CC BY-ND
36
32
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (238)
Wilson A.G., Symon J.A. [et al.]. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation / A.G. Wilson [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1997. Vol. 94. № 7. P. 3195-3199.
Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA / C.C. Mathew // Methods in molecular biology / ed. J.M. Walker. N.Y.; London., 1984. Vol. 2. P. 31—34.
Контактная информация:
Лукманов Мурад Ильгизович, тел.: 8 (989) 952-54-82, 8 (347) 273-50-02, e-mail: mur-ufa@yandex.ru Contact information: Lukmanov Murad,
phone: 8 (989) 952-54-82, 8 (347) 273-50-02, e-mail: mur-ufa@yandex.ru
-
ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, БРУЦЕЛЛЕЗА И ХОЛЕРЫ МЕТОДОМ ПЦР С УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
А.С. Абдрашитова1, Л.В. Саяпина2, А.Н. Малахаева1, Н.А. Осина1
ESTIMATION OF DIAGNOSTIC EFFICIENCY OF DIAGNOSTIC ASSAYS FOR DETECTION OF DNA OF THE ANTHRAX, BRUCELLOSIS AND CHOLERA AGENTS BY «REAL TIME» PCR
A.S. Abdrashitova, L.V. Sayapina, A.N. Malakhaeva, N.A. Osina
1ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов, 2ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», г. Москва
В технических и медицинских испытаниях изучена диагностическая эффективность наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей особо опасных болезней методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Установлены высокие показатели их чувствительности, специфичности и воспроизводимости.
Ключевые слова: ПЦР, сибирская язва, бруцеллез, холера.
During technical and medical tests the diagnostic efficiency of diagnostic assays for detection of especially dangerous infectious diseases agents by real-time PCR was assessed. Their high parameters of sensitivity, specificity and reproducibility were established.
Keywords: PCR, anthrax, brucellosis, cholera.
Эпидемиологическая ситуация в России по сибирской язве, бруцеллезу и холере остается напряженной, это подтверждается постоянным выделением штаммов из природных очагов и регистрацией спорадических или групповых случаев заболевания людей [2, 3, 5]. В целях повышения эффективности мониторинга за возбудителями особо опасных инфекций (ООИ) в трехуровневой системе их лабораторной диагностики предусмотрена необходимость применения только зарегистрированных диагностических препаратов [4]. Обеспечение учреждений практического здравоохранения зарегистрированными препаратами для ускоренной индикации и идентификации ООИ — важная задача в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации.
Одним из перспективных методов лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая за короткий срок (3—4 ч) выявить ДНК патогена в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды при его концентрации от 100 м.к./мл [1]. Для проведения таких исследований, начиная с 1998 г., разработаны и внедрены в практику диагностические препараты для детекции ДНК сибиреязвенного микроба, холерного вибриона и бруцелл методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Данные тест-системы имеют определенные недостатки, связанные, главным образом, с использованием учета результатов субъективного и опасно-
ü
го с точки зрения контаминационного заражения метода электрофореза в агарозном геле. Поэтому в ФГУН ЦНИИЭ и ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» были разработаны наборы реагентов для выявления ДНК микроорганизмов Bacillus anthracis, Brucella spp. и Vibrio cholerae с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени», предусматривающим регистрацию реакции амплификации по накоплению в пробирке флуоресцентного сигнала.
В специализированную лабораторию ГИСК им. Л.А. Тарасевича были представлены следующие наборы реагентов: «АмплиСенс B. anthracis-FRT» в основе которой лежит амплификация фрагментов pagA гена (плазмида pXO1) и capA гена (плазмида pXO2) возбудителя сибирской язвы, и предназначенный для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды; «АмплиСенс Brucella spp.-FL», позволяющий на основании выявления фрагмента wbopA гена бруцелл, детектировать ДНК бактерий Brucella spp. в биологическом материале; «АмплиСенс Vibrio cholerae-FL» для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды, предусматривающий амплификацию 5 генетических мишеней возбудителя холеры: ctxA и tcpA генов для определения эпидемической значимости вибрионов, wbeT и wbeF генов — принадлежности к О1 или О139 серогруппе, соответственно, hlyA гена — принадлежность к виду V. cholerae. С
ЯНВАРЬ №1 (238)
33
Результаты испытаний диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК B. anthracis и Brucella spp. методом ПЦР
Показатели «АмплиСенс B. anthracis-FRT» % «АмплиСенс Brucella spp.-FL»
вариант FRT, % вариант FEP, %
Чувствительность:
в % выявленных положительных проб к числу проб чистых культур, взятых на исследование
10 спор/мл 17 - -
102 спор/мл (м.к./мл) 38 54 62
10 спор/мл (м.к./мл) 96 96 96
104 м.к./мл - 100 100
% выявленных положительных проб к числу проб объек-тов окружающей среды и биологического материала
4 1 х 10 спор/мл (м.к./мл) 100 100 100
1 х 10 спор/мл (м.к./мл) 98 97,4 96,5
% выявленных гетерологичных микроорганизмов
— к числу исследованных чистых культур 0 0 0
— к числу исследованных проб объектов окружающей среды и биологического материала, инфицированных гетерологичны-ми микроорганизмами 6 0 0
Воспроизводимость: в % совпадения результатов исследования положительной и отрицательной проб при 10-кратном повторении 100 100 100
целью предотвращения получения ложнополо-жительных и ложноотрицательных результатов новые наборы реагентов дополнены внутренними контрольными образцами (ВКО), амплификация которых осуществляется одновременно с исследуемыми пробами.
Цель исследований — определение диагностической эффективности (чувствительность, специфичность, воспроизводимость) представленных наборов реагентов в медицинских испытаниях для решения вопроса о целесообразности регистрации их в качестве изделий медицинского назначения.
Материалы и методы. ПЦР-анализ в режиме «реального» времени проводился на амплифи-каторе с системой детекции флуоресцентного сигнала «Rotor-Gene 3000», «Rotor-Gene 6000», ПЦР-анализ с детекцией результатов по «конечной точке» — на амплификаторе «Терцик» и флуоресцентном ПЦР-детекторе «АЛА-1/4».
В работе использовались чистые культуры штаммов микроорганизмов видов ВacШus, Brucella, Vibrio и гетерологичных микроорганизмов из государственных коллекций микроорганизмов ГИСК им Л.А. Тарасевича и РосНИПЧИ «Микроб», пробы биологического материала и объектов внешней среды, искусственно инфицированные микроорганизмами.
Результаты и обсуждение. Для определения чувствительности набора реагентов «АмплиСенс B. anthracis-FRT» были исследованы пробы бактериальных суспензий штаммов возбудителя сибирской язвы, имеющих различный плазмид-ный профиль с концентрацией 10—1 000 спор/мл. Установлено, что ДНК сибиреязвенного микроба детектирована в 17 % случаев при наличии в пробе 10 спор/мл, 38 % - 1 х 102 спор/мл, 96 % - 1 х 103 спор/мл. При анализе проб объектов окружающей
среды и биологического материала, искусственно инфицированных В. anthracis (pXO1+ pXO2+) выявлено 98 % и 100 % проб, содержащих возбудитель в концентрации 1 х 103 спор/мл и 1 х 104 спор/мл, соответственно. Специфичность при исследовании проб чистых культур В. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. megaterium составила 100 % (положительный ответ регистрировали только при анализе проб, содержащих ДНК сибиреязвенного микроба), проб объектов окружающей среды и биологического материала — 94 % (см. табл.). На основании полученных данных в нормативной документации на набор реагентов установлено требование к показателю чувствительности тест-системы при исследовании чистых культур В. anthracis равное 1 х 103 спор/мл.
Набор реагентов «АмплиСенс Brucella spp.-FL» в зависимости от способа детекции был представлен в двух вариантах: «ПЦР-комплект» варианты FRT и FEP с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и по «конечной точке», соответственно. В ходе ряда экспериментов установлено, что набор реагентов при исследовании бактериальных суспензий культур Brucella spp. выявлял 54 и 62 % проб при концентрации патогена в них 1х102 м.к./мл при регистрации результатов по вариантам FRT и FEP, соответственно; 96 % и 100 % проб — при концентрации 1 х 103 м.к./мл и 1 х 104 м.к./мл вне зависимости о способа учета флуоресценции. Следовательно, чувствительность тест-системы при исследовании чистых культур Brucella spp. составила 1 х 103 м.к./мл. Положительные пробы биологического материала, инфицированного Brucella spp. в концентрации 1 х 103 м.к./мл, выявлялись с помощью варианта FEP в 96,5 % и в 97,4 % случаев (для варианта FRT). В биологическом материале с помощью испытуемого набора
34
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (238)
реагентов с регистрацией результатов по обоим способам Brucella spp. выявлялась в концентрации 1 х 104 м.к./мл в 100 % случаев. Специфичность набора в пробах с чистыми культурами гетероло-гичных микроорганизмов (Y. pestis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, F. tularensis) и пробах инфицированного биологического материала для обоих вариантов составила 100 % (см. табл.).
В ходе испытаний была получена высокая воспроизводимость (100 %) совпадения результатов исследования положительных и отрицательных проб при 10-кратном повторении для всех исследуемых наборов реагентов.
Набор реагентов «АмплиСенс Vibrio cholerae-FL» был представлен для проведения технических испытаний на соответствие его требованиям проекта нормативной документации и состоял из двух вариантов «ПЦР-комплект» FRT и FEP с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального» времени» и по «конечной точке», соответственно. Установлено, что комплект реагентов c ПЦР-смесью-1-FRT Vibrio cholerae скрин выявлял патогенные штаммы V. cholerae О1 биовара эльтор и V. cholerae О139, а также штаммы V. cholerae О1 классического биовара в концентрации 1х103 м.к./мл; комплект ПЦР-смесь-1-FRT Vibrio cholerae тип выявлял штаммы V. cholerae и идентифицировал принадлежность к О1 и О139 серогруппам. При проведении контроля комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FEP были получены ложноположительные результаты в пробах с V. cholerae не О1 по наличию маркера wbeT, с отрицательным контрольным образцом выделения ДНК (ОКО) — по маркерам hlyA и wbeT, а также с E. coli — по амплификации последовательности гена wbeT. В связи с этим для повышения специфичности анализа производителями было принято решение выпускать наборы реаген-
тов только в формате FRT.
Таким образом, в ходе проведенных испытаний представленных наборов реагентов установлены высокие показатели их чувствительности, специфичности и воспроизводимости, при существенном сокращении продолжительности исследования и исключении регистрации ложноположительных результатов. Полученные результаты послужили основанием для регистрации новых наборов реагентов в РФ в установленном порядке.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сборник тез. докл. 5-й Всерос.науч.-практ. конф., 19-21 окт. 2004 г. М., 2004.
2. Лямкин Г.И., Тихенко Н.И., Манин Е.А. и др. Об эпидемической ситуации и заболеваемости бруцеллезом в Российской Федерации в 2011г. и прогноз на 2012 г. //Проблемы особо опасных инфекций. Вып. 1(111). 2012. С. 26—29.
3. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Кру-гликов В.Д. Холера в начале XXI века. Прогноз на глобальном уровне //Проблемы особо опасных инфекций. Вып. 1(111). 2012. С. 11 — 16.
4. Онищенко Г.Г., Кузькин Б.П., Кутырев В.В. и др. Актуальные направления совершенствования лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней //Проблемы особо опасных инфекций. Вып. 1(99). 2009. С. 5—10.
5. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова Е.А. и др. Анализ заболеваемости сибирской язвой в 2011 г. и прогноз на 2012 г. //Проблемы особо опасных инфекций. Вып. 1(111). 2012. С. 37—38.
Контактная информация:
Абдрашитова Адиля Сапеджановна, тел. 8 (845) 251-52-11, e-mail: rusrapi@microbe.ru
Contact information:
Abdrashitova A dila, phone: 8 (845) 251-52-11, e-mail: rusrapi@microbe.ru
ОПЫТ РАБОТЫ ПО САНИТАРНОЙ ОХРАНЕ ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ЮЖНОМ УЧАСТКЕ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ГРАНИЦЫ
Т.М. Бутаев, Д.Г. Габеева, Ф.Т. Бекузарова, З.З. Каболова
EXPERIENCE OF THE WORK ON SANITARY GUARD TERRITORY OF THE TO RUSSIAN FEDERATION ON SOUTH AREA OF THE STATE BORDER
T.M. Butaev, D.G. Gabeeva, F.T. Bekuzarova, Z.Z. Kabolova
Управление Роспотребнадзора по РСО-Алания, г. Владикавказ, ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия»
Рассматривается опыт работы Управления Роспотребнадзора по Республике Северная Осетия —Алания по санитарной охране на Южном участке государственной границы РФ, как одной из важнейших функций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Ключевые слова: санитарная охрана, пункт пропуска, государственная граница.
Experience of working Rospotrebnadzor Republic of North Ossetia-Alania on sanitary protection in the Southern part of the state border of the Russian Federation, as one of the most important functions of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare
Keywords: sanitary guard, point of the gap, state border.
Важнейшей функцией Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека является санитарная охрана территории от заноса особо опасных инфекционных заболеваний, а также предупреждение
ввоза опасных для человека химических, биологических и радиоактивных отходов и грузов. Одним из факторов риска глобализации является высокоскоростное транспортное сообщение, способствующее быстрому распространению возбудите-
