CC BY
8УДК 579.61 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-07-06
© Коллектив авторов, 2020
ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЙОДНОГО МЕТОДА
ПРИ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИИ БЕ7Д-ЛАКТАМАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
ИЗОЛЯТОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
A.Н. Ваганова
к.б.н., науч. сотрудник, лаборатория молекулярно-биологических технологий, Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Санкт-Петербург) E-mail: van.inprogress@gmail.com М.В. Михеева
лаборант-исследователь, лаборатория молекулярно-биологических технологий, Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Санкт-Петербург) Е.В. Нестерова
врач-бактериолог, клинико-диагностическая лаборатория, Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городской кожно-венерологический диспансер» (Санкт-Петербург) Н.Н. Трофимова
врач-бактериолог, клинико-диагностическая лаборатория, Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городской кожно-венерологический диспансер» (Санкт-Петербург) И.В. Литвиненко
зав. клинико-диагностической лабораторией,
Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городской кожно-венерологический диспансер» (Санкт-Петербург) Я.Г. Петунова
к.м.н., зав. городским организационно-методическим консультативным отделом по дерматовенерологии, Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городской кожно-венерологический диспансер» (Санкт-Петербург)
B.Н. Вербов
к.х.н., руководитель отдела новых технологий,
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Санкт-Петербург)
Актуальность. Среди чувствительных к метициллину изолятов Staphylococcus aureus (MSSA) широко распространены бета-лат-камазы, определяющие устойчивость данных патогенов к пенициллинам. При этом до 50% чувствительных к пенициллину изолятов, исследованных диско-диффузионным методом, являются продуцентами бета-лактамаз. Исследование чувствительности к антибиотикам изолятов является длительным, что замедляет процесс назначения адекватной антибиотикотерапии. В связи с этим актуальным представляется внедрение экспресс-методов определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Цель исследования. Оценка чувствительности йодного теста для определения чувствительности к пенициллину и потенциальной бета-лактамазной активности стафилококков (выявление носителей бета-лактамазного оперона). Материал и методы. Исследование бета-лактамазной активности 81 клинического изолята mSsa проведено с помощью йодного теста при предварительной стимуляции продукции изолятом бета-лактамазы пенициллином и без стимуляции. Чтобы оценить чувствительность и специфичность данной методики для определения устойчивых к пенициллину как изолятов, так и изолятов потенциальных продуцентов бета-лактамазы, проведено сравнение полученных результатов с данными о наличии в геноме изолятов бета-лактамазного оперона, полученными с помощью ПЦР в реальном времени, и показателями чувствительности изолятов к пенициллину.
Результаты. Установлена высокая чувствительность йодного теста при определении MSSA, чувствительного к пенициллину. Чувствительность йодного теста для определения устойчивых к пенициллину изолятов составила 61% при исследовании без стимуляции и 86% - при исследовании после стимуляции. В то же время йодный тест характеризовался относительно низкой чувствительностью при определении изолятов-носителей бета-лактамазного оперона, не превышавшей 63%. Таким образом йодный тест без проведения стимуляции может рассматриваться в качестве скринингового метода выявления чувствительных к пенициллину MSSA непосредственно после выделения патогена, что будет способствовать сокращению сроков исследования при принятии решения о выборе антибиотикотерапии.
Выводы. Несмотря на низкую чувствительность йодного метода для выявления носителей бета-лактамазного опреона среди MSSA, этот метод является перспективным для ускоренного определения чувствительности золотистого стафилококка к пенициллину.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, бета-лактамазы, антибиотикоустойчивость, диагностика.
Для цитирования: Ваганова А.Н., Михеева М.В., Нестерова Е.В., Трофимова Н.Н., Литвиненко И.В., Петунова Я.Г., Вербов В.Н. Оценка чувствительности йодного метода при экспресс-определении бета-лактамазной активности изолятов Staphylococcus aureus. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(7): 35-39. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-07-06
Среди чувствительных к метициллину Staphylococcus aureus (MSSA), а также резистентных к метициллину S. aureus (MRSA) распространены бета-лактамазы BlaZ, способные к гидролизу пе-нициллинов и цефалоспоринов I поколения [1]. Их гены выявляются практически у всех изолятов MRSA, а также у MSSA, устойчивых к пенициллину, и 50% чувствительных к пенициллину изолятов MSSA, выделенных из клинического материала, полученного от людей [2, 3] и животных [4], в том числе среди изолятов, выделенных из материала от здоровых добровольцев [5].
Известны культуральные и биохимические методы определения бета-лактамазной активности S. aureus. Среди культуральных методов применяется оценка края зоны задержки роста в диско-диффузионном тесте с пенициллином и тест Ходжа, при котором производится посев исследуемого изолята на питательную среду с диском с пенициллином совместно с чувствительным штаммом, способным к росту в подобных условиях только в присутствии продуцента бета-лактамаз. Биохимические методы включают в себя хромо-генные реакции: реакцию с нитроцефином и йодный тест с антибиотиками бета-лактамного ряда.
Йодный тест проводят в жидкой среде, на плотной среде [6] или на бумажных полосках. Изменение окраски происходит за счет вытеснения крахмала из окрашенного комплекса с йодом пе-нициллановой кислотой, образующейся при лизисе бета-лактамных антибиотиков [7]. В зависимости от модификации чувствительность метода составляет 42,9-100% [6-8].
Продукция бета-лактамаз Blaz активируется в присутствии антибиотиков бета-лактамного ряда. Индукцию синтеза бета-лактамазы путём внесения в среду бета-лактамных антибиотиков рекомендуется проводить для повышения чувствительности йодного теста. Длительность индукции составляет от 30 мин до 1 суток [8, 9].
Цель исследования — оценка чувствительности йодного теста для определения бе-та-лактамазной активности стафилококков и влияния на нее индукции экспрессии бета-лактамазы пенициллином.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изоляты М88Л были выделены из клинического материала, пациентов СПб ГБУЗ «Городской кожно-венерологический диспансер» в 2019 г. (п = 81), Принадлежность к М88Л подтверждалась диско-диффузионным тестом с цефокситином и отрицательным результатом определения гена тесА методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.
Определение бета-лактамазной активности проводили с использованием «Набора реагентов для экспресс-определения бета-лактамазы» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пас-тера, Санкт-Петербург) в двух вариантах: 1) после культивирования 24 ч на агаре Мюллера—Хинтона с диском, содержащим 10 единиц активности пенициллина (колонии отбирались с края зоны задержки роста); 2) после культивирования 24 ч в отсутствии пенициллина. Исследование выполняли согласно инструкции к набору. На полоски фильтровальной бумаги наносили водный раствор крахмала, затем на полоски помещали отдельные колонии и наносили на них реактив, содержащий 500 000 ЕД пенициллина с йодистым калием, в результате чего бумага приобретала фиолетовую окраску. Появление зоны обесцвечивания бумаги вокруг колонии в течение 5-7 мин принималось в качестве положительного результата.
Выявление генов Ь/aZ и Ь!аЯ1 осуществляли методом ПЦР в реальном времени после термоли-тического разрушения бактериальных клеток при температуре 96 °С в течение 10 мин. Для постановки ПЦР использовали праймеры и флуоресцентно-меченные зонды, имеющие следующую структуру:
BlaRl Праймер: FGAATAATCAAGCGCCCACAGTT;
BlaRl Праймер: RCCCAATTAAACTTATGGATATCTGT;
BlaRl Зонд: FAM-ACCACCAAACCTRTTCAAGAGTTC-BHQ-1;
BlaZ Праймер: FGCTTTAAAAGAACTTATTGAGGCTTCA [6];
BlaZ Праймер: RCCACCGATYTCKTTTATAATTT [6];
BlaZ Зонд: FAM-AGTGATAATACAGCAAACAA-BHQ-1 [6].
Смеси для ПЦР в реальном времени готовили на основе реактива qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген», Москва), праймеры и зонды вносили в реакционную смесь в количестве 10 пмоль на пробу, реакцию проводили в термоциклере CFX 96 («BioRad», США).
Для оценки достоверности различий применяли критерий X Пирсона. Чувствительность и специфичность методов оценивали по формулам:
Se = TP/(TP+FN) • 100% , где Se — чувствительность метода; TP — истинно положительные случаи; FN — ложноотрицатель-ные случаи;
Sp = TN/(TN+FP) • 100%, где Sp — специфичность метода; TN — истинно отрицательные результаты; FP — ложноположитель-ные результаты.
Чувствительность выделенных изолятов к пенициллину и цефазолину определения диско-диффузионным методом. Были использованы диски с пенициллином 1 мкг и цефазолином 30 мкг (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург). Зоны задержки роста оценивали через 18-20 ч после посева [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При оценке бета-лактамазной активности 81 изолята MSSA после инкубации в отсутствии пенициллина у 33 (40,74%) изолятов MSSA выявлена активность бета-лактамазы. В то же время после культивирования в присутствии диска с пенициллином 24 ч число обнаруженных с помощью йодного теста изолятов, продуцирующих бета-лактамазу составило 52 (64,20%). Среди исследованных изолятов продукция бета-лактамазы выявлялась как до, так и после стимуляции у 32 (39,51%) изолятов. У 20 (24,69%) изолятов бета-лактамазная активность наблюдалась только после культивирования в присутствии пенициллина.
Из-за высокой вариабельности генов бета-лактамазного оперона для его выявления методом ПЦР в реальном времени было выбрано две мишени: blaZ и blaR. Число изолятов, в геноме которых обнаружен, по крайней мере, один из генов, составило 77 (96,25%).
Среди изолятов-носителей бета-лактамазного оперона бета-лактамазная активность была выявлена у 33 (40,74%) изолятов при исследовании без предварительной стимуляции пенициллином и у 51 (62,96%) изолята после стимуляции пенициллином.
Чувствительность йодного теста для определения носителей бета-лактамазного оперона составила 43% без стимуляции продукции бета-лактамазы, при проведении теста после стимуляции пенициллином чувствительность повышалась до 66%. Специфичность йодного теста, при определении носителей бета-лактамазного оперона без стимуляции пенициллином составила 100%, а при стимуляции — 75%. Существенного различия распространённости генов бета-лактамазного опреона среди изолятов, у которых выявлена бета-лактамазная активность, и изолятов, у которых бета-лактамазная активность отсутствовала, установлено не было, как при проведении йодного теста без стимуляции (2=2,893, />=0,089), так и после стимуляции продукции бета-лактамаз (х2=2,813, /=0,094).
На основании диско-диффузионного теста установлено, что 50 (61,73%) изолятов М88Л устойчивы к пенициллину. Чувствительность йодного теста для определения устойчивых к пенициллину изолятов составила 61% при исследовании без стимуляции и 86% при исследовании после стимуляции. Специфичность в случае исследования без стимуляции составила 90%, а после стимуляции синтеза бета-лактамазы — 73%. Устойчивые к пенициллину изоляты значительно чаще обладали бета-лактамазной активностью, выявляемой йодным тестом, чем чувствительные к пенициллину изоляты при исследовании без стимуляции (X =20,001, р < 0,001) и после стимуляции (X =29,20 р < 0,001). На рисунке представлено распространение устойчивости к пенициллину среди изолятов, у которых при проведении йодного теста выявлена бета-лактамазная активность, и изолятов, у которых бета-лактамазной активности не обнаружено (при проведении исследования с индукцией синтеза бета-лактамазы и без нее).
Носительство бета-лактамазного оперона широко распространено среди М88Л; в отдельных исследованиях он был выявлен у 90-100% исследованных изолятов в популяции. В данном исследовании частота выявления бета-лактамазного опре-она достигала 95%.
Ьета-лактамазный тест характеризовался низкой чувствительностью при определении изолятов-носителей бета-лактамазного оперона. Возможно, причиной могла быть низкая активность бета-лак-тамаз у отдельных изолятов и их недостаточно высокое накопление. При индуцировании синтеза бета-лактамазы пенициллином в течение суток чувствительность теста значительно возрастала.
Распределение значений диаметра зоны задержки при проведении диско-диффузионного теста с пенициллином среди изолятов MSSA, обладающих бета-лактамазной активностью и не обладающих ею при определении бета-лактамазной активности MSSA йодным тестом без предварительной индукции синтеза бета-лактамазы (1) и после индукции синтеза бета-лактамазы пенициллином (2). Пороговое значение зоны задержки роста 24 мм в диско-диффузионном тесте с пенициллином отмечено вертикальной чертой в соответствии с рекомендациями EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), версии 9.0 [10] (изоляты с большим значением диаметра зоны задержки роста считаются чувствительными к пенициллину)
Чувствительность йодного теста при определении изолятов М88Л, устойчивых к пенициллину, в данном исследовании была достаточно высокой и составляла 61-86% в зависимости от используемого метода подготовки изолята к проведению йодного теста. При этом без стимуляции пенициллином специфичность йодного теста достигала 90%. Проведение стимуляции продукции бета-лактамаз пенициллином в течение 24 ч повышало чувствительность теста, но снижало его специфичность в отношении определения стафилококков, устойчивых к пенициллину, до 73%. Йодный тест без проведения стимуляции или с укороченной стимуляцией может рассматриваться в качестве метода для скринингового выявления чувствительных к пенициллину М88Л непосредственно после выделения патогена, что будет способствовать сокращению сроков исследования при принятии решения о выборе антибиотикотерапии.
В настоящее время клиническая значимость стафилококковых бета-лактамаз является предметом обсуждения. Однако исследования их роли в приобретении выраженной устойчивости к пени-циллинам и цефалоспоринам I поколения при высоких концентрациях патогена в среде стимулирует развитие методов их определения для использования в клинической практике.
ВЫВОДЫ
Синтез бета-лактамаз у золотистых стафилококков является индуцибельным. Индукция синтеза бета-лактамазы при внесении в среду пенициллина способствовала повышению чувствительности идентификации изолятов-носителей бета-лактамазного оперона на 23%. Оптимизация метода с точки зрения длительности и способа индукции продукции бета-лактамазы, а также чувствительности и специфичности, позволяет рассматривать его в качестве экспресс-метода для определения бета-лактамазной активности и чувствительности к пенициллину.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Song K.H., Jung S.-I., Lee S., Park S., Kim E.S:,Park K.-H., Park W.B., Choe P.G., Kim Y.K., Kwak Y.G., Kim Y.S., Jang H.C., Kiem S., Kim H.I., Kim H.B. Inoculum effect of methi-cillin-susceptible Staphylococcus aureus against broad-spectrum beta-lactamantibiotics. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2019; 38(1):67-74.
2. Olsen J.E., Christensen H., Aarestrup F.M. Diversity and evolution of blaZ from Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Antimicrob. Chemother. 2006; 57(3): 450-460.
3. Pereira L.A., Harnett G.B., Hodge M.M., Cattell J.A., Speers D.J. Real-time PCR assay for detection of blaZ genes in Sta-phylococcus aureus clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(4): 1259-1261.
4. Ruegg P.L., L Oliveira L., Jin W., Okwumabua O. Phenotypic antimicrobial susceptibility and occurrence of selected resistance genes in gram-positive mastitis pathogens isolated from Wisconsin dairy cows. J. Dairy Sci. 2015; 98(7):4521-4534.
5. Vento T.J., Calvano T.P., Cole D.W., Mende K, Rini E.A., Tully C.C., Landrum M.L., Zera W., Guymon C.H., Yu X., Beckius M.L., Cheatle K.A., Murray C.K. Staphylococcus aureus colonization of healthy military service members in the United States and Afghanistan. BMC Infect. Dis. 2013; 13:325.
6. Kaase M., Lenga S., Friedrich S., Szabados F., Sakinc T., Kleine B., Gatermann S.G. Comparison of phenotypic methods for penicillinase detection in Staphylococcus aureus. Clin. Microbiol. Infect. 2008; 14(6):614-616.
7. Jagad B.P., Vakanee A. Comparison of three different methods to detect the production of ß-lactamase enzyme by Sta-
phylococci. International Journal of Biomedical and Advance Research. 2017; 8(1):01-03.
8. Al-HammadiA.T.Y. Comparative study of two beta-lactamase test methods in five different microorganisms isolated from Azadi Hospital in Kirkuk. Iraq International Journal of Scientific and Research Publications. 2016; 6(10):2250-3153.
9. Bidya S., Suman R.S. Comparative Study of Three в Lacta-mase Test Methods in Staphylococcus aureus Isolated from Two Nepalese Hospitals. Open Journal of Clinical Diagnostics. 2014; 4:47-52.
10. EUCAST. 2015. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 9.0, valid from 2019-0101. http://www.eucast.org. Accessed 30/11/2019.
Поступила 23 марта 2020 г.
IODINE TEST FOR EXPRESS ESTIMATION OF BETA-LACTAMASE ACTIVITY IN ISOLATES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS
© Authors, 2020 A.N. Vaganova
Ph.D. (Biol), Research Scientist, Laboratory of Molecular Biological Technologies,
Institut Pasteur in Saint-Petersburg for Research in Epidemiology and Microbiology,
Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Saint Petersburg)
E-mail: van.inprogress@gmail.com
M.V. Micheeva
Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Biological Technologies,
Institut Pasteur in Saint-Petersburg for Research in Epidemiology and Microbiology,
Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Saint Petersburg)
E.V. Nesterova
Bacteriologist, Clinical Diagnostic Laboratory, City Skin and Veneral Diseases Dispensary (Saint Petersburg) N.N. Trofimova
Bacteriologist, Clinical Diagnostic Laboratory, City Skin and Veneral Diseases Dispensary(Saint Petersburg) I.V. Litvinenko
Head of Clinical Diagnostic Laboratory, City Skin and Veneral Diseases Dispensary(Saint Petersburg) Y.G. Petunova
Ph.D. (Med.), City Skin and Veneral Diseases Dispensary(Saint Petersburg) V.N. Verbov
Ph.D. (Chem.), Institut Pasteur in Saint-Petersburg for Research in Epidemiology and Microbiology, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Saint Petersburg)
Background. Beta-lactamases are widely spreadin methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) isolates and confer this pathogen spenicillin-resistance. At the same time 50% of isolates that are penicillin-susceptible in disk diffusion test are beta-lactamase producers. Antibiotic resistance evaluation is time-consumin gand prolongs the process of adequate treatment prescribing. So the introduction of express-tests for antibiotic resistance evaluation is an actual problem.
The aim of this study. The estimation of iodine test sensitivity for penicillin susceptibility and potential beta-lactamase activity in staphylococci (i.e. isolates with beta-lactamase operon in their genomes).
Materials and methods. Beta-lactamase activity of 81 MSSA clinical isolates was evaluated by iodine test with preliminary stimulation of beta-lactamase production and without it. To estimate the sensitivity and specificity of this method for identification of penicillin-resistant isolates and potential beta-lactamase producers the results of the iodine test were compared with the data about beta-lactamase operon presence in isolates genomes recived in real-time PCR and statements of penicillin-resistance in disk diffusion test. Results. Iodine test was highly sensitive for identification penicillin-susceptible MSSA isolates. The sensitivity of iodine test for penicillin-resistant is olates was 61% if the test was formed without preliminary stimulation or 86% if the test was performed after stimulation. In the same time iodine test was low-sensitive for isolates that contain beta-lactamase operon in their genomes identification, the iodine test sensitivity in this case was less than 63%. So iodine test without preliminary stimulation maybe regarded as possible screening method for penicillin-susceptible MSSA identification immediately after pathogen isolation, that will be helpful to decrease the time-loss for decision making in antibiotic treatment choose.
Conclusion. Despite the low sensitivity of iodine test for identification of beta-lactamase operon containing MSSA, this method is attractive for fast identification of penicillin-resistance in S. aureus.
Key words: Staphylococcus aureus, beta-lactamase, antibiotic resistance, diagnosis.
For citation: Vaganova A.N., Micheeva M.V., Nesterova E.V., Trofimova N.N., Litvinenko I.V., Petunova Y.G., Verbov V.N. Iodine test for express estimation of beta-lactamase activity in isolates of Staphylococcus aureus. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(7):35-39. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-07-06
