CC BY
41
МИКОЛОГИЯ И АЛЬГОЛОГИЯ
УДК 582.263
ОЦЕНКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА И УТОЧНЕНИЕ
ТАКСОНОМИЧЕСКОГО СТАТУСА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ РОДА PARIETOCHLORIS (TREBOUXIOPHYCEAE) КОЛЛЕКЦИИ CALU
К.А. Шибзухова1'*, О.В. Гаврилова2, О.Б. Чивкунова1, Р.А. Сидоров3, А.Е. Соловченко1, Е.С. Лобакова1
1 Кафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2кафедра микробиологии, биологический факультет, Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7—9;
3лаборатория липидного обмена, Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, Россия, 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 35 *e-mail: karina_shibzuhova@rambler.ru
Проведены морфологическое, биохимическое и молекулярно-генетическое исследования зелёных микроводорослей из коллекции цианобактерий, водорослей и паразитов водорослей Санкт-Петербургского государственного университета (CALU), предположительно принадлежащих к роду Parietochloris, с целью оценки биотехнологического потенциала и уточнения филогенетического положения. Определено, что исследованные штаммы имеют близкое родство к двум родам из разных классов — Lobosphaera (Trebouxiaceae) и Deasonia (Actinochloridaceae) — и могут представлять биотехнологический интерес в качестве продуцентов ценных полиненасыщенных жирных кислот, в особенности арахидоновой, линолевой и а-линоленовой.
Ключевые слова: зелёные микроводоросли, Parietochloris, Lobosphaera, Deasonia, арахи-доновая кислота, молекулярная идентификация
В последние годы наблюдается рост интереса исследователей к микроводорослям (МВ) близкородственных родов Parietochloris и Lobosphaera, обусловленный их способностью накапливать рекордные количества ю6-полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), таких как докозагексаеновая (ДГК, C22:6), эйкозапентаеновая (ЭПК, C20:5) и, в особенности, арахидоновая (АК, C20:4). Последняя играет одну из ключевых ролей в синтезе важной группы биогенных физиологически активных веществ, эйко-заноидов, в организме человека [1]. Накопление в клетках МВ жирных кислот (ЖК) регулируется целым рядом факторов окружающей среды и является, как правило, стрессовым для их роста. В качестве стрессовых факторов выступают изменения элементного состава минерального питания (в частности, дефицит азота в питательной среде), низкая температура и высокая интенсивность освещения [2]. Характер ответа МВ на стрессовые факторы и накопления в их клетках ПНЖК, как правило, являются штамм-специфичными.
Зелёная МВ Parietochloris incisa (H. Reisigl) S.Watanabe на сегодняшний день представляет собой богатейший природный растительный источник АК [2]. В связи с этим продолжается поиск новых штаммов МВ данного вида в природе и существующих коллекциях, а также подбор условий их культивирования для достижения максимального выхода АК [3].
Систематическое положение МВ данного вида в последнее время подвергается ревизии из-за противоречий между результатами молекулярной идентификации и литературных данных по таксономии [3].
В этой связи целью данной работы было уточнение таксономического статуса и оценка биотехнологического потенциала штаммов МВ, предположительно относящихся к роду Parietochloris, из коллекции цианобактерий, водорослей и паразитов водорослей Санкт-Петербургского государственного университета (CALU).
Материалы и методы исследования
Культуры шести штаммов зелёных МВ рода Parietochloris из коллекции CALU были предоставлены ресурсным центром "Культивирование микроорганизмов" научного парка Санкт-Петербургского государственного университета. Штаммы P. pseudo-alveolaris (Deason et Bold) CALU 924 и CALU 925 были выделены из почвенных проб Дальнего Востока России, штаммы Parietochloris sp. CALU 934 и 1488 — из почвенных проб берега озера в посёлке Гвардейское (Ленинградская область, Россия), штаммы P. bilobata (Vinatzer) V Andr. comb. nov. CALU 1497 и CALU 855 — из почвенных проб разнотравного луга (Овручский район, Житомирская область, Украина).
Альгологически чистые культуры МВ выращивали в конических колбах Эрленмейера на азот-
содержащей (N+) и безазотной (N-) средах Громова [4] при температурах +22°C и +10°C при постоянном освещении белым светом 40 мкмоль квантов ФАР/м2 • с в течение 7 сут (ФАР — фото-синтетически активная радиация). Культивирование при низкой температуре и отсутствии в среде культивирования азота моделировало рост МВ в условиях стресса.
Спектры поглощения суспензий и экстрактов пигментов регистрировали на спектрофотометре Agilent Cary 300 UV-Vis (Agilent Technologies, США). Жирнокислотный состав суммарных липидов анализировали методом газовой хроматографии масс-спектрометрии с использованием газового хроматографа Agilent 7890A (Agilent Technologies, США), соединенного с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5975C (Agilent Technologies, США) [5]. Относительное содержание ЖК определяли в весовых процентах (вес.%) от суммарного содержания в пробе, коэффициент ненасыщенности ЖК определяли как описано ранее [6]. Коэффициент ненасыщенности ЖК рассчитывали по формуле:
К = VUFAfLSFA,
где К — коэффициент ненасыщенности, YUFA — суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот (вес.%), 1,SFA — суммарное содержание насыщенных жирных кислот (вес.%) в пробе.
Молекулярно-генетическую идентификацию проводили путём анализа нуклеотидной последовательности фрагмента ядерного рибосомального кластера генов, включающего последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2, а также ген 5.8S рРНК, с использованием праймеров NS1 и ITS2 [7]. Поиск ближайших гомологов полученных последовательностей проводили в базе данных NCBI GeneBank с помощью программы BLAST [8]. Построение филогенетических деревьев осуществляли при помощи алгоритма ближайших соседей (NJ) [9]. Достоверность топологии оценивалась при помощи bootstrap-теста (1 000 повторностей) [10].
Подготовка и исследование образцов с помощью растрового (сканирующего) и просвечивающего (трансмиссионного) микроскопов проводили согласно модифицированной методике, описанной ранее [11].
Результаты и обсуждение
Исследованные штаммы МВ были представлены в основном неподвижными одиночными сферическими вегетативными клетками диаметром 4-10 |m (CALU 924), 2-15 |m (CALU 925), 7-14 |m (CALU 1497 и CALU 855), до 20 |m (CALU 934 и CALU 1488). В жизненном цикле большинства штаммов выявлены подвижные зооспоры с двумя изоконтными жгутиками на апикальном конце клетки и неподвижные автоспорангии,
содержащие в среднем восемь дочерних клеток. Исключением был штамм CALU 934, у которого основная жизненная форма была представлена вегетативными клетками и апланоспорами, окрашенными в зелёный и оранжевый цвет.
По данным растровой и трансмиссионной электронной микроскопии, клетки всех исследованных культур обладали толстой клеточной стенкой, состоящей, как правило, из четырёх хорошо выраженных слоёв. На её поверхности присутствовали штамм-специфичные эпиструктуры: бородавки, булавовидные выросты, тяжи. Изученные клетки МВ содержали пристенный лопастной хлоропласт, окружённый двумя мембранами и имеющий хорошо развитую систему тилакоидов в строме. У всех штаммов в хлоропластах был обнаружен крупный пиреноид с интрапиреноидными тилакоидами, окружённый крахмальными зёрнами. В цитоплазме наблюдалось накопление многочисленных липид-ных глобул.
Спектры поглощения суспензий клеток изученных культур имели характерную для зелёных МВ форму: они характеризовались наличием максимумов хлорофиллов а (678 и 438—440 нм) и Ь (плечо около 650 нм), а также плечом в диапазоне 460— 490 нм, свойственном каротиноидам.
Из спектров поглощения суспензий, компенсированных на рассеяние, следует, что присутствие азота в среде культивирования не влияло на содержание каротиноидов в клетках культуры CALU 934, тогда как в клетках штаммов CALU 924, CALU 925, CALU 1497 и CALU 855 на безазотной среде их количество возрастало. При выращивании на среде (К+) штаммы CALU 924, CALU 925, в отличие от штаммов CALU 1497 и CALU 855, были чувствительными к пониженной температуре (+10°С) и реагировали на неё снижением содержания хлоро-филлов.
У всех штаммов, за исключением CALU 934, главными ЖК в составе суммарных липидов были пальмитиновая (06:0), олеиновая (08:1), лино-левая (08:2), а-линоленовая (08:3) и арахидоно-вая кислоты. В суммарных липидах клеток всех изученных штаммов присутствовала также ЭПК, однако её доля не превышала 3 вес.%.
Состав ЖК липидов клеток МВ CALU 934 значительно отличался от такового у других изученных культур. Суммарные липиды клеток данной культуры не содержали ЖК с очень длинной цепью (рис. 1, А). Главными ЖК были ^6-кислоты (27 вес.%), из которых 17 вес.% составляла пальмитиновая, и ^д-кислоты (олеиновая, линолевая, а-линоленовая), на долю которых приходилось 72 вес.%.
У штамма CALU 924 на безазотной среде значительно увеличивалось содержание АК, достигая 33 вес.%, тогда как доля С18:3 снижалась почти втрое (с 10 до 3,5 вес.%). Снижение температуры при культивировании на азотсодержащей среде индуцировало повышение доли ^^кислот (олеи-
Рис. 1. Состав жирных кислот липидов в клетках штаммов Parietochlorispseudoalveolaris (Deason et Bold) CALU 925 (А) и Parietochloris sp. CALU 934 (Б), культивируемых на азотной (N+) и безазотной (N-) средах Громова
55
16
28 29 Г
13
23
55
91
99
99 I КТ819976.1 Trebouxia solaris voucher AV013
I KJ754240.1 Trebouxia arboricolaL 1383 -FJ626734.1 Trebouxia showmanii SAG 2009
100
KF907543.1 Trebouxia impressa voucher Herbarium Tuerk51502
JN204836.1 Trebouxia impressa voucher LOSD1165 - KC333510.1 Dictyochloropsis splendida SAG 2071 -LN610703.1 Heterochlorella luteoviridis CCAP 211/111
100
f— KM116465.1 Pabia sigriiensis SAG 2110 KM116464.1 Pabia signierisis SAG 7.90 68 i FR865753.1 Planophila sp. CCAP 462/1 KM020046.1 Lobosphaera incisa SAG 2466
100
97
KT119889.1 Lobosphaera sp. K-1
- Lobosphaera sp. CALU 1497
— Lobosphaera sp. CALU 925
70 59 L
Lobosphaera sp. CALU 924
-KC333520.1 Symbiochloris reticulata AB06.006A2
FM958480.1 Watanabea reniformis SAG 211-9b
-KC333512.1 Symbiochloris symbioritica SAG 27.81
100
100
С
KR952330.1 Vulcanochloris guanchorum voucher Lucie Vancurova A104 KR952325.1 Vulcanochloris symbiotica voucher Lucie Vancurova:A77 461- KT989923.1 Asterochioris irregularis CL101
KF907658.1 Asterochioris sp. URa15 voucher Herbarium Tuerk51477 KT989907.1 Asterochioris lobophora CL86 59 i KP318675.1 Asterochioris magna
FR865653.1 Chlorella luteoviridis CCAP 211/10E
99
r f'
Э I Kl
JQ281862.1 Bracteacoccus glacialis Broady 686 -JF717398.1 Bracteacoccus minor UTEX 66
0.05
66
66
100
-AB037089.1 Enallax acutiformis SAG 276.11
-KP726267.1 Acutodesmus obliquus KLL-G020
KP726229.1 Coelastrum pseudomicroporum KLL-G006 -GQ375097.1 Coelastrum morum SAG 2078
63
98
69
AY044648.1 Planktosphaeria gelatinosa SAG 262-1 b
-JQ259940.1 Bracteacoccus glacialis BCP-WJT36-VFNP6
-AF513378.1 Bracteacoccus sp. CNP1VF2
-AF388378.1 Radiococcus polycoccus SAG 217-1c
— KM020055.1 Deasoniasp. 14615-7
— KM020085.1 Deasonia sp. SAG 2475 —^easonia sp. CALU 934
100
72
0.005
Рис. 2. Филогенетическое положение исследованных штаммов ЬоЬояркавга эр. CALU 924, 925, 1497 (А) и Веаэоп1а эр. CALU 934 (Б) (подчёркнуты), определённое по результатам анализа участков нуклеотидной последовательности 1Т81-5.88рРНК-ГТ82
новой и цис-вакценовой) (с 12 до 20 вес.%) и незначительный рост относительного содержания С20:4 и С20:5 (на 2 и 0,5 вес.%, соответственно). Вместе с тем, отмечалось повышение коэффициента ненасыщенности от 2,17 (при +22°С на (N+) среде) до 3,00 (при +10°С на (N-) среде).
МВ CALU 925 характеризовались наибольшим по сравнению с МВ CALU 924, CALU 855 и CALU 1497, исходным количеством АК, достигающим 32 вес.% от суммарного содержания ЖК, и большим разнообразием минорных ЖК с очень длинной цепью, содержание которых не превышало 4 вес.% (рис. 1, Б). Следует отметить, что у данного штамма было выявлено низкое, по сравнению с CALU 924, CALU 855 и CALU 1497, содержание C18:3, составлявшее менее 4 вес.%. Уровень АК у штамма CALU 925 увеличивался лишь на 2 вес.% при культивировании при пониженной температуре. Отсутствие азота в среде культивирования не влияло на содержание АК. При понижении температуры отмечалось незначительное увеличение коэффициента ненасыщенности ЖК.
Изменение условий культивирования МВ CALU 1497 не влияло на содержание АК (21-25 вес.%). Для данного штамма было характерно накопление C18:1 до 30-32 вес.% на безазотной среде. Коэффициент ненасыщенности ЖК возрастал с 3,4 при культивировании на полной среде и температуре +22°С до 4,5 на безазотной среде и температуре +10°С.
Полученные в ходе молекулярно-генетических исследований данные свидетельствуют о близком родстве штаммов CALU 924 и CALU 925, идентифицированных при первичном депонировании как P. pseudoalveolaris Watanabe et Floyd, и штаммов CALU 1497 и CALU 855, определённых как P. bilo-bata V Andr. comb. nov., с МВ рода Lobosphaera (Tre-bouxiaceae), а штамма P. pseudoalveolaris Watanabe et Floyd CALU 934 с МВ рода Deasonia (Actinochlo-ridaceae). На основании сравнительного анализа
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Weber P.C., Fischer S., von Schaky C., Lorenz R., Strasser T. Dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids and eicosanoids formation in man // Health effects of polyunsaturated fatty acid in seafood's / Eds. A.P. Simopoulos, R.R. Kifer, and R.E. Martin. Orlando: Academic press, 1986. P. 227-238.
2. Solovchenko A.E., Khozin-Goldberg I., Didi-Cohen S., Cohen Z., Merzlyak M.N. Effects of light intensity and nitrogen starvation on growth, total fatty acids and arachidonic acid in the green microalga Parietochloris incisa // J. Appl. Phycol. 2008. Vol. 20. N 3. P. 245-251.
3. Dumancas G.G., Murdianti B.S., Lucas E.A. Arachidonic acid. Dietary sources and general functions. N.Y: Nova Science Publishers, 2013. 255 pp.
4. Громов Б.В., Титова Н.Н. Коллекция культур водорослей лаборатории микробиологии Биологического института Ленинградского университета (CALU) // Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Меж-
нуклеотидных последовательностей фрагмента ГТ81-5.88рРНК-ГТ82 МВ можно заключить, что все изученные штаммы, за исключением Deasonia sp. CALU 934, имеют близкое родство между собой и, вместе с тем, с МВ рода Parietochloris (рис. 2, А, Б).
Таким образом, в ходе исследования был проведён сравнительный морфологический, биохимический и молекулярно-генетический анализ шести штаммов МВ из коллекции CALU. Установлено, что как по молекулярно-генетическим, так и биохимическим данным штамм CALU 934 и CALU 1488 имеют родство с МВ рода Deasonia (Actinochlorida-ceae), тогда как МВ CALU 924, CALU 925, CALU 855 и CALU 1497 имеют близкое родство между собой и с МВ рода Lobosphaera (Trebouxiaceae). Проведена оценка биотехнологического потенциала исследованных штаммов МВ. По результатам биохимических исследований Deasonia sp. CALU 934 может представлять биотехнологический интерес как потенциальный продуцент С18-ПНЖК, в частности, линолевой и а-линоленовой кислот, а штаммы Lobosphaera sp. CALU 924 и CALU 925 — в качестве продуцентов в рекордных количествах С20-ПНЖК, в особенности АК. Особый интерес для биотехнологии может представлять штамм Lobosphaera sp. CALU 1497, как продуцент АК, не требующий создания особых условий культивирования для накопления в биомассе данной ПНЖК в значительных количествах.
Авторы выражают благодарность научному сотруднику кафедры биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, к.б.н. К.А. Чека-нову за помощь в проведении молекулярно-гене-тических исследований и обработке полученных данных.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00029) с использованием оборудования Центра коллективного пользования МГУ имени М.В. Ломоносова.
вуз. сб. / Под ред. Б.В. Громова. Л: Из-во Ленингр. ун-та, 1983. С. 3-27.
5. Solovchenko A., Khozin Goldberg I., Recht L., Boussiba S. Stress induced changes in optical properties, pigment and fatty acid content of Nannochloropsis sp.: Implications for non-destructive assay of total fatty acids // Mar. Biotechnol. 2011. Vol. 13. N 3. P. 527-535.
6. Ветчинникова Л.В., Серебрякова О.С., Ильинова М.К. Динамика содержания липидов и жирнокислотного состава отдельных фракций в женских сережках березы повислой (Betula pendula Roth) // Труды Карельского научного центра РАН. 2013. № 3. С. 74-81.
7. White T.J., Bruns T.D, Lee S.B, Taylor J.W. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA for phylogenetics // PCR protocols: a guide to methods and applications. A guide to methods and applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White. N.Y.: Academic Press, 1990. P. 315-322.
8. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. N 17. P 3389-3402.
9. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. N 4. P. 406-425.
10. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. N 4. P. 783-791.
11. Gorelova O.A., Kosevich I.A., Baulina O.I., Fedoren-ko T.A., Torshkhoeva A.Z., Lobakova E.S. Associations between the White Sea invertebrates and oxygen-evolving phototrophic microorganisms // Moscow Univ Biol. Sci. Bull. 2009. Vol. 64. N 1. P. 16-22.
Поступила в редакцию 15.05.2017 Принята в печать 15.06.2017
MYCOLOGY AND ALGOLOGY
BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL ASSESSMENT AND TAXONOMIC STATUS REFINEMENT OF MICROALGAE OF THE GENUS PARIETOCHLORIS (TREBOUXIOPHYCEAE) IN THE CALU-COLLECTION
K.A. Shibzukhova1", O.V. Gavrilova2, O.B. Chivkunova1, R.A. Sidorov3, A.E. Solovchenko1, E.S. Lobakova1
1 Department of Bioengineering, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia;
2Department of Microbiology, School of Biology, Saint Petersburg State University, Universitetskaya nab. 7—9, Saint-Petersburg, 199034, Russia;
3 Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Science, Botanicheskaya ul. 35, Moscow, 127276, Russia *email: karina_shibzuhova@rambler.ru
We have carried out morphological, biochemical, as well as molecular and genetic studies of green microalgae from the Collection of cyanobacteria, algae and algal parasites of Saint-Petersburg State University (CALU), presumably belonging to the genus Parietochloris, to assess their biotechnological potential and to refine their phylogenetic position. It was found that the investigated strains have a close relationship to two genera from different classes — Lobosphaera (Trebouxiaceae) and Deasonia (Actinochloridaceae). They can be of interest as producers of valuable polyunsaturated fatty acids, especially arachidonic, linoleic, a-linolenic.
Keywords: green microalgae, Parietochloris, Lobosphaera, Deasonia, arachidonic acid, molecular identification
Сведения об авторах
Шибзухова Карина Ахмедовна — аспирант кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-25-87; e-mail: karina_shibzuhova@rambler.ru
Гаврилова Ольга Владимировна — канд. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета СПбГУ. Тел.: 8-812-321-33-59; e-mail: avanti1958@inbox.ru
Чивкунова Ольга Борисовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-25-87; e-mail: olga.chivkunova@mail.ru Сидоров Роман Александрович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Лаборатории липидного обмена Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН. Тел.: 8-499-678-54-24; e-mail: roman.sidorov@mail.ru
Соловченко Алексей Евгеньевич — докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-25-87; e-mail: solovchenko@mail.bio.msu.ru Лобакова Елена Сергеевна — докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-25-87; e-mail: elena.lobakova@rambler.ru
