CC BY
13
УДК 616.379-008.64:616 ББК 56.12
ОЦЕНКА БЛЕББИНГ-ФЕНОМЕНА КАК МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ
ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПОЛИНЕЙРОПАТИИ
КОНДРАТЬЕВА Т.С., БАБИНЦЕВА А.Ю. ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: tanya.kondratva@yandex.ru
Аннотация
Статья посвящена вопросам диагностики полинейропатии диабетического генеза. Исследован блеббинг-феномен у лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови у 60 пациентов, в том числе у 30 пациентов с диабетической полинейропатией. Показано, что данный феномен коррелирует со степенью тяжести диабетической полинейропатии.
Ключевые слова: блеббинг, диабетическая полинейропатия, диагностика.
Актуальность. В последние годы во всем мире, в том числе и в России, сахарный диабет признан одним из наиболее значимых заболеваний, и входит в тройку лидеров среди причин смертности. СД - одно из самых распространенных заболеваний, которым страдает 10-15% населения экономически развитых стран, при этом число больных удваивается каждые 10-15 лет [5]. Одним из наиболее тяжелых и распространенных осложнений данного заболевания, которое не всегда своевременно диагностируется, характеризуется выраженной болевой симптоматикой, рядом тяжелых клинических нарушений ранней инвалидизацией и значительным ухудшением качества жизни больных, является диабетическая
полинейропатия (ДИН) [1, 2, 3]. Она входит в классическую триаду поздних осложнений сахарного диабета: диабетическая ретинопатия, нефропатия и ДИН. Лечение сахарного диабета в последние десятилетия благодаря успехам в эндокринологии вышло на новый уровень. Новые препараты инсулина значительно увеличили продолжительность жизни больных, но в то же время выросло число поздних осложнений сахарного диабета, в том числе ДИН [5].
Ио данным разных исследователей, ДИН в различные сроки развивается практически у всех больных сахарным диабетом, частота ее варьирует в больших пределах, на долю ДИН приходится 30% всех случаев полинейропатии. Отмечена четкая корреляция между наличием и выраженностью болевой ДИН и длительностью сахарного диабета [6, 9]. Частота выявления
ДИН напрямую связана с диагностическими критериями, используемыми в различных популяционных исследованиях. В отдельных исследованиях частота ДИН, диагностируемой при электронейромиографии, достигала 90100%. До 50% пациентов имеют бессимптомную форму ДИН, а болевой синдром при этой полинейропатии встречается примерно в 10-20% случаев и относится к наиболее мучительным проявлениям заболевания. В 2006 г. М. Davies и соавт. опубликовали результаты исследования, в котором жалобы на болезненные ощущения предъявляли 64% пациентов, при этом только у 19% из них выявлена "истинная" болевая ДИН [5].
Диабетическая полинейропатия - болезнь, характеризующаяся прогрессирующей гибелью нервных волокон, приводящей к потере чувствительности и развитию язв стопы (ВОЗ). Иовреждение нервных волокон при нарушениях углеводного обмена может происходить задолго до появления клинической симптоматики, что значительно затрудняет своевременную диагностику ДИН и проведение лечебно-профилактических мероприятий [7].
Для начальных стадий развития ДИН характерно снижение болевой, температурной, вибрационной чувствительности, что сменяется полной анестезией в развернутой стадии болезни. Диагностика полинейропатии включает неврологический осмотр с определением всех видов чувствительности в конечностях, выполнение инструментальных методов диагностики и др. Для определения степени тяжести симптомов полинейропатии разработан ряд диагностических шкал,
основанных на количественной оценке выраженности симптомов. Для оценки нарушений тактильной чувствительности в клинической практике применяют
монофиламент весом 10 г (5,07 SemmensWeinstein), создающий различное давление на коже. Болевая чувствительность при ДПН проверяется нанесением серии
последовательных уколов специальной иглой с притупленным концом. Оценка температурной чувствительности возможна при помощи инструмента "Tip-therm", когда производится поочередное прикосновение его холодной и теплой частями к различным участкам кожи конечностей. Для выявления нарушений моторной функции исследуют ахилловы и коленные рефлексы. Вибрационную чувствительность в дистальных отделах конечностей определяют неврологическим камертоном (128 Hz). Большую практическую значимость в ранней диагностике ДПН имеют инструментальные методы исследования. Среди них наиболее информативным и доступным является электронейромиографическое
исследование (ЭНМГ). Стандартный протокол обследования включает определение скорости проведения импульса по двигательным и чувствительным волокнам нервов конечностей в дистальных и проксимальных отделах; регистрацию амплитуды моторных и сенсорных ответов нервов с мышц кистей и стоп. На ранней стадии заболевания характерно нарушение проводящей функции сенсорных нервов нижних конечностей, что подтверждается снижением или отсутствием ответа с икроножного нерва при проведении ЭНМГ-исследования. В то же время моторные нервы могут длительно оставаться интактными, однако по мере развития процесса возникают изменения проводящей функции малоберцовых, а затем большеберцовых нервов. Изменения могут быть разнообразными, но чаще всего при ЭНМГ регистрируется умеренное снижение СРВ (до 36-38 м/с) [8].
Блеббинг - универсальный биологический феномен, одно из основных начальных проявлений морфологического повреждения клетки (в том числе при апоптозе и некрозе), вызванного гипоксией, интоксикацией, действием вирусов, но не приводящего к клеточной гибели. Блеббинг плазматической мембраны - потенциально обратимое состоянии, развивается как при физиологической стимуляции некоторых видов
клеток, так и при повреждении многих видов клеток [10]. Он проявляется образованием на клеточной поверхности пузыреподобных выпячивай, в генезе которых: нарушение мембран-цитотоксических взаимодействий, примембранный энергетический и ионный дисбаланс, окислительный стресс, активация ряда сигнальных каскадных внутриклеточных путей [4, 11, 12].
Актуальной задачей является установление ДПН на доклинической стадии до появления симптомов, указывающих на повреждение периферических нервов: расстройств чувствительности, появление спонтанной боли, парестезии, дизестезии, гипералгезии, гиперестезии и др. Диагностика ранней стадии развития ДПН позволит своевременно провести лечение и предотвратить прогрессирование этого осложнения сахарного диабета. В качестве ранней диагностики стадии ДПН нами предложено исследование блеббинг-феномена.
Цель работы. Разработка доступного метода диагностики степени тяжести диабетической полинейропатии путем оценки блеббинг-феномена.
Материалы и методы. В ходе проделанной работы обследовано 60 пациентов. Участники исследования были разделены на две группы: п1 - пациенты с нарушением углеводного обмена с известной степенью тяжести диабетической полинейропатии, которая была оценена с помощью шкалы NCI-CTCAE (30 человек: 17 мужчин и 13 женщин), п2 - группа сравнения (30 человек: 12 мужчин и 18 женщин). Средний возраст в группе п1 составил 47,7±9,7, а в группе п2 - 48,2±8,7. В условиях процедурного кабинета, соблюдая правила асептики и антисептики, проводился забор венозной крови из кубитальной вены в объеме 5,0-10,0 мл, в стерильные пробирки, с добавлением антикоагулянта (гепарина), предварительно перед процедурой получено письменное согласие каждого участника исследования.
Полученную кровь в количестве 0,02 мкл смешивали с 3 мл 0,9% раствора ШО с добавлением 0,02 мкл 1% раствора метиленовой сини. Далее из полученного разведения капиллярной пипеткой забиралось 0,02 мкл суспензии клеток, которые помещались в центр рабочей зоны ячейки между электродами. Затем аккуратно помещалось покровное стекло над рабочей зоной, предварительно оперев его вначале ребром на один из электродов для образования клиновидного зазора между ним и
ячейкой, а затем опустив его. После такой манипуляции клеточная суспензия
распределялась на всю площадь рабочей зоны, смочив электроды. Далее мы убеждались в отсутствии пузырей в рабочей зоне ячейки и располагали покровное стекло пинцетом симметрично относительно всех электродов, а затем осторожно и одновременно прижимали края этого стекла к используемой паре электродов для удаления лишней жидкости из рабочей зоны. Далее включали исполнительный блок "Цито-Эксперт" (Регистрационное удостоверение РФ от 14.06.2005 №ФС 022а2005/1744-05; Сертификат соответствия №РОСС RU ME67 H00362 Код ОК 005 (ОКП) 94 43 50 №0580729) с цифровым окуляром Webbers My scope 130 M и объективом х10, с частотой 0,25 Гц и напряжением 28 В на электродах электрофоретической камеры. Заправленную электрофоретическую камеру располагали на столике микроскопа так, чтобы объектив
На основе вышеприведённых таблиц, мы построили соответствующие диаграммы для наглядности динамики процесса.
Анализ блеббинга лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови, возникающего в результате их активации, установил отчетливую корреляцию в зависимости от степени тяжести диабетической полинейропатии. Значимое уменьшение числа интактных клеток и увеличение клеток с проявлениями начального блеббинга было обнаружено даже при I степени тяжести заболевания. Максимальная степень
находился над центром рабочей зоны, после чего, фокусировали объектив микроскопа на лимфоцитах и нейтрофилах. Далее проводилась фотофиксация исследуемого объекта в память компьютера, затем полученная фотография обрабатывалась специализированной
программой NTUComplex v2.0 с автоматической выдачей отчета. Оценивался диаметр пузыревидного выпячивания в мкм.
Исходя из полученных данных была выдвинута шкала морфологических изменений мембраны лимфоцитов и нейтрофилов: 1) интактные клетки (с визуально неизмененной плазматической мембраной; круглой, ровной поверхностью); 2) клетки в состоянии начального блеббинга (мелкие везикулы на мембране - до 1/3 радиуса клетки); 3) клетки в состоянии терминального блеббинга (крупные пузыри мембраны - более 1/3 радиуса клетки).
Результаты исследования. Полученные данные представлены в виде таблиц.
Таблица 2
выраженности терминального блеббинга исследуемых клеток периферической крови выявлена у пациентов с IV степенью тяжести диабетической полинейропатии.
Выводы. Таким образом, можно отметить, чем выше степень тяжести диабетической полинейропатии, тем больше изменений со стороны мембраны, как нейтрофилов, так и лимфоцитов: наблюдается увеличение пузыревидных выпячиваний относительно радиуса клетки. Также можно отметить, что наблюдается тенденция к увеличению клеток в состоянии блеббинга. Также стоит Количество
Таблица 1
Количество лимфоцитов, находящихся в состоянии блеббинга в периферической крови_
Параметры исследования Среднее количество клеток
I степень тяжести II степень тяжести III степень тяжести IV степень тяжести Группа сравнения
Начальный блеббинг 11±1,2 р<0,01 11±1,3р<0,01 9±0,7р<0,01 7±0,6р<0,01 2±0,1 р<0,01
Терминальный блеббинг 3±р0,3 <0,01 5±0,4р<0,01 9±0,6р<0,01 11±0,9р<0,01 2±0,3 р<0,01
Интактные клетки 6±0,5 р<0,01 4±0,1р<0,01 2±0,1р<0,01 2±0,1р<0,01 16±2,1 р<0,01
Количество нейтрофилов, находящихся в состоянии блеббинга в периферической крови
Параметры Среднее количество клеток
исследования I степень тяжести II степень III степень IV степень Группа
тяжести тяжести тяжести сравнения
Начальный блеббинг 4±0,3р<0,01 5±0,9р<0,01 7±1,3р<0,01 6±1р<0,01 3±0,4 р<0,01
Терминальный блеббинг 4±0,2р<0,01 6±1,1р<0,01 8±1,5р<0,01 11±1,7р<0,01 2±0,3 р<0,01
Интактные клетки 12±1,3р<0,01 9±1р<0,01 5±0,9р<0,01 3±0,5р<0,01 15±0,8 р<0,01
интактных клеток значительно выше в группе сравнения.
100% 80% 60% 40% 20% 0%
15
55%
30%
25%
55%
20%
45%
45%
10%
0%
А* A* A* A*
J' л?> J* J?
^ ^ ^ ^
sp sp sp sp <3?
ч</ ^ ч</ ^ * ^ V*
■ Терминальный блеббинг
■ Начальный блеббинг
■ Интактные клетки
100% 80%% 60%% 40% 20% 0%
хФ хФ хФ X* jfr
J" ,е>с ¿Г
^ ^ ^ а*
jy jf jy jy d)
чс/ ч</ чс/
^ * V*
Терминальный блеббинг Начальный блеббинг I Интактные клетки
Рис. 1. Процентное соотношение лимфоцитов, находящихся в состоянии начального и терминального блеббинга, и интактных клеток в периферической крови.
Таким образом, выраженность степени блеббинга цитоплазматической мембраны коррелирует с состоянием тяжести пациентов с диабетической полинейропатией.
Рис. 2. Процентное соотношение лимфоцитов, находящихся в состоянии начального и терминального блеббинга, и интактных клеток в периферической крови.
Мы считаем, что регистрация степени блеббинга цитоплазматической мембраны лимфоцитов и нейтрофилов может быть рекомендована в клиническую практику в качестве экспресс-метода оценки тяжести состояния диабетической полинейропатии.
Список литературы
1. Азизова Р.Б. Эффективность метилкобаламина в метаболической терапии диабетической полинейропатии / Р.Б. Азизова, Д.Г. Охунова //Международный неврологический журнал. - 2018. - №4. - С. 27-29.
2. Анисимова Е.И. Нейропатический болевой синдром: клинико-нейрофизиологический анализ/ Е.И. Анисимова, А.Б. Данилов //Неврологический журнал. - 2003. - №10. - С. 15-22.
3. Болотова Н.В. Особенности течения и терапии периферической полинейропатии при сахарном диабете 1-го типа у детей /Н.В. Болотова, С.В. Худошина //Лечащий врач. - 2007. - №10. - 84-86
4. Механизмы развития эндотелиальной дисфункции у детей с различной активностью ювенильных артритов/ Е.Ю. Емельянчик [и др.] //Российский педиатрический журнал. - 2012. - №4. - С. 14-18.
5. Нестрова М.В. Патогенез, классификация, клиника и лечение диабетической полинейропатии /М.В. Нестерова, В.В. Галкин //Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. - 2013. - С. 97-105.
6. Синдром диабетической стопы: клиника, диагностика, лечение и профилактика /И.И. Дедов [и др.]. - М. - 1998. - 138 с.
7. Филимонова Т.А. Возможности лабораторной диагностики субклинической стадии диабетической полинейропатии / Т.А. Филимонова // Тезисы всероссийской молодежной медицинской конференции с международным участием "Алмазовские чтения -2018" 16-18 мая 2018 года - "Фонд Алмазова", 2018. - С. 358.
8. Ярец Ю.И. Нейроспецифические белки крови в диагностике доклинических форм диабетической дистальной полинейропатии. /Ю.И. Ярец, А.Б. Малков //Проблемы здоровья и экологии. - 2018. - С. 60-66.
9. Can motor nerve conduction velocity predict foot problems in diabetic neuropathy over a 6-year outcome period? /A.L. Carrington [et all.] //Diabet Care. - 2010. - №5. - P. 45-47.
10. Hagmann J. Regulation of plasma membrane blebbing by the cytoskeleton / J. Hagmann, M.M. Burger, D. Dagan // J. Cell Biochem. - 1999. - №73. - p. 488-499.
11. Involvement of p38 in apoptosis-associated membrane blebbing and nuclear condensation /Deschesnes R. G. [et all.] //Mol. Biol. Cell. - 2001. - №12 - p. 1569-1582.
12. Leukocyte apoptosis and its signif cance in sepsis and shock / Wesche D.E. [et all.] // J. Leukoc. Biol. - 2005. - V. 78. - P. 325-337.
ESTIMATION OF BLEBBING-PHENOMENA AS A METHOD OF DIAGNOSTIC DEGREE OF
DIABETIC POLYNEUROPATHY
KONDRAT'EVA T.S., BABINCEVA A.U. FSBEI HE I.P. Pavlov SPbSMUMOH Russia, Saint-Petersburg, Russia e-mail: tanya.kondratva@yandex.ru
Abstract
The article is devoted to the diagnosis of diabetic polyneuropathy. The blebbing phenomenon in lymphocytes and neutrophils in peripheral blood was studied in 60 patients, including 30 patients with diabetic polyneuropathy. This phenomenon has been shown to correlate with the severity of diabetic polyneuropathy.
Keywords: blebbing, diabetic polyneuropathy, diagnostics.
