CC BY
93
УДК 57.084.1+57.044+57.087.23+59.084+593.171.4+58.04
А.С. Коновалов
ОЦЕНКА ДЕТОКСИКАЦИИ ГУМАТАМИ РАСТВОРОВ СОЛИ МЫШЬЯКА МЕТОДАМИ БИОТЕСТИРОВАНИЯ*
Байкальский музей ИНЦ СО РАН (Иркутск)
Методами биотестирования исследованы токсичность и детоксикация модельных растворов соли мышьяка (Na3AsO4). Показано снижение токсического действия мышьяка при. помощи, препаратов гуминовых веществ («Powhumus», «Лигногумат», «Гумат-80»). Изучена возможность использования гуминовых веществ для. детоксикации, мышьякового загрязнения в модельных опытах.
Для. изучения возможности, детоксикации модельного загрязнения солями мышьяка применяли гуминовые препараты. (ГП) Powhumus (гумат из леонардита «Humintech. Ltd.», Германия), Гумат-80 (гумат калия ООО «Аграрные технологии») и. Лигногумат. (гумат. калия ООО «НПО «РЭТ»).
В качестве тест-объектов брали, семена Lepidium. sativum. L. (ЗАО «Иркутские семена»), водоросли (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb.).
Токсичность оценивали, по влиянию на прорастание семян и. длину корней проростков L. sativum, по изменению интенсивности, флуоресценции, хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda. Полученные результаты, статистически, обработаны, с использованием, общепринятых методов при. p < 0,05. Арсенит натрия, в концентрации. 8 мг/дм3 угнетал прорастание семян кресс-салата на 70,1 ± 6,9 %. При. содержании 9 мг/дм3 Na3AsO4 снижал количество проросших семян на 75,1 ± 6,6 %. LC50 для. данного метода составила 5,7мг/дм3.
При. применении. ГП в концентрации 0,2 г/дм3 наблюдали, снижение токсического эффекта арсенита натрия, на 25,3 ± 2,7 %. Наибольшую эффективность в отношении снижения токсичности, модельного мышьякового загрязнения наблюдали, при. использовании. Powhumus в концентрации 1,0 г/дм3 — количество проросших семян составило 90,1 ± 8,7 %.
Следующим, этапом, явилось биотестирование с использованием, метода регистрации, снижения уровня, флуоресценции, хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda. Величина LC5(I для. данного метода составила 1,5 мг/дм3.
Концентрации, арсенита натрия. 1,8 и. 1,5мг/дм3 подавляли, уровень флуоресценции, хлорофилла более чем. на 30 % (уровень флуоресценции.хлорофилла составил 26,4 ± 3,2 % и. 54,5 ± 6,1 % соответственно). Powhumus в концентрации. 0,05 г/дм3 снижал токсичность проб на 36,7 ± 3,9 % и. 31,8 ± 3,4 % соответственно. Методика биотестирования по изменению интенсивности флуоресценции хлорофилла клеток водорослей. S. quadricauda показала большую чувствительность и. скорость получения, ответа, чем методика по оценке влияния на прорастание семян и. длину корней проростков L. sativum.
* Работа частично проводилась при. финансовой, поддержке Министерства образования и. науки Российской Федерации (Соглашения: ГК № 14.B37.21.0785 от. 24.08.12, ГК № 11.519.11.5016 от. 28.10.11) и. Программы, стратегического развития.
Ключевые слова: детоксикация, мышьяк, мышьяковое загрязнение, гуминовые препараты, биотестирование
EVALUATiON OF DETOXiFiCATiON ARSENiC SALT SOLUTiON BY HUMATES BY BiOTESTiNG
A.S. Konovalov
Baikal museum of ISC SD RAS, Irkutsk
We investigated, toxicity and detoxification of model solutions of arsenic salts (Na3AsO4) by biotesting. Decreasing the toxicity of arsenic using humic substances («Powhumus», «Lign.ohum.ate», and «Humate-80») is shown. The possibility of use of humic substances to detoxify arsenic contamination, in mode! experiments is studied. To study the possibility of detoxification mode! contamination by salt of arsenic we used humic substances Powhumus (humate from leonardite «Humintech Ltd», Germany), Humate-80 (potassium, humate LLC «Agricultural Technology») and. Lignohumate (potassium, humate «SPA «RET»).
As test objects seeds of Lepidium. sativum. L. (JSC «Irkutsk seeds») and. algae (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb.) were taken.
Toxicity was evaluated, by effect on seed, germination, and. root length of L. sativum, the change in intensity of chlorophyll fluorescence of algae cells S. quadricauda. The significance of differences was determined, by Student's test. The table shows the mean values and. standard, deviations for p > 0,95.
Sodium, arsenite at a concentration, of 8 mg/cdm inhibited, seed, germination, of cress to 70,1 ± 6,9 %. The content of 9 mg/cdm. Na3AsO4 reduced, the number of germinated, seeds to 75,1 ± 6,6 %. LC50 for this method, was equal 5,7 mg/cdm.
In applying the HS in a concentration, of 0,2 g/cdm a decrease toxicity of sodium, arsenite to 25,3 ± 2,7 % was observed. The most effective model in reducing the toxicity of arsenic contamination, was observed at a concentration, of Powhumus 1,0 g/dm3 — the number of germinated, seeds was 90,1 ± 8,7 %.
The next stage was the bioassay using the registration reducing chlorophyll fluorescence of algae cells S. quadricauda. Value of LC50 for this method, was 1,5 mg/cdm.
The concentration, of sodium, arsenite 1,8 and. 1,5 mg/ cdm suppressed, levels of chlorophyll fluorescence by more than 30 % (the level of chlorophyll fluorescence was 26,4 ± 3,2 % and. 54,5 ± 6,1 % respectively). Powhumus in concentration, of 0,05 g/cdm reduced, toxicity of samples for 36,7 ± 3,9 % and. 31,8 ± 3,4 %, respectively. Bioassay method, of changing the intensity of chlorophyll fluorescence of cells of algae S. quadricauda showed, greater sensitivity and. speed, of the response than the method, of assessing the impact on seed, germination and seedling root length of L. sativum.
Key words: detoxification, arsenic, arsenic pollution, humic substances, biotesting
Одним из негативных моментов влияния антропогенной деятельности на окружающую среду является загрязнение последней высокотоксичными соединениями мышьяка [6].
Гуминовые вещества представляют собой высокомолекулярные склонные к ассоциации по-лидисперсные, полифункциональные природные лиганды. Их комплексообразующая способность обусловлена присутствием карбоксильных, фенольных, а также других функциональных групп. Гуминовые вещества способны связывать загрязнители и за счет ван-дер-ваальсовых и донорно-акцепторных взаимодействий. Во многих случаях после связывания гуминовыми производными веществами токсичных веществ агрессивный потенциал загрязнителей существенно уменьшается [10].
Цель работы: изучение возможности использования гуминовых веществ для детоксикации мышьякового загрязнения в модельных опытах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали соль Na3AsO4 марки х.ч.
Для изучения возможности детоксикации модельного загрязнения солями мышьяка применяли гуминовые препараты Powhumus (гумат из леонар-дита «Humintech Ltd.», Германия), Гумат-80 (гумат калия ООО «Аграрные технологии») и Лигногумат (гумат калия ООО «НПО «РЭТ»).
В качестве тест-объектов брали семена Lepidium sativum L. (ЗАО «Иркутские семена»), водоросли (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb.), равноресничные инфузории (Paramecium cauda-tum Ehrenberg).
Токсичность оценивали по влиянию на прорастание семян и длину корней проростков L. sativum, по изменению интенсивности флуоресценции хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda, по выживаемости инфузорий P. caudatum.
Семена L. sativum помещали в чашки Петри, куда добавляли 5 см3 испытуемого раствора. Чашки выдерживали сутки при температуре 31 °C. После
подсчета проросших семян чашки инкубировали еще сутки и измеряли длины корешков проростков кресс-салата [4, 13].
Измерение уровня флуоресценции проводили на «Флюорат-02-3М» в режиме непрерывных измерений. Для каждой пробы рассчитывали среднее значение уровня флуоресценции по двум измерениям. Замеры уровня флуоресценции в исследуемых колбах проводили через трое суток инкубирования на люминостате [1, 14].
Острое токсическое действие исследуемой пробы на парамеций оценивали по их смертности за 24-часовой период экспозиции. Критерием острой токсичности служила выживаемость 50 % и менее парамеций за сутки в исследуемой пробе [2].
Все эксперименты проводили не менее чем в 5 независимых опытах с 3 параллельными измерениями в каждом. Для обработки полученных данных использовали пакет программ MS Excel. Достоверность различия определяли с помощью критерия Стьюдента. В таблицах представлены средние значения и их стандартные отклонения при р > 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе первого этапа работы оценивали влияние различных гуминовых препаратов (ГП) в диапазоне концентраций 0,1 — 10 г/дм3 на семена кресс-салата. Результаты биотестирования, представлены на рисунке 1.
Все исследованные препараты гуминовых веществ (Powhumus, Лигногумат, Гумат-80) не оказывали негативного влияния на прорастание семян в концентрациях от 0,1 до 2 г/дм3. Вместе с тем при содержании выше 2 г/дм3 наблюдали снижение количества проросших семян кресс-салата. Впрочем, даже при концентрации ГП 9 г/дм3 прорастало 50,2 ± 4,8 % семян. Опираясь на полученные результаты, в дальнейшей работе использован диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 г/дм3.
концентрация, г/дм3
Рис. 1. Влияние различных концентраций ГП на прорастание семян кресс-салата (в % к контролю - дехлорированная вода.
х
к
3
о
о
о
с
о
со
с5
си
т
о
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
123456789 концентрация, мг/дм3
Рис. 2. Влияние различных концентраций растворов Na3AsO4 на прорастание семян кресс-салата (в % к контролю - дехлорированная вода).
х
к
2
си 2
и с; х 2
^ О.
Э т
О “ « £ 5 к си 2 т си ^ о
о
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
у = 8,^ + 42,9 R2 = 0,91
0,1
0,2
0,4
0,6
□ Powhumus + NaзAsO4 10 мг/дм3 НГумат-80 + NaзAsO4 10 мг/дм3
□ Лигногумат + NaзAsO4 10 мг/дм3 □NaзAsO4 10 мг/дм3
0,8 1,0 концентрация, г/дм3
Рис. 3. Совместное влияние ГП и растворов Na3AsO4 на прорастание семян кресс-салата (в % к контролю - дехлорированная вода). 3 4
Из рисунка 2 следует, что арсенит натрия в концентрации 8 мг/дм3 угнетал прорастание семян кресс-салата на 70,1 ± 6,9 %. При содержании 9 мг/ До13 Na3AsO4 снижал количество проросших семян на 75,1 ± 6,6 %. LC50 для данного метода составила
5,7 мг/дм3.
Провели серию опытов с использованием ГП Ро'^ит^, Лигногумат, Гумат-80 в концентрациях
0,1 — 1,0 г/дм3 и растворов 10 мг/дм3 арсенита натрия (рис. 3).
При применении ГП в концентрации 0,2 г/дм3 наблюдали снижение токсического эффекта арсенита натрия на 25,3 ± 2,7 %. Наибольшую эффективность в отношении снижения токсичности модельного мышьякового загрязнения наблюдали при использовании Ро^^ит^ в концентрации 1,0 г/дм3 — количество проросших семян составило 90,1 ± 8,7 %.
Следующим этапом явилось биотестирование с использованием метода регистрации снижения уровня флуоресценции хлорофилла клеток водорослей S. qu.adricau.da (рис. 4).
Величина LC50 для данного метода составила 1,5 мг/дм3.
Как видно из рисунка 5, концентрации арсенита натрия 1,8 и 1,5 мг/дм3 подавляли уровень флуоресценции хлорофилла более чем на 30 % (уровень флуоресценции хлорофилла составил 26,4 ± 3,2 и 54,5 ± 6,1 % соответственно). Ро^^ит^ в концентрации 0,05 г/дм3 снижал токсичность проб на
36,7 ± 3,9 и 31,8 ± 3,4 % соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, для изучения токсичности и детоксикации мышьякового загрязнения пригодны такие методы биотестирования, как оценка влияния на: прорастание семян и длину корней проростков кресс-салата, уровень флуоресценции хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda, выживаемость инфузорий Р. caudatum, уровень биолюминесценции бактерий Р. phosphoreum, а также определение влияния на скорость пенообразования в дрожжевой суспензии. ГП «Ро^^ит^», «Лигногумат», «Гу-
ф
о 2 ц о н
X
о
X *
Ф чО
о ф -&.0
ш
in ^
S ■§ S
концентрация, мг/дм3
Рис. 4. Влияние различных концентраций растворов Na3AsO4 на флуоресценцию клеток водорослей в. Quadricauda (в % к контролю - дехлорированная вода).
со
О
I—
ф
2
ц
о
н
X
о
X *
Ф чО
£ “ п <0
Л. ® -&.0
Ел ^ ^ § § ^
>
100
80
60
40
20
1 - Na3AsO4 1,8 мг/дм3
2 - Na3AsO4 1,8 мг/дм3 + «Powhumus» 0,01 г/дм3
3 - Na3AsO4 1,8 мг/дм3 + «Powhumus» 0,05 г/дм3
4 - Na3AsO4 1,5 мг/дм3
5 - Na3AsO4 1,5 мг/дм3 + «Powhumus» 0,01 г/дм3
6 - Na3AsO4 1,5 мг/дм3 + «Powhumus» 0,05 г/дм3
вариант пробы
Рис. 5. Совместное влияние Powhumus и растворов Na3AsO4 на флуоресценцию клеток водорослей в. quadricauda (в % к контролю - дехлорированная вода).
0
мат-80» эффективно снижают токсическое действие мышьякового загрязнения в модельных опытах.
Построен следующий ряд по чувствительности использованных биотестов: изменение уровня биолюминесценции бактерий P. phos-phoreum > изменение скорости пенообразования в дрожжевой суспензии > изменение уровня флуоресценции хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda > прорастание семян L. sativum > выживаемость инфузорий P. caudatum.
По старости получения ответа биотесты можно расположить в следующем порядке: изменение уровня биолюминесценции бактерий P. phosphore-um > выживаемость инфузорий P. caudatum > изменение интенсивности флуоресценции хлорофилла клеток водорослей S. quadricauda > прорастание семян L. sativum.
ЛИТЕРАТУРА
1. Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и
отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. — М.: Акварос, 2007. — 48 с.
2. Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и фунтовых вод методом блокирования с использованием равноресничные инфузории (Paramecium caudatum Ehrenberg) // ФР. 1.39.2006.02506 ПНДФ 14.1:2:3.13-06 16.1:2.3:3.10-06 М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. — 2006. — 31 с.
3. Почва, очистка населенных мест, отходы производства и потребления, санитарная охрана почвы: Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве. ГН 2.1.7.2041-06. — М., 2006.
4. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. — М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002. - 118 с.
5. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. ГОСТ 12.1.007-76
6. Arsenic in the environment — Part I: Cycling and characterization / ed. J.O. Nriagu. — New York: John Wiley & Sons, Inc., 1994.
7. Buschmann J., Kappeler A., Indauer U., Kis-tler D. et al. Arsenite and arsenate binding to dissolved humic acids: influence of pH, type of humic acid, and aluminum // Environ. Sci. Technol. — 2006. — Vol. 40. - P. 6015-6020.
8. Haw-Tarn Lin, Wang M.C., Gwo-Chen Li Complexation of arsenate with humic substance in water extract of compost // Chemosphere. — 2004. — Vol. 56. — P. 1105 — 1112.
9. Humic substances: structures, models and functions / Eds: E.A. Ghabbour, G. Davies. — Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2001.
10. Perminova I., Grechishcheva N., Kovalev-skii D., Kudryavtsev A. et al. Quantification and prediction of the detoxifying properties of humic substances related to their chemical binding to polycyclic aromatic hydrocarbons // Environmental science and technology. — 2001. — Vol. 35, N 19. — P. 3841 —3848.
11. Saada A., Breeze D., Crouzet C., Cornu S. et al. Adsorption of arsenic (V) on kaolinite and on kaolinite-humic acid complexes. Role of humic acid nitrogen groups // Chemosphere. — Vol. 51. — 2003. — P. 757 — 763.
12. Steinberg C.E.W. Ecology of humic substances in freshwaters. — Heidelberg: Springer, 2003.
13. Stom D.I., Effect of Polyphenols on Shoot and Root Growth and on Seed Germination // Biologia Plantarum. — 1982. — Vol. 24 (1). — P. 1—6.
14. Stom D.I., Geel T.A., Schachova G.V., Kuznetzov A.M. et al. Bioluminescent method in studying the complex effect of the various components // Archives of Environ. Contam. Toxicol. — 1992. — Vol. 22. — P. 203 — 208.
15. Tan K.H. Humic matter in soil and the environment. Principles and Controversies. — New York: Marcel Dekker Inc., 2003.
16. Warwick P., Inam E., Evans N. Arsenic's interaction with humic acid. — Department of Chemistry, Loughborough University, 2004.
Сведения об авторах
Коновалов Александр Сергеевич - аспирант третьего года подготовки Байкальский Музей ИНЦ СО РАН (664003, г. Иркутск, а/я 24; тел.: 8-902-173-44-65; e-mail: [email protected], [email protected])
