crosslinked Porcine Cornea. Ophthalmologica, 2004, vol. 218, pp. 136-140.
5. Spoerl E., Wollensak G., Seiler T. Inceased Resistance of Crosslinkinked Cornea against Enzymatic Digestion. Current Eye Research, 2004, vol. 29, no. 1, pp. 35-40.
6. Wollensak G., Spoerl E., Seiler T. Riboflavin/Ultraviolet-A Induced Collagen- Crosslinking for the Treatment of Keratokonus. Am. J. Oftalmol, 2003, vol. 135, pp. 620-627.
7. Wollensak G., Wilsch M., Spoerl E., Seiler T. Collagen Fiber Diameter in the Rabbit Cornea after Collagen - Crosslinking by Ribofla-vin/UVA. J. Cornea, 2004, vol. 23, pp. 503-507.
8. Solodkova E.G., Boriskina L.N., Remesnikov I.A. Sravnitel'nyy analiz sposobov lecheniya keratokonusa. 6 Vserossiyskaya nauchnaya konferentsiya molodykh uchenykh v ramkakh nauchno-prakticheskoy konferentsii "Fedorovskie chteniya — 2011". Moscow, 2011, pp. 229-231.
9. Solodkova E.G., Remesnikov I.A. Analiz otdalennykh rezul'tatov krosslinkinga rogovichnogo kollagena pri lechenii progressiruyu-shchego keratokonusa. Prakticheskaya meditsina — Practical medicine, 2012, vol. 1, pp. 118-120.
10. Kaya V., Utin C.A., Yilmaz O.F. Efficacy of Corneal Collagen Cross-linking Using a Custom Epithelial Debridement Technique in Thin Corneas: A confocal Microscopy Study. J. of Refract. Surg., 2011, vol. 27, no. 6, pp. 444-450.
11. Pinelli R. C3-R treatment opens new frontiers for keratoconus and corneal ectasia. Eyeworld, 2007, no. 34, pp. 36-39.
12. Malyugin B.E., Izmaylova S.B., Shatskikh A.V., Merzlov D.E. i dr. Eksperimental'noe obosnovanie effektivnosti razlichnykh metodov dostavki riboflavina v stromu rogovitsy kak nachal'nogo etapa vypolneniya UF-krosslinkinga. Oftal'mokhirurgiya — The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2014, no. 1, pp. 24-29.
13. Boriskina L.N., Blinkova E.S., Solodkova E.G. Sposob lechneiya keratokonusa. Patent RF, no. 2556791. 2015.
14. Boriskina L.N., Remesnikov I.A., Blinkova E.S., Solodkova E.G. Sposob lechneiya keratokonusa. Patent RF, no. 2487691. 2013.
15. Korenman I.M. Fotometricheskiy analiz. Moscow, Khimiya Publ., 1970. 343 p.
16. Loginova N.V., Polozov G.I. Vvedenie v farmatsevticheskuyu khimiyu: uchebnoe posobie. Minsk, Belarusian State University, 2003. 250 p.
Received 20 February 2016
1663
Солодкова Елена Геннадьевна, Волгоградский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Волгоград, Российская Федерация, зав. отделением коррекции аномалий рефракции, e-mail: [email protected]
Solodkova Elena Gennadevna, Academician S.N. Fedorov FSAI IRTC "Eye Microsurgery", Volgograd branch, Volgograd, Russian Federation, Head of Correction of Refractive Anomalies Department, e-mail: [email protected]
Фокин Виктор Петрович, Волгоградский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Волгоград, Российская Федерация, профессор, доктор медицинских наук, директор, заслуженный врач РФ, e-mail: [email protected]
Fokin Viktor Petrovich, Academician S.N. Fedorov FSAI IRTC "Eye Microsurgery", Volgograd branch, Volgograd, Russian Federation, Professor, Doctor of Medicine, Director, Honored Doctor of the Russian Federation, e-mail: [email protected]
Балалин Сергей Викторович, Волгоградский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Волгоград, Российская Федерация, доктор медицинских наук, зав. научным отделом, e-mail: [email protected]
Balalin Sergey Viktorovich, Academician S.N. Fedorov FSAI IRTC "Eye Microsurgery", Volgograd branch, Volgograd, Russian Federation, Doctor of Medicine, Head of the Research Department, e-mail: [email protected]
Блинцова Наталья Викторовна, Волгоградский государственный медицинский институт, г. Волгоград, Российская Федерация, старший преподаватель кафедры химии, e-mail: [email protected]
Blintsova Natalya Viktorovna, The Volgograd State Medical University, Volgograd, Russian Federation, Senior Lecturer of Chemistry Department, e-mail: [email protected]
1664
