CC BY
1
ОЦЕНКА ДИНАМИКИ ПЕРЕРАБОТКИ ЛАКТОЗЫ ДРОЖЖАМИ РОДА КЬиУУЕКОМУСЕ8 НА ОСНОВЕ МЕТОДА БЕНЕДИКТА
Е.С. Лушникова, студент
Волгоградский государственный университет
(Россия, г. Волгоград)
DOI:10.24412/2500-1000-2024-5-5-94-97
Аннотация. В настоящем исследовании представлены результаты проверки возможности использования модифицированного метода Бенедикта для количественного определения лактозы в молочной сыворотке. Актуальность исследования обусловлена использованием лактозо-перерабатывающей способности дрожжей рода Kluyveromyces для переработки лактозо-содержащих отходов на молокоперерабатывающих предприятиях. В ходе исследования используемый метод показал свою эффективность при определении динамики переработки лактозы. Метод может быть рекомендован для использования не производствах благодаря своей простоте, дешевизне и безопасности.
Ключевые слова: Kluyveromyces, переработка лактозы, утилизация лактозы, молочная сыворотка, подсырная сыворотка, количественное определение восстанавливающих сахаров.
На молокоперерабатывающих предприятиях ежедневно производятся тонны побочного продукта - молочной сыворотки, в которой остается значительное количество лактозы. В настоящее время, большая часть сыворотки далее никак не используется и утилизируется путём простого слива. Зачастую такая «утилизация» наносит ощутимый вред окружающей среде [1].
Самый широко используемый способ утилизации лактозы - переработка их микроорганизмами. Дрожжи рода Kluyveromyces, относящихся к семейству сахаромицетных, обладают способностью перерабатывать лактозу в этанол в анаэробных условиях [2].
Для проверки качества утилизации используют разные методы определения динамики лактозы в продукте переработки. Обычно, на производствах, для определения редуцирующих сахаров выбирают метод 3,5-динитросалициловой кислоты (ДНС) или фенол-серный метод. Однако эти методы очень дороги и могут сильно загрязнить окружающую среду. При количественном определении редуцирующих сахаров в растворе наиболее простым и дешевым способом является определение с помощью спектрофотометрии [3].
Качественный метод Бенедикта был разработан Стэнли Р. Бенедиктом для качественного определения глюкозы в моче.
Этот метод до сих пор используется для качественного определения редуцирующих сахаров в клинике, промышленности и исследованиях. Механизм реакции основан на восстановительной способности свободных карбонильных групп в глюкозе, которые способны восстанавливать широкий спектр ионов металлов, включая ионы Си 2+ [4].
Авторы исследования [3] предложили модификацию метода Бенедикта. С помощью спектрофотометрии количественно определять восстанавливающие сахара по оценке полученного сульфата меди после реакции восстановления.
Цель настоящего исследования - определение возможности применения модифицированного метода Бенедикта для оценки количества лактозы в молочной сыворотке при ее микробиологической переработке.
Материалы и методы.
Калибровочный график, составленный по протоколу количественного определения восстанавливающих сахаров, предложенный А. Hemandez-L6pez [3], оказался недостаточно точный (коэффициент детерминации Я2 = 0,67) (рис. 1). В следствии этого, было принято решение адаптировать протокол для оценки динамики переработки лактозы.
1
у = -u,2953x + 1,4364 R2 = 0,6677
•t ,
4 .....+ ... • « • 1 -....... •
..... .....
О 0,5 1 1,5 2 2,5
Концентрация лактозы,%
Рис. 1. Калибровочный график, построенный по предложенному протоколу
Используя различные варианты концентраций, объёма растворов, времени нагрева и центрифугирования удалось достичь оптимальной точности метода.
Измененный протокол выглядит следующим образом: сначала необходимо соединить в пробирке 1 мл реактива Бенедикта и 0,25 мл образца, затем инкубировать в течение 15 минут при 95°С, далее центрифугировать при 6000 g в течение 5
минут. Следующим шагом разбавить су-пернатант дистиллированной водой в соотношении 1 к 4 соответственно и провести спектрофотометрическое измерение на длине волны 740 нм.
Калибровочный график, построенный на основе разработанного протокола, показал высокий уровень точности (коэффициент детерминации R2 = 0,98) (рис. 2).
1,3 1,6 1 л 1,2
К
s 0,6 с
О 0,4 0,2
у = -0, 4359x + 1,8078
R ■ = и,у/ы
• '*■*._
4
1
••
0,5
1,5
2,5
3,5
Содержание лактозы, %
Рис. 2. Калибровочный график, построенный по адаптированному протоколу
Для изучения лактозо-
перерабатывающей способности дрожжей рода Kluyveromyces были использованы два коммерческих штамма дрожжей -дрожжевая культура Kluyveromyces lactis и дрожжевая культура Kluyveromyces marxi-anus (ООО Современные технологии) и два вида молочной сыворотки.
Для исследования были составлены 4 группы образцов:
1 - дрожжи ^ lactis и молочная сыворотка №1.
2 - дрожжи ^ lactis и молочная сыворотка №2.
3 - дрожжи ^ marxianus и молочная сыворотка №1.
4 - дрожжи ^ marxianus и молочная сыворотка №2.
Глубинное культивирование дрожжевых культур проводилось в закрытых химических пробирках при поддержании необходимой постоянной температуры в течении 3 дней. В каждую пробирку для культивирования было добавлено: под-сырная сыворотка - 12 мл и дрожжевая
суспензия - 2 мл. Для каждого сочетания было взято 5 повтора во избежание погрешностей во время культивирования.
Результаты и их обсуждение.
Результаты измерений динамики лактозы по предложенному протоколу представлены в таблице. Расчет концентрации лактозы в образцах производился по уравнению регрессии калибровочного графика.
Таблица. Средние значения оптической плотности и концентрации лактозы для каждой группы образцов___
№ группы Момент измерения Средняя оптическая плот- Средняя концентрация
образцов ность в группе образцов лактозы в группе образцов
1 До культивирования 0,215 3,65%
После культивирования 1,860 < 0,1%
2 До культивирования 0,293 3,48%
После культивирования 1,840 < 0,1%
3 До культивирования 0,215 3,65%
После культивирования 1,537 0,62%
4 До культивирования 0,293 3,48%
После культивирования 1,620 0,43%
В ходе исследования модифицирован- рекомендован к использованию на моло-ный метод Бенедикта для количественной коперерабатывающих предприятиях. Его оценки содержания лактозы показал свою преимущество заключается в простоте, эффективность для определения динамики дешевизне и безопасности для окружаю-переработки лактозы дрожжами рода щей среды. Kluyveromyces. Данный метод может быть
Библиографический список
1. Исина Н.Ю. Финансовый механизм внедрения эколого-ориентированной технологии переработки молочной сыворотки / Н.Ю. Исина // Труды Костромской государственной сельскохозяйственной академии. - 2020. - № 90. - С. 111-119.
2. Fermentation of lactose to ethanol in cheese whey permeate and concentrated permeate by engineered Escherichia coli / L. Pasotti et al // BMC Biotechnology. - 2017. - №17. - С. 1-12.
3. Quantification of Reducing Sugars Based on the Qualitative Technique of Benedict / A. Hernandez-Lopez et al // ACS omega. - 2020. - № 50. - С. 32403-32410.
4. A reagent for the detection of reducing sugars / S.R. Benedict // Journal of Biological Chemistry. - 1909. - № 5. - С. 485-487.
EVALUATION OF THE DYNAMICS OF LACTOSE PROCESSING BY YEAST OF THE GENUS KLUYVEROMYCES BASED ON THE BENEDICT METHOD
E.S. Lushnikova, Student Volgograd State University (Russia, Volgograd)
Abstract. The present study presents the results of testing the possibility of using the modified Benedict's method for quantitative determination of lactose in milk serum. The relevance of the study is due to the use of lactose-processing ability of yeasts of the genus Kluyveromyces for processing lactose-containing waste at milk processing plants. In the course of the study, the method used showed its effectiveness in determining the dynamics of lactose recycling. The method can be recommended for use in non-production facilities due to its simplicity, low cost and safety.
Keywords: Kluyveromyces, lactose recycling, lactose utilization, milk whey, cheese whey, quantitative determination of reducing sugars.
